三個(gè)豬種PPARγ2基因的多態(tài)性分析

孫奴奴,王美如

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系,山西 運(yùn)城 044000)

杜長(zhǎng)大三元雜豬種是以杜洛克豬作為終端父本、長(zhǎng)白豬和大約克豬作為終端母本培育而成的商品型豬種,具有生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性好、增重快、飼料報(bào)酬高、胴體性能好、瘦肉率高、肉色好等特點(diǎn),近幾年占據(jù)著我國(guó)90%以上的商品豬市場(chǎng)[1]。晉汾白豬是一種以馬身豬、太湖豬(二花臉類群)等國(guó)內(nèi)豬種與長(zhǎng)白豬等國(guó)外豬種作為親本[2],經(jīng)過雜交培育出優(yōu)良豬種作為終端母本和以大白豬為父本培育出的國(guó)家級(jí)新型瘦肉型品種豬,具有產(chǎn)仔多、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)正式通過了國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)的審定,成為山西省首個(gè)國(guó)家級(jí)的豬新品種。新山西黑豬,亦稱山西瘦肉型豬新品系(SD-Ⅱ系),是在山西黑豬的基礎(chǔ)上,利用基因?qū)爰夹g(shù)引入外國(guó)豬種血緣,經(jīng)過10年的不斷選育而形成的新型山西地方豬種,具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)仔性能好、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、瘦肉率高、肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等品種優(yōu)勢(shì),得到了行業(yè)和社會(huì)的廣泛關(guān)注和認(rèn)可,具有良好的商業(yè)發(fā)展前景[3]。

過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是一類基因轉(zhuǎn)錄子,屬于核激素受體超家族,1990年Issemann[4]等首先發(fā)現(xiàn)該受體并進(jìn)行了命名。PPARs基因分PPARα、PPARβ/δ、PPARγ三種亞型,編碼產(chǎn)物分別有468、441、479個(gè)氨基酸殘基。PPARs包含6個(gè)區(qū)域,從氨基端到羧基端依次為A/B、C、D,以及E/F,其中A/B區(qū)為調(diào)節(jié)區(qū),通過MAPK介導(dǎo)一絲氨酸殘基磷酸化提高PPARα的受體-配體親和力,同時(shí)降低PPARγ的活性;C區(qū)是DNA結(jié)合域(DBD),PPAR通過此結(jié)構(gòu)與DNA上的過氧化物酶體增殖物激活受體反應(yīng)元件(PPRE)結(jié)合從而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄;D區(qū)是轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域,許多核內(nèi)因子與此結(jié)構(gòu)域結(jié)合后可影響PPARs的活性;E/F區(qū)是配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD),該結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄激活過程中起關(guān)鍵作用。PPARα基因在心、肝、腎等代謝活躍器官表達(dá)量較高,在脂肪和軟骨中表達(dá)量較低;PPARβ/δ基因廣泛表達(dá)于多種器官和組織;而PPARγ基因主要表達(dá)于脂肪、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[5]。

人的PPARγ2基因編碼產(chǎn)物具有多種生物學(xué)功能,PPARγ2基因與糖尿病患者肥胖[6]、脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝[7]、胰島素抵抗和糖尿病[8]等相關(guān),有時(shí)對(duì)腫瘤有雙重作用[9]。近年來,在豬PPARγ2基因方面的研究也有了一定的進(jìn)展。2012年,梁家充[10]等研究廣西巴馬小型豬PPARγ2基因第2外顯子與2型糖尿病易感性的關(guān)系,結(jié)果顯示PPARγ2基因第2外顯子19813A/G突變與廣西巴馬小型豬血清胰島素水平和糖耐受性降低有關(guān),19813AG基因型個(gè)體T2DM易感性明顯高于19813AA基因型個(gè)體。2009年,王桂英[11]等采用PCR-SSCP方法對(duì)PPARγ2基因的部分序列進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè),結(jié)果顯示,在5′調(diào)控區(qū)219 bp處和323 bp處以及exon6的147 bp處各發(fā)現(xiàn)1個(gè)A→G突變,且與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)。2013年,朱云[12]等利用PCR-RFLP方法對(duì)豬PPARγ2基因第一啟動(dòng)子Bsrl位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析,結(jié)果顯示該位點(diǎn)出現(xiàn)A/G突變,形成b、Bb和B型三種基因型,且與肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)。2016年,王順利[13]等利用PCR-SSCP方法檢測(cè)大河烏豬PPARγ2基因第2外顯子區(qū)的多態(tài)性,結(jié)果顯示該位點(diǎn)基因型均為純合AA型,并未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。

