噬菌體在畜禽業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

任仕航，段慧慧，杜向黨，商艷紅

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

抗生素是20 世紀(jì)科學(xué)技術(shù)史上最偉大的成就之一，拯救了無(wú)數(shù)生命。隨著抗生素的殘留問(wèn)題以及長(zhǎng)期濫用，一些對(duì)多種抗生素耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”迅速出現(xiàn)，由于新型抗生素的研發(fā)緩慢，細(xì)菌耐藥性對(duì)人類和畜禽的生命構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。 據(jù)報(bào)道，每年至少有42 萬(wàn)人死于耐藥病原體，并預(yù)計(jì)到2050 年將增加到1 000 萬(wàn)人［1］。 我國(guó)繼2016年發(fā)布《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃（2016—2020年）》 后， 為進(jìn)一步加強(qiáng)遏制微生物耐藥工作于2022 年發(fā)布了 《遏制微生物耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃（2022—2025 年）》， 在行動(dòng)計(jì)劃中多次重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)遏制微生物耐藥工作的重要性， 研發(fā)新型抗菌藥物迫在眉睫。因此，能夠治療細(xì)菌性感染的噬菌體已經(jīng)成為替代抗生素的新的研究熱點(diǎn)。

畜禽業(yè)是世界范圍內(nèi)使用多種抗生素的行業(yè)之一， 抗菌藥物殘留以及多重細(xì)菌耐藥等問(wèn)題給畜禽業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了重大挑戰(zhàn)， 噬菌體作為抗生素的替代品， 在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中具有廣闊的發(fā)展前景。 本文主要綜述噬菌體在畜禽業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展， 以期為噬菌體在畜禽業(yè)中的具體應(yīng)用提供參考。

1 噬菌體概述

噬菌體在1915 年被發(fā)現(xiàn)并引起廣泛關(guān)注，是一類可以感染細(xì)菌、真菌、放線菌以及螺旋菌等微生物的病毒統(tǒng)稱，其廣泛分布在環(huán)境中，是已知存在的最大病毒群，據(jù)估算總量可達(dá)1031個(gè)［2］。 根據(jù)噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，可以分為有尾噬菌體、無(wú)尾噬菌體以及絲狀噬菌體， 噬菌體共分為15 個(gè)科，其中96%屬于有尾噬菌體目，又可根據(jù)尾部形態(tài)結(jié)構(gòu)分為短尾噬菌體科、長(zhǎng)尾噬菌體科、肌尾噬菌體科和阿克曼噬菌體科［3］。 根據(jù)噬菌體對(duì)宿主菌的破壞過(guò)程可分為裂解性噬菌體（又稱烈性噬菌體或毒性噬菌體）和溶原性噬菌體［4］，裂解性噬菌體在Ca2+、Mg2+等二價(jià)陽(yáng)離子的作用下特異性結(jié)合吸附在細(xì)菌細(xì)胞壁上［5］，將自身遺傳物質(zhì)注入細(xì)胞后， 在宿主菌的代謝系統(tǒng)下展開(kāi)遺傳物質(zhì)復(fù)制、蛋白質(zhì)合成和子代噬菌體裝配等工作，在子代噬菌體達(dá)到一定數(shù)量后，噬菌體可以通過(guò)內(nèi)溶素、穿孔素等裂解細(xì)菌細(xì)胞膜及肽聚糖層，在細(xì)胞內(nèi)壓的作用下細(xì)菌細(xì)胞破裂，從而釋放子代噬菌體［6］。溶原性噬菌體是將自身基因組與宿主菌的DNA結(jié)合在一起，與細(xì)菌遺傳物質(zhì)共同復(fù)制［7］，當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，轉(zhuǎn)變?yōu)榱倚允删w裂解細(xì)菌。由于溶原性噬菌體可能會(huì)通過(guò)將一種細(xì)菌的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌導(dǎo)致抗生素耐藥性的發(fā)生， 甚至?xí)黾铀拗骶亩玖?，因此，溶原性噬菌體不適合直接用于治療［8］。 也有學(xué)者認(rèn)為除了這兩種經(jīng)典的噬菌體復(fù)制周期以外還存在慢性感染、 持續(xù)感染模式和偽溶原性感染等不同的感染模式［9］。

