胡 賽,孫 成,劉素梅,賈付康,滿 云
(蚌埠學(xué)院,安徽 蚌埠 233030)
枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)迅速,營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單且在生長(zhǎng)發(fā)育后期形成含水率低、抗逆性強(qiáng)的休眠體芽孢,是制備微生物菌制劑的理想形式。枯草芽孢桿菌在添加到飼料時(shí)不僅不消耗飼料的營(yíng)養(yǎng),還能保持飼料的質(zhì)量,提高飼料利用率;進(jìn)入畜禽腸道可迅速恢復(fù)活性發(fā)揮益生菌作用;能夠產(chǎn)生許多不同活性的酶類和多種氨基酸[1-3]。目前,響應(yīng)面分析法被廣泛應(yīng)用于食品、輕工、醫(yī)藥衛(wèi)生等多方面研究領(lǐng)域。本課題通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)飼用枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行,提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵液菌密度及活菌數(shù)量[4-7],為低成本生產(chǎn)飼用枯草芽孢桿菌提供數(shù)據(jù)支撐[8]。
1.1.1 主要儀器
AB323電子天平,上海??惦娮觾x器廠;YX-24HDD手提式壓力蒸汽滅菌器,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;PWT-P42B電熱恒溫培養(yǎng)箱,合肥華德利科學(xué)器材有限公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái),上海力辰邦西儀器科技有限公司;SW-CJ-2FO紫外可見分光光度計(jì),上海博迅;DHZ-DA全溫振蕩培養(yǎng)箱,上海五相儀器儀表有限公司;DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海東麓儀器設(shè)備有限公司。
1.1.2 主要試劑與材料
葡萄糖,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨,上海盛思生化科技有限公司;酵母浸膏粉、牛肉浸膏粉,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;瓊脂粉,上海展云化工有限公司。
供試菌種:蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。
固體培養(yǎng)基[9-10]:每1 L的蒸餾水加入牛肉浸膏0.5 g、蛋白胨15 g、氯化鈉5 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g。
液體培養(yǎng)基:每1 L的蒸餾水加入牛肉浸膏0.5 g、大豆蛋白胨15 g、氯化鈉5 g、葡萄糖20 g。
1.2.1 菌種分離純化
(1)菌液準(zhǔn)備:稱取0.1 g固體菌粉溶于100 mL無菌水中,備用。
(2)平板劃線:固體培養(yǎng)基,經(jīng)過121 ℃,20 min高壓滅菌鍋高壓滅菌后冷至不燙手后,在無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行倒平板,將(2)準(zhǔn)備好的菌液,用接種環(huán)蘸取菌液進(jìn)行平板劃線,放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)24 h。
1.2.2 制備種子液[11]
取平板劃線獲得的單一菌落接種于高壓滅菌121 ℃、20 min后液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng),搖床培養(yǎng)條件為35 ℃、180 r/min、24 h。取上述菌液1 mL加入9 mL無菌水,重復(fù)上述步驟獲得三個(gè)不同濃度梯度菌液,本實(shí)驗(yàn)選擇的三個(gè)不同的稀釋倍數(shù)分別為103倍、104倍、105倍。
1.2.3 活菌計(jì)數(shù)
取不同培養(yǎng)條件下?lián)u床培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌液,進(jìn)行梯度稀釋,分別取106、107、108三個(gè)不同梯度稀釋進(jìn)行平板涂布,將涂布完成的平板用保鮮膜包裹防止染上雜菌,然后放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h,通過直接讀數(shù)法確定菌落數(shù)。
1.2.4 OD600值的測(cè)定
OD600值測(cè)定采用600 nm波長(zhǎng)下的吸光度。菌液搖床培養(yǎng)24 h,每隔3 h測(cè)一次OD600,根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間和OD600值的對(duì)應(yīng)關(guān)系,繪制菌株的生長(zhǎng)曲線,便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。
1.2.5 單因素試驗(yàn)
(1)裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響
通過改變裝液量來探究溶氧量對(duì)枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)和芽孢生成的影響。本實(shí)驗(yàn)采用250 mL錐形瓶,研究表明搖瓶不同裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)有明顯的影響,實(shí)驗(yàn)采用30 mL、50 mL、70 mL、90 mL四種不同裝液量,35 ℃、180 r/min、pH 7、接種量6%進(jìn)行搖床培養(yǎng)18 h,測(cè)定不同裝液量對(duì)搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響,篩選出最佳裝液量。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。
(2)起始pH值對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響[12]
根據(jù)OD600值確定枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)最佳起始pH值采用pH 5、pH 6、pH 7、pH 8四種不同起始pH值,35 ℃、180 r/min、裝液量50 mL、接種量6%進(jìn)行搖床培養(yǎng)18 h,測(cè)定不同起始pH值對(duì)搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響,篩選出最佳起始pH值。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。
(3)接種量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響[13]