本研究以這三種豬為研究對(duì)象,采用PCR-RFLP方法對(duì)PPARγ2基因第一啟動(dòng)子Bsr1位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)與分析,為研究PPARγ2基因及其Bsr1位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)脂肪相關(guān)性狀的影響提供基礎(chǔ)材料,對(duì)豬場(chǎng)養(yǎng)殖及優(yōu)良的豬種選育等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)采用由運(yùn)城新龍豐畜牧有限公司提供的33頭杜長(zhǎng)大三元雜豬、23頭晉汾白豬及33頭新山西黑豬的耳組織作為實(shí)驗(yàn)材料,分別放入1.5 mL滅菌后的離心管中,然后向放有組織的離心管中加入75%的無水乙醇,使耳組織被完全浸沒。將離心管進(jìn)行標(biāo)號(hào),然后放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室,放于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCRmix、瓊脂糖、過硫酸銨、甘油、TEMED、甲醛等(購(gòu)自北京華越洋生物工程有限公司);引物合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);PCR擴(kuò)增儀(Thermal cycler-2720)(上海賓智生物科技公司);數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon-1600)(武漢愛斯佩科學(xué)儀器公司);DYCZ-28D雙板夾芯式垂直電泳儀,DYY-6C恒溫恒壓電泳儀(北京六一生物科技有限公司);TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取及引物合成

使用基因組DNA提取試劑盒提取豬基因組DNA;引物參考朱云[12]的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)(登錄號(hào):AJ006757),并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.2 PCR及SSCP

以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,10μL反應(yīng)體系為:DNA(0.5μL),上游引物(0.2μL),下游引物(0.2μL),2×Taq PCR Master Mix(5μL),雙蒸水(4.1μL);PCR反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95℃,5 min,94℃變性30 s,52.6℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán),72℃后延伸5 min;用限制性核酸內(nèi)切酶(Bsr 1)酶切經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物,酶切反應(yīng)體系總體積為15μL,其中PCR產(chǎn)物10μL,10×Buffer R1.5μL,雙蒸水3.5μL,Bsr 1酶0.1μL,將酶切反應(yīng)體系混勻,于37℃下放置消化4 h,然后利用3%的瓊脂糖凝膠檢測(cè),最后利用凝膠成像系統(tǒng)拍照并判別基因型。

1.3.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理

基因型結(jié)果利用PopGen 32軟件進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析,并利用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 杜長(zhǎng)大三元雜豬PPARγ2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

以杜長(zhǎng)大三元雜豬的DNA為模板,PCR擴(kuò)增PPARγ2目的基因,取2μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,結(jié)果如圖1所示:

M為BM2000+DNA maker;1—10為擴(kuò)增結(jié)果。圖1 杜長(zhǎng)大三元雜豬PPARγ2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

如圖1所示,1—10泳道為擴(kuò)增得到的杜長(zhǎng)大三元雜豬PPARγ2基因目的條帶?？梢钥闯鯠NA條帶位于250 bp與500 bp之間且靠近250 bp,符合預(yù)計(jì)的284 bp長(zhǎng)度,目的基因擴(kuò)增成功,DNA條帶明亮,未出現(xiàn)雜帶,可用于后續(xù)操作。

2.1.2 晉汾白豬PPARγ2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

以晉汾白豬的DNA為模板,PCR擴(kuò)增PPARγ2目的基因,取2μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,結(jié)果如圖2所示:

M為BM2000+DNA maker;1—10為擴(kuò)增結(jié)果。圖2 晉汾白豬PPARγ2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