相對(duì)于傳統(tǒng)的抗菌藥物， 噬菌體的研發(fā)周期更短，投入成本更低，且具有更高的專一性、更強(qiáng)的增殖能力、更安全、更不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點(diǎn)。 噬菌體根據(jù)本身的吸附部位以及受體菌表面受體結(jié)構(gòu)的不同具有高度的宿主特異性， 使得一種噬菌體只會(huì)殺滅單一或同一亞型的致病菌［10］。 當(dāng)一個(gè)噬菌體感染一個(gè)宿主菌后，能夠分裂出大約100個(gè)子代噬菌體，可以滲透藥物不能穿透的區(qū)域［11-12］，一次給藥后連續(xù)有效，直至消滅全部宿主菌后排出體外。噬菌體療法具有很高的安全性，在噬菌體療法發(fā)展的百年歷史以來(lái)，已被應(yīng)用于多種人類細(xì)菌性疾病，其中包括對(duì)呼吸道內(nèi)科疾病的治療［13］。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生對(duì)抗的突變頻率為10-5，對(duì)噬菌體產(chǎn)生對(duì)抗的突變頻率為10-7［14］，細(xì)菌會(huì)通過(guò)成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR相關(guān)蛋白系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵， 同時(shí)噬菌體也能夠進(jìn)化出相應(yīng)的機(jī)制如表達(dá)anti-CRISPR 蛋白來(lái)對(duì)抗細(xì)菌的耐受性［15］。 可以說(shuō)相比于抗生素對(duì)機(jī)體的作用，噬菌體對(duì)機(jī)體來(lái)講是一種“活藥”，在細(xì)菌與噬菌體相互作用時(shí)可以實(shí)現(xiàn)共同進(jìn)化。

2 噬菌體在畜禽疾病治療中的應(yīng)用研究

噬菌體療法是將篩選、 純化和富集特定宿主致病菌的專屬烈性噬菌體添加到被致病菌污染的介質(zhì)中定向侵染并殺滅致病菌［16］。 事實(shí)上，早在20 世紀(jì)20 年代發(fā)現(xiàn)噬菌體之初就開(kāi)始被用于治療細(xì)菌性感染， 在抗生素出現(xiàn)后噬菌體的研究一度被擱置，如今由于超級(jí)細(xì)菌的不斷增多，人們把目光轉(zhuǎn)移到了噬菌體療法上， 以期它能夠成為一種對(duì)抗細(xì)菌耐藥的抗生素替代療法［17］。 目前噬菌體療法已經(jīng)可以普遍應(yīng)用于防治畜禽致病性大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌等細(xì)菌感染性疾病。

2.1 大腸桿菌

禽致病性大腸桿菌可以誘發(fā)急性敗血癥、輸卵管炎、 氣囊炎等癥狀， 其病死率幾乎高達(dá)100%［18］，對(duì)畜禽業(yè)的發(fā)展造成了巨大的損失。 大腸桿菌作為革蘭陰性菌， 表面有一層較厚的莢膜多糖， 可以作為細(xì)菌的保護(hù)層使其免受來(lái)自外界的傷害， 同時(shí)可以使細(xì)菌逃避免疫系統(tǒng)的吞噬和補(bǔ)體的殺滅作用。 呂金暉等［19］從雞糞中分離出了1 株大腸桿菌裂解性噬菌體， 研究發(fā)現(xiàn)其解聚酶Dpo70 能夠特異性降解宿主菌表面的多糖， 同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在解聚酶Dpo70 的輔助作用下25%的血清對(duì)于大腸桿菌E.coli 111 的殺滅作用基本上達(dá)到了100%，這說(shuō)明噬菌體的解聚酶能夠通過(guò)降解宿主菌表面多糖來(lái)殺滅大腸桿菌。 Oliveira等［20］利用噬菌體制劑治療某雞舍的大腸桿菌感染性疾病，7 d 后死亡率明顯降低，21 d 后該雞舍的病雞徹底痊愈且無(wú)復(fù)發(fā)。 李金敏等［21］從某養(yǎng)殖場(chǎng)糞污采樣中提取到了一株大腸桿菌噬菌體Ф ECP2-1，隨后利用該噬菌體對(duì)處理過(guò)的養(yǎng)殖水體和雞糞中的宿主菌進(jìn)行防控， 殺菌率達(dá)到99%以上， 這都很好地說(shuō)明了噬菌體對(duì)于殺滅大腸桿菌具有良效。