接種量是影響發(fā)酵菌種生長(zhǎng)繁殖速度的重要因子,過多或過少都不利于發(fā)酵進(jìn)程的繼續(xù)。采用2%、4%、6%、8%四種不同接種量,35 ℃、180 r/min、裝液量50 mL、起始pH 7進(jìn)行搖床培養(yǎng)18 h,測(cè)定不同接種量對(duì)搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響,篩選出最佳接種量。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。
(4)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響
采用12 h、16 h、20 h、24 h四種不同培養(yǎng)時(shí)間35 ℃、180 r/min、裝液量50 mL、起始pH 7、接種量6%進(jìn)行搖床培養(yǎng),每隔一定時(shí)間測(cè)一次OD值同時(shí)進(jìn)行一次稀釋平板涂布,測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響,篩選出最佳培養(yǎng)時(shí)間。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。
1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)條件試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]
通過前期飼用枯草芽孢桿菌菌株菌體搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn),來篩選出對(duì)菌液生長(zhǎng)相對(duì)明顯的因素作為 Plackett-Burman試驗(yàn)的研究因子,采用design-expert-10軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。
表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表
經(jīng)分離純化獲得的菌株如圖1所示,經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)得出稀釋平板涂布最佳梯度稀釋倍數(shù)為106倍。
圖1 分離純化平板圖
不同搖瓶裝液量對(duì)飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
圖2 不同裝液量與OD600值的對(duì)應(yīng)關(guān)系
由圖2可見,隨著裝液量的增加,發(fā)酵液菌體數(shù)量先上升后下降。當(dāng)250 mL搖瓶的裝液量為50 mL時(shí),發(fā)酵液菌體OD600值最大,達(dá)到1.912。原因是液體含量越小,溶解氧系數(shù)越大。但當(dāng)液體的填充量太小,發(fā)酵過程中伴隨著水分的蒸發(fā),活菌數(shù)量相應(yīng)減少。因此,選擇的裝液量為30 mL、50 mL、70 mL裝于250 mL錐形瓶中作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三個(gè)水平。
不同起始pH值對(duì)飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
圖3 不同起始pH值與OD600值的關(guān)系
圖3可見,不同起始pH值情況下,飼用枯草芽孢桿菌OD600值變化呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì),當(dāng)初始pH值為7時(shí),發(fā)酵液菌體OD600值達(dá)到最大,OD600值為1.912。初始pH值是發(fā)酵條件優(yōu)化的重要環(huán)節(jié),適當(dāng)?shù)膒H值可以顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量,pH值偏高或偏低都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的改變,從而會(huì)影響枯草芽孢桿菌對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。不同菌種的最適起始pH值不同,因此,選擇的起始pH值為6、7、8作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三個(gè)水平。
不同接種量對(duì)飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。
圖4 不同接種量與OD600值的對(duì)應(yīng)關(guān)系
圖4可見,接種量由2%增加到6%時(shí);搖瓶培養(yǎng)18 h,發(fā)酵液菌體OD600值逐漸增大,6%時(shí)達(dá)到1.912;但當(dāng)接種量為8%時(shí),發(fā)酵液菌體數(shù)量下降,原因可能是高接種量引起溶解氧的不足,從而影響菌體的生長(zhǎng)代謝。接種量過多時(shí),會(huì)引起溶解氧的不足,從而會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng),菌株代謝產(chǎn)物的合成與積累也將受到抑制;接種量過少時(shí),會(huì)使菌體的培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng),降低發(fā)酵生產(chǎn)效率。因此,選擇的接種量為4%、6%、8%接種于250 mL錐形瓶中作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三個(gè)水平。
根據(jù) Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出顯著影響因素:裝液量(mL/mL,A)、接種量(%,B)、起始pH值(C),以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果中最大響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的各因素水平為基準(zhǔn),確定響應(yīng)面的中心點(diǎn)[15]。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)見表2在確定了最佳條件后,在此條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),并結(jié)合實(shí)際條件確定了實(shí)際的最佳條件。響應(yīng)面試驗(yàn)是基于最陡爬升試驗(yàn)所選擇的中心點(diǎn)。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3。二次模型方差分析結(jié)果表明,R-Squared的值為0.963 0>0.9,并且Adj. R2的數(shù)值與R2接近,說明擬合分析值準(zhǔn)確可靠,采用中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化是可行的。PRESS小于0.05,說明組合模型具有差異顯著性。響應(yīng)面和等高線圖如圖6~圖11所示,自變量裝液量與起始pH值對(duì)OD值的交互影響對(duì)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)和OD600的影響是顯著的。根據(jù)design-expert-10 軟件分析得出起始pH值為7、裝液量為50 mL/250 mL、接種量為6%,180 r/min搖床培養(yǎng)20 h可獲得最大活菌數(shù)2.89×109個(gè)。