如圖2所示,1—10泳道為擴(kuò)增得到的晉汾白豬PPARγ2基因目的條帶,可以看出DNA條帶位于250 bp與500 bp之間且靠近250 bp,符合預(yù)計(jì)的284 bp長(zhǎng)度,目的基因擴(kuò)增成功,DNA條帶明亮,未出現(xiàn)雜帶,可用于后續(xù)操作。

2.1.3 新山西黑豬PPARγ2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

以新山西黑豬的DNA為模板,PCR擴(kuò)增PPARγ2目的基因,取2μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,結(jié)果如圖3所示:

M為BM2000+DNA maker;1—10為擴(kuò)增結(jié)果。圖3 新山西黑豬PPARγ2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

如圖3所示,1—10泳道為擴(kuò)增得到的新山西黑豬PPARγ2基因目的條帶,可以看出DNA條帶位于250 bp與500 bp之間且靠近250bp,符合預(yù)計(jì)的284 bp長(zhǎng)度,目的基因擴(kuò)增成功,DNA條帶明亮,未出現(xiàn)雜帶,可用于后續(xù)操作。

2.2 酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 杜長(zhǎng)大三元雜豬PPARγ2基因酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

用限制性核酸內(nèi)切酶(Bsr1)對(duì)杜長(zhǎng)大三元雜豬PPARγ2基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,酶切檢測(cè)結(jié)果如圖4所示:

M為BM 2000+DNA Marker;1、4、5為Bb型;2、3、7—10為BB型;6為bb型。圖4 杜長(zhǎng)大三元雜豬PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

從圖4可知,在杜長(zhǎng)大三元雜豬中檢測(cè)到BB、bb、Bb三種基因型,表明PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)在杜長(zhǎng)大三元雜豬中存在多態(tài)性。

2.2.2 晉汾白豬PPARγ2基因酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

用限制性核酸內(nèi)切酶(Bsr1)對(duì)晉汾白豬PPARγ2基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,酶切檢測(cè)結(jié)果如圖5所示:

M為BM 2000+DNA Marker;1—9、12為BB型;10—11、13為Bb型。圖5 晉汾白豬PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

從圖5中可知,在晉汾白豬中檢測(cè)到BB、Bb兩種基因型,表明PPARγ2基因第一啟動(dòng)子Bsr1位點(diǎn)在杜長(zhǎng)大三元雜豬中存在多態(tài)性。

2.2.3 新山西黑豬PPARγ2基因酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

用限制性核酸內(nèi)切酶(Bsr1)對(duì)新山西黑豬PPARγ2基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,酶切檢測(cè)結(jié)果如圖6所示:

M為BM 2000+DNA Marker;1—10均為BB型。圖6 新山西黑豬PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

從圖6中可以看出,在新山西黑豬中只檢測(cè)到一種基因型:BB,表明PPARγ2基因第一啟動(dòng)子Bsr1位點(diǎn)在新山西黑豬中不存在多態(tài)性。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.3.1 基因型和等位基因頻率分析

采用軟件PopGen32對(duì)杜長(zhǎng)大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬的PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)的酶切分型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得出表1所示結(jié)果:

表1 三種豬PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分析結(jié)果

由表1可知,杜長(zhǎng)大三元雜豬中出現(xiàn)了BB、Bb、bb三種基因型,其中BB基因型頻率為0.6061,Bb基因型頻率為0.3636,bb基因型頻率為0.0303;晉汾白豬中出現(xiàn)了BB、Bb兩種基因型,其中BB基因型頻率為0.7826,Bb基因型頻率為0.2174;新山西黑豬中只出現(xiàn)了BB一種基因型,其基因型頻率為1.0000。結(jié)果顯示,三豬種的優(yōu)勢(shì)基因型均為BB基因型,優(yōu)勢(shì)等位基因均為B。

2.3.2 純合度、雜合度和香農(nóng)指數(shù)分析

利用軟件PopGen32對(duì)杜長(zhǎng)大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬三種豬進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析,得出表2所示結(jié)果:

表2 三種豬的群體遺傳學(xué)分析結(jié)果

由表2可知,杜長(zhǎng)大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬的純合度分別為0.6364、0.7826、1.0000,新山西黑豬的純合度高于杜長(zhǎng)大三元雜豬、晉汾白豬,說明新山西黑豬的遺傳性能相較于晉汾白豬、杜長(zhǎng)大三元雜豬更穩(wěn)定。香農(nóng)指數(shù)越高,表明多態(tài)性越豐富,杜長(zhǎng)大三元雜豬的香農(nóng)指數(shù)(0.5168)高于晉汾白豬的香農(nóng)指數(shù)(0.3438),說明杜長(zhǎng)大三元雜豬的遺傳多態(tài)性更豐富。杜長(zhǎng)大三元雜豬和晉汾白豬的P值均大于0.05(P=0.672000>0.05,P=0.604479>0.05),說明PPARγ2基因Bsr1多態(tài)性位點(diǎn)在兩豬種中均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3.3PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)基因型分布差異性分析

利用軟件SAS 8.1檢測(cè)PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)的基因型分布在杜長(zhǎng)大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬三個(gè)豬種群體中是否有差異。結(jié)果如表3所示:

表3 PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)基因型分布差異性分析

由表3可知,P值為0.0025,P<0.01,表明PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)在杜長(zhǎng)大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬三個(gè)豬種群體中基因型分布差異極顯著。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)朱云[12]等的研究可知,PPARγ2基因經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小為284 bp,在第一啟動(dòng)子區(qū)有1個(gè)Bsr1酶切位點(diǎn),可產(chǎn)生173 bp和111 bp兩個(gè)片段。本實(shí)驗(yàn)以33頭杜長(zhǎng)大三元雜豬,23頭晉汾白豬,33頭新山西黑豬為研究對(duì)象,采用PCR-RFLP方法對(duì)PPARγ2基因第一啟動(dòng)子Bsr1位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)酶切后在杜長(zhǎng)大三元雜豬中能檢測(cè)到三種基因型(BB、bb、Bb),在晉汾白豬中能檢測(cè)到兩種基因型(BB、Bb),在新山西黑豬中只能檢測(cè)到一種基因型(BB)。三豬種的優(yōu)勢(shì)基因型均為BB基因型,優(yōu)勢(shì)基因均為B等位基因。

應(yīng)用PopGen32軟件對(duì)三豬種進(jìn)行遺傳學(xué)分析,結(jié)果顯示,杜長(zhǎng)大三元雜豬和晉汾白豬的P值均大于0.05,說明PPARγ2基因的第一啟動(dòng)子Bsr1多態(tài)性位點(diǎn)在兩豬種中均符合Hardy-Weinberg平衡。應(yīng)用SAS8.1軟件對(duì)三豬種進(jìn)行卡方檢驗(yàn),結(jié)果顯示,PPARγ2基因Bsr1多態(tài)性位點(diǎn)的不同基因型在杜長(zhǎng)大三元雜豬、晉汾白豬、新山西黑豬三個(gè)豬種群體中分布差異極顯著(P=0.0025<0.01)。朱云等[12]對(duì)山豬的研究結(jié)果表明,PPARγ2基因Bsr1位點(diǎn)出現(xiàn)突變,存在b、Bb、b三種基因型,且在不同豬種中此位點(diǎn)的基因型頻率不同,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。晉汾白豬、新山西黑豬中個(gè)別基因型不出現(xiàn)的原因可能有以下兩點(diǎn):一是樣本數(shù)量太少,晉汾白豬23頭,不滿足統(tǒng)計(jì)分析樣本數(shù)量最低要求,可擴(kuò)大樣本數(shù)量。新山西黑豬33頭,雖然已經(jīng)滿足統(tǒng)計(jì)分析樣本數(shù)量最低要求,但樣本數(shù)量仍偏低;二是由于環(huán)境等原因使得PPARγ2基因在不同豬種中的遺傳穩(wěn)定性存在差異。