2.2 沙門菌

沙門菌作為一種人獸共患病原菌， 在畜禽養(yǎng)殖中可導(dǎo)致多種疾病，同時(shí)也會(huì)通過(guò)污染禽蛋、肉等給人類的健康帶來(lái)威脅。 由韓國(guó)CJ CheilJedang公司研制的沙門菌噬菌體產(chǎn)品BioTector， 是首個(gè)在動(dòng)物飼料中取代抗生素， 用以防治雞傷寒及雞白痢沙門菌的噬菌體產(chǎn)品［22］。 沙門菌能夠通過(guò)垂直傳播，Henriques 等［23］將噬菌體噴灑到孵化時(shí)被沙門菌感染的蛋殼表面，與對(duì)照組相比，噴灑組中孵化的雛雞關(guān)節(jié)炎癥狀有了顯著的改善， 并且在8 d 后這些癥狀全部消失，這表明了噬菌體能夠阻斷沙門菌的垂直傳播。 Nikkhahi 等［24］利用給小鼠口服灌胃噬菌體的方法來(lái)治療沙門菌感染， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 噬菌體治療可以很好地避免小鼠被沙門菌感染， 盡管以環(huán)丙沙星為陽(yáng)性對(duì)照也有同樣的保護(hù)作用，但是小鼠的體重卻有所降低，這表明與抗生素療法相比， 噬菌體療法不僅可以治療沙門菌的感染，而且對(duì)動(dòng)物無(wú)害。

2.3 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌在環(huán)境中的分布非常廣泛，它是臨床上化膿性感染中最常見(jiàn)的致病菌之一，也是乳腺炎、關(guān)節(jié)炎和局部膿腫的主要致病菌，其中奶牛乳腺炎是阻礙奶牛業(yè)發(fā)展最常見(jiàn)的疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球患有此病的奶牛約有30%［25］。目前臨床上主要使用抗生素治療該疾病， 但是在膿腫的乳腺中金黃色葡萄球菌會(huì)形成生物被膜， 進(jìn)而影響抗生素的殺菌效果， 而噬菌體能夠利用其裂解生物被膜的作用將其殺滅。 侯忠余等［26］以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 （methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA） 為宿主菌從奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)污水中分離到1 株烈性噬菌體P65， 使用該噬菌體對(duì)宿主菌MRSA 2 和MRSA 24 處理48 h后， 宿主菌的被膜清除率分別高達(dá)91.3%和92.2%。李躍［27］在患乳腺炎的奶牛所在的污水系統(tǒng)中分離得到金黃色葡萄球菌裂解性噬菌體， 通過(guò)建立小鼠乳腺炎模型并使用該噬菌體對(duì)其治療，發(fā)現(xiàn)乳腺組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著下降， 明顯減少乳腺組織中淋巴細(xì)胞的滲出，緩解乳腺組織病變。噬菌體內(nèi)溶素是噬菌體侵染宿主菌后期所釋放的一種能夠裂解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的水解酶。 李曉妍等［28］制備了一種互穿網(wǎng)絡(luò)溫敏水凝膠，利用干態(tài)浸泡法負(fù)載金黃色葡萄球菌內(nèi)溶素Lys84 獲得載藥水凝膠IPNT-Lys84，經(jīng)過(guò)對(duì)其性能表征的測(cè)試試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與游離內(nèi)溶素相比， 負(fù)載于水凝膠中的內(nèi)溶素Lys84 擁有更長(zhǎng)的發(fā)揮作用時(shí)間， 因此，IPNT-Lys84 水凝膠能夠作為一種有前景的抗菌材料， 用于多重耐藥金黃色葡萄球菌外傷感染的防治。

3 噬菌體在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究

禁用飼料添加抗生素以來(lái)， 動(dòng)物的生長(zhǎng)生產(chǎn)性能受到明顯影響， 大量研究表明噬菌體對(duì)畜禽腸道的物理屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障的影響都會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)性能產(chǎn)生積極作用， 進(jìn)而提高家禽出欄率及優(yōu)質(zhì)肉品生產(chǎn)率［29-30］。