表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)
表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)回歸分析
2.5.1 裝液量與接種量對(duì)OD600值的交互影響
圖5可以看出不同裝液量和搖瓶接種量的之間有顯著影響。當(dāng)起始pH值不變時(shí),隨著裝液量和搖瓶接種量的逐漸增加,枯草芽孢桿菌OD600(Y1)先上升后下降;在裝液量為50 mL左右時(shí),搖瓶接種量為6%左右時(shí),此時(shí)枯草芽孢桿菌OD600為最高。根據(jù)等高線可以分析得出,當(dāng)裝液量不變時(shí),從搖瓶接種量的變化趨勢(shì)看時(shí),可觀察到裝液量的等高線比較密集。表明裝液量相對(duì)于搖瓶接種量對(duì)OD600的影響較顯著。
圖5 裝液量與接種量相互影響的曲面圖及等高線圖
2.5.2 裝液量與起始pH值對(duì)OD600值的交互影響
圖6可以看出不同裝液量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時(shí),隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加,枯草芽孢桿菌OD600(Y1)先上升后下降;在裝液量為50 mL左右時(shí),起始pH值為7左右時(shí),此時(shí)枯草芽孢桿菌OD600為最高。根據(jù)等高線可以分析得出,當(dāng)裝液量不變時(shí),從起始pH值的變化趨勢(shì)看時(shí),可觀察到裝液量的等高線比較密集。同時(shí)起始pH值不變時(shí),從裝液量的變化趨勢(shì)可以看出起始pH值的等高線比較密集,表明裝液量和起始pH值對(duì)OD600的影響都比較顯著。
圖6 裝液量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖
2.5.3 接種量與起始pH值對(duì)OD600值的交互影響
圖7可以看出不同搖瓶接種量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時(shí),隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加,枯草芽孢桿菌OD600(Y1)先上升后下降;在接種量為6%左右時(shí),起始pH值為7左右時(shí),此時(shí)枯草芽孢桿菌OD600為最高。根據(jù)等高線可以分析得出,當(dāng)起始pH值不變時(shí),從搖瓶接種量的變化趨勢(shì)可以看出起始pH值的等高線比較密集,表明起始pH值相對(duì)于搖瓶裝液量對(duì)OD600的影響較顯著。
圖7 接種量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖
2.5.4 裝液量與接種量對(duì)活菌數(shù)交互影響
圖8可以看出不同裝液量和搖瓶接種量的之間有顯著影響。當(dāng)起始pH值不變時(shí),隨著裝液量和搖瓶接種量的逐漸增加,枯草芽孢桿菌活菌數(shù)(Y2)先上升后下降;在裝液量為50 mL左右時(shí),搖瓶接種量為6%左右時(shí),此時(shí)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為最高。根據(jù)等高線可以分析得出,當(dāng)裝液量不變時(shí),從搖瓶接種量的變化趨勢(shì)看時(shí),可觀察到裝液量的等高線比較密集。表明裝液量相對(duì)于搖瓶接種量對(duì)活菌數(shù)的影響較顯著。
圖8 裝液量與接種量相互影響的曲面圖及等高線圖
2.5.5 裝液量與起始pH值對(duì)活菌數(shù)交互影響
圖9可以看出不同裝液量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時(shí),隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加,枯草芽孢桿菌活菌數(shù)(Y2)先上升后下降;在裝液量為50 mL左右時(shí),起始pH值為7左右時(shí),此時(shí)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為最高。根據(jù)等高線可以分析得出,當(dāng)裝液量不變時(shí),從起始pH值的變化趨勢(shì)看時(shí),可觀察到裝液量的等高線比較密集。同時(shí)起始pH值不變時(shí),從裝液量的變化趨勢(shì)可以看出起始pH值的等高線比較密集,表明裝液量和起始pH值對(duì)活菌數(shù)的影響都比較顯著。
圖9 裝液量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖
2.5.6 接種量與起始pH值對(duì)活菌數(shù)交互影響
圖10可以看出不同搖瓶接種量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時(shí),隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加,枯草芽孢桿菌活菌數(shù)(Y2)先上升后下降;在接種量為6%左右時(shí),起始pH值為7左右時(shí),此時(shí)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為最高。根據(jù)等高線可以分析得出,當(dāng)起始pH值不變時(shí),從搖瓶接種量的變化趨勢(shì)可以看出起始pH值的等高線比較密集,表明起始pH值相對(duì)于搖瓶裝液量對(duì)活菌數(shù)的影響較顯著。
圖10 接種量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖
本研究采用單因素優(yōu)化確定幾種不同影響因素最佳值,然后采用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)的方法,并且利用design-expert-10 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)分析,是分析優(yōu)化飼用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的有效途徑[17]。結(jié)合搖瓶裝液量、接種量和初始pH值三個(gè)主要因素,利用響應(yīng)面法建立了芽孢桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)孢的擬合數(shù)學(xué)模型,方程如下:
以O(shè)D值為響應(yīng)值的二次方程:
以活菌數(shù)為響應(yīng)值的二次方程:
優(yōu)化后得到搖床培養(yǎng)最佳條件為:接種量6%、裝液量50 mL/250 mL、起始pH值為7、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min。此條件下獲得活菌數(shù)和OD600值為最高,活菌數(shù)達(dá)2.89×109;OD600值達(dá)1.936。本實(shí)驗(yàn)研究的飼用枯草芽孢桿菌搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化,對(duì)后續(xù)菌種保藏上架都有一定的參考價(jià)值。因此,發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化和改進(jìn)的研究還有待于進(jìn)一步開展。