機(jī)體的腸道物理屏障包括黏膜上皮和腸道緊密連接等， 其中胃腸道的黏膜上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)能夠影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收， 絨毛高度與隱窩深度的比值升高則表明其消化吸收功能增強(qiáng)， 即機(jī)體的生長(zhǎng)性能好［31］。 朱樹(shù)嬌等［32］在肉雞的飲用水中加入噬菌體復(fù)合制劑，結(jié)果顯示十二指腸、空腸、回腸的絨毛都比對(duì)照組顯著增高， 隱窩深度均比對(duì)照組顯著變深，其消化吸收功能顯著增強(qiáng)。腸道上皮細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接蛋白 （ZO-1、Occludins 和Claudin-1 等）連接，而緊密連接蛋白與腸道通透性及屏障結(jié)構(gòu)密切相關(guān)［33］。 郝賀［34］從某雞場(chǎng)污水中成功分離得到了1 株長(zhǎng)尾烈性沙門菌噬菌體， 通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明噬菌體能夠阻止沙門菌對(duì)雛雞小腸絨毛的正常結(jié)構(gòu)形態(tài)損傷， 促進(jìn)十二指腸和空腸緊密連接蛋白表達(dá)， 從而抑制沙門菌對(duì)腸道的感染。 唐路瑤［35］配制噬菌體雞尾酒作為飼料添加劑飼喂肉雞， 研究發(fā)現(xiàn)飲用過(guò)噬菌體雞尾酒的肉雞腸道上皮細(xì)胞的ZO-1 和Claudin-1 蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)。黏蛋白MUC-2 是主要覆蓋于腸道表面黏液層的一種大分子糖蛋白， 可以保護(hù)和潤(rùn)滑腸道，在唐璐瑤［35］的試驗(yàn)中噬菌體雞尾酒組與抗生素組相比，肉雞空腸黏液蛋白MUC-2 的蛋白表達(dá)量顯著提高， 這說(shuō)明噬菌體能夠增強(qiáng)腸道物理及化學(xué)屏障，維護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，70%的免疫系統(tǒng)通過(guò)腸道來(lái)發(fā)揮其免疫功能， 改善腸道的微生物多樣性能夠有效降低免疫或炎癥反應(yīng)，從而防止其對(duì)生長(zhǎng)性能的影響［36］。在正常情況下，IgA、IgG、IgM 含量增多或者免疫器官指數(shù)增加都在一定程度上表明動(dòng)物免疫體系更強(qiáng)［37］。 葛龍等［38］將噬菌體加入麻雞的基礎(chǔ)飼糧中發(fā)現(xiàn)其胸腺指數(shù)、 脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)與對(duì)照組相比均有所提高，葛龍等［39］還將噬菌體制劑加入母豬的基礎(chǔ)飼糧， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種不同劑量的復(fù)合噬菌體制劑均能在合理范圍內(nèi)提高母豬的IgA、IgG 和IgM含量。Hosseindoust 等［40］和曾永娣等［41］同樣嘗試將噬菌體添加到仔豬飼糧中， 結(jié)果均表明噬菌體的添加提高了仔豬腸道中的益生菌活性， 并且也都增加了仔豬平均日增重及料重比。

4 噬菌體在畜禽產(chǎn)品生物防控中的應(yīng)用研究

畜禽產(chǎn)品在到達(dá)消費(fèi)者餐桌之前， 整個(gè)食品鏈都易受到各種有害微生物的影響， 當(dāng)前人們主要利用各種化學(xué)性的保鮮劑、 防腐劑等來(lái)最大限度避免食品被污染， 然而卻無(wú)法完全解決其造成的食品安全檢測(cè)難度高和營(yíng)養(yǎng)成分缺失等問(wèn)題。研究人員嘗試使用噬菌體在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程、 鮮奶和肉制品生產(chǎn)過(guò)程、 保藏運(yùn)輸以及銷售等不同階段進(jìn)行生物防控，并取得了一定的進(jìn)展。

肉類食品在生產(chǎn)過(guò)程中極易受到多種致病菌的污染，從而對(duì)人類的健康造成威脅，Hee 等［42］將沙門菌接種于生雞胸肉中，隨后接種混合噬菌體，結(jié)果顯示生肉中沙門菌菌量呈顯著降低的趨勢(shì)。Zhou 等［43］從養(yǎng)豬場(chǎng)污水中分離出了一株多價(jià)廣譜噬菌體EP10，在不同溫度（4 ℃和28 ℃）條件下將該噬菌體接種于受大腸桿菌與沙門菌共同污染的牛奶中， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同溫度條件下噬菌體在牛奶中都能夠有效抑菌。 噬菌體也可以用于食品加工過(guò)程和銷售期間的消毒。 加拿大麥克斯特大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)研制出了一種可以有效防止細(xì)菌污染的新型噬菌體滅菌噴霧， 該噴霧能夠被應(yīng)用于食品加工、包裝和清潔，在其表面形成一種動(dòng)態(tài)、連鎖的滅菌反應(yīng)，安全且高效［44］。 到目前為止，國(guó)外已經(jīng)批準(zhǔn)產(chǎn)生志賀樣毒素的大腸桿菌、 單核細(xì)胞增生李斯特菌和沙門菌的噬菌體等14 種噬菌體產(chǎn)品用于食物的生物防治［45］。 雖然我國(guó)在食品領(lǐng)域暫無(wú)獲批的噬菌體制劑， 但是國(guó)內(nèi)學(xué)者從未停止在食品領(lǐng)域?qū)κ删w進(jìn)行研究， 并取得了階段性進(jìn)展。Wang 等［46］從鴨子養(yǎng)殖場(chǎng)分離出了一株寬宿主譜毒性噬菌體fmb-p1，將其接種于提前注入沙門菌的鴨肉樣品中， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)噬菌體處理后的鴨肉樣品比未處理的鴨肉中的菌體含量顯著降低， 表明該噬菌體對(duì)鴨肉中的沙門菌具有極好的裂解作用。 聶若男等［47］將噬菌體作用于已接種沙門菌的牛肉，研究發(fā)現(xiàn)在4 ℃和25 ℃的溫度下沙門菌菌量都有顯著下降， 該噬菌體在食品中表現(xiàn)出了良好的抑菌效果。 在當(dāng)今提出減抗替抗的背景下，噬菌體這種新型抗菌藥物的研發(fā)，為控制食源性病原菌提供新的切入點(diǎn)，極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

5 結(jié)語(yǔ)與展望

隨著多重耐藥菌的廣泛流行， 新型抗生素的研發(fā)緩慢， 給畜禽業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了各種各樣的威脅。目前抗生素的禁用愈發(fā)普及，畜禽養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)療等方面急需新型抗生素替代制劑， 而對(duì)噬菌體的研究很好地體現(xiàn)了它在預(yù)防及治療細(xì)菌性感染疾病方面有巨大潛能，而且能夠作為飼料添加劑提高畜禽的生長(zhǎng)性能， 不僅能夠?yàn)樾笄萁】瞪L(zhǎng)提供保障， 更能滿足人們對(duì)畜禽產(chǎn)品的安全性的要求，這無(wú)疑使畜牧業(yè)的發(fā)展迎來(lái)了新的曙光。

同時(shí)，任何抗菌策略都存在利弊。噬菌體的高度宿主特異性限制了其裂解能力， 現(xiàn)有的研究表明可以通過(guò)篩選裂解譜較廣的噬菌體顆粒提高殺菌效果， 噬菌體的宿主范圍與尾絲蛋白有很強(qiáng)的相關(guān)性， 由于不同種屬的噬菌體可以相互交換尾纖維基因， 因此可以利用基因工程技術(shù)改造噬菌體，從而拓寬其宿主范圍，常見(jiàn)的應(yīng)對(duì)方法還有配制噬菌體雞尾酒來(lái)應(yīng)對(duì)細(xì)菌的混合感染， 有研究表明這種方法還能夠有效降低耐受菌出現(xiàn)的概率［48］， 雖然前文中提到噬菌體較抗生素產(chǎn)生細(xì)菌耐藥的概率極低， 但是在噬菌體對(duì)抗細(xì)菌耐藥機(jī)制的動(dòng)態(tài)過(guò)程中同樣也在影響其藥效， 有部分研究人員將目光轉(zhuǎn)移到了噬菌體裂解酶， 它是一種可特異性降解細(xì)菌表面多糖的噬菌體蛋白， 目前尚未發(fā)現(xiàn)有目標(biāo)菌株耐受裂解酶的現(xiàn)象， 說(shuō)明噬菌體裂解酶較全噬菌體療法能夠更加穩(wěn)定的發(fā)揮功效。 要想使噬菌體順利到達(dá)細(xì)菌感染部位發(fā)揮作用， 還應(yīng)該考慮到噬菌體制劑的穩(wěn)定性以及藥代動(dòng)力學(xué)， 首先在篩選時(shí)要選擇對(duì)溫度敏感性較低、耐酸耐堿度較高的噬菌體，同時(shí)要選擇適宜的材質(zhì)包裝制劑，從而提高噬菌體的穩(wěn)定性，而藥代動(dòng)力學(xué)是研究機(jī)體對(duì)藥物處置的動(dòng)態(tài)變化， 同一感染部位使用不同的給藥方式效果就會(huì)不同，噬菌體在體內(nèi)的各個(gè)部位的效價(jià)和停留時(shí)間也不同［49］，因此在應(yīng)用于臨床之前必須要根據(jù)噬菌體的藥代動(dòng)力學(xué)制定一套系統(tǒng)準(zhǔn)確的方案， 從而使其達(dá)到最好的治療效果。 已有的研究足以表明噬菌體在畜牧業(yè)發(fā)展中的優(yōu)勢(shì)性， 隨著對(duì)噬菌體研究的不斷深入以及基因工程技術(shù)的不斷成熟，相信在不久的將來(lái)， 國(guó)家能夠建立一套成熟的噬菌體商品化體系， 使這種新型抗生素替代品真正為畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康提供有力保障。