韓 玉，陳慧玲，王碩碩，梁秀婷，吳錦忠，吳巖斌*，鄭承劍

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定學(xué)教研室，上海 200433)

金線蘭屬AnoectochilusBlume 屬于蘭科Orchidodeae 頭骨蘭族 Cranichideae 斑葉蘭亞族Goodyerinae[1]，全世界有40 余種，主要分布于印度和喜馬拉雅東部、東亞、東南亞至澳大利亞以及西南太平洋島嶼等地區(qū)[2—3]。我國(guó)現(xiàn)有金線蘭屬植物約21 種[3,4]，其中金線蘭A.roxburghii分布最廣，是福建特色中藥金線蓮的基原植物，具有保肝、降血糖、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等藥理作用[5—11]。金線蘭屬植物的植株形態(tài)較相似，民間均當(dāng)作金線蓮使用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)陸續(xù)有金線蘭屬新種[3,4,12—14]、新記錄種[15—17]的報(bào)道，而金線蘭屬植物形態(tài)特征相似，不易分辨，因此同屬植物常?；煊谩Ｗ髡哂谠颇鲜“l(fā)現(xiàn)一種金線蘭屬植物，經(jīng)過(guò)形態(tài)解剖和鑒定，確定為安南金線蘭AnoectochilusannamensisLindl.，為國(guó)內(nèi)新記錄種。此外，為明確安南金線蘭的藥用價(jià)值，對(duì)金線蘭屬植物所含主要活性成分金線蓮苷含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器試劑

安南金線蘭于2019 年12 月采自云南省西雙版納傣族自治州普洱市景東彝族自治縣，憑證標(biāo)本存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源標(biāo)本館。SZ61 體視顯微鏡(日本奧林巴斯)；DFT-200 手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；AUY220 電子天平(日本島津公司)；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；EasySep?-3030 高效液相色譜儀(上海通微分析技術(shù)有限公司)；UM5800 Plus蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(上海通微分析技術(shù)有限公司)。金線蓮苷對(duì)照品(自制，純度＞98%)、goodyeroside A 對(duì)照品(自制，純度＞98%)。

1.2 方法

1.2.1 植物形態(tài)觀察

安南金線蘭移栽開(kāi)花后，對(duì)植株的形狀、大小、色澤、表面特征及質(zhì)地等性狀進(jìn)行觀察，在體視鏡下對(duì)花進(jìn)行解剖并拍照。

1.2.2 HPLC-ELSD 圖譜及含量測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件

參照文獻(xiàn)[4]色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，色譜柱ChromCore AQ-C18 (250 mm × 4.6 mm，3 μm)；流動(dòng)相：超純水(100%)，等度洗脫；流速0.5 mL·min-1；柱溫25 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器霧化溫度70 ℃，載氣流速2.5 L·min-1；進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液配制

精密稱定金線蓮苷和goodyeroside A 對(duì)照品各4 mg，使用超純水配制成1.0 mg·mL-1goodyeroside A 溶液和1.0 mg·mL-1金線蓮苷溶液，0.45 μm 濾膜過(guò)濾，得到對(duì)照品溶液。

1.2.2.3 供試品溶液制備

安南金線蘭植株60 ℃干燥后粉碎，過(guò)60 目篩，精密稱定粉末0.1 g，置于50 mL 三角瓶，加超純水20 mL，密塞，超聲提取45 min，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，得到供試品溶液。

1.2.2.4 線性關(guān)系考察

將上述制備的金線蓮苷和goodyeroside A 對(duì)照品溶液稀釋至 500 μg·mL-1、400 μg·mL-1、250 μg·mL-1、 200 μg·mL-1、 125 μg·mL-1、100 μg·mL-1，按“1.2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以金線蓮苷和goodyeroside A 對(duì)照品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)，峰面積對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“1.2.2.2” 項(xiàng)下金線蓮苷和goodyeroside A 混合對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄金線蓮苷和 goodyeroside A 的峰面積，并分別計(jì)算其RSD 值。

1.2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份安南金線蘭樣品，按“1.2.2.3”項(xiàng)制備6 份供試品溶液，按“1.2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄金線蓮苷和goodyeroside A 的峰面積，并分別計(jì)算其RSD 值。

1.2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按“1.2.2.1”項(xiàng)色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定，記錄金線蓮苷和goodyeroside A 的峰面積，并分別計(jì)算其RSD 值，考察供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性。

1.2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一安南金線蘭樣品6份，每份0.05 g，分別精密加入與樣品中測(cè)定的金線蓮苷和goodyeroside A 相當(dāng)含量的對(duì)照品，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備6 份，按“1.2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算金線蓮苷和goodyeroside A 的加樣回收率和RSD 值。

1.2.2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱定安南金線蘭樣品0.1 g，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液3 份，按“1.2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中金線蓮苷和goodyeroside A 含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 新記錄種

安南金線蘭(新擬) (圖1 A～J)

圖1 安南金線蘭植物形態(tài)特征Fig. 1 Morphology of Anoectochilus annamensis

Anoectochilus annamensisLindl. Averyanov L V in Rheedea 15(2): 83-101. 2005. Fig. 1 a-e.

陸生草本植物，植株高15～25 cm，莖直立，節(jié)上生根，具2～5 枚葉。葉片卵圓形，長(zhǎng)3～5 cm，寬2.2～3.5 cm，上面深綠色或暗紫色，具有黃白色或紅色帶有絹絲光澤的網(wǎng)紋，背面淡綠色或紫紅色，先端急尖，基部近圓形，驟狹呈柄；葉柄長(zhǎng)6～10 mm，葉柄基部擴(kuò)大成抱莖的鞘。總狀花序具2～8 朵花，長(zhǎng)7～16 cm；花序軸被短柔毛，具2～3 枚淡粉色鞘狀苞片，花苞片淡紅色，卵狀披針形，先端漸尖，具短柔毛，長(zhǎng)4～6 mm，寬2～4 mm；子房圓柱形，扭轉(zhuǎn)，被柔毛，連花梗長(zhǎng)6～10 mm，寬1～1.5 mm；花白色，倒置(唇瓣位于下方)；萼片背面被柔毛，中萼片卵圓形，長(zhǎng)約4.5 mm，寬約3.5 mm，先端急尖，與花瓣粘合呈兜狀；側(cè)萼片張開(kāi)，呈偏斜的長(zhǎng)圓狀橢圓形，長(zhǎng)7～9 mm，寬3～4 mm；花瓣近鐮刀狀，與中萼片近等長(zhǎng)；唇瓣長(zhǎng)17～20 mm，呈Y 字形，前部擴(kuò)大并2 裂，裂片條狀長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)9 mm，寬2 mm，中部收狹，其兩側(cè)各具2～5 條長(zhǎng)短不等的短流蘇；距黃綠色，長(zhǎng)約8 mm，與子房近平行，末端2 淺裂，內(nèi)側(cè)具2 枚盾狀胼胝體；蕊柱黃色，長(zhǎng)5～5.5 mm；蕊喙直立，叉狀2裂；柱頭2 個(gè)，離生，位于蕊喙基部?jī)蓚?cè)。花期4～5 月。

根據(jù)上述特征，確定其為Anoectochilus annamensisLindl.，中文名命名為安南金線蘭。

引證標(biāo)本：中國(guó)云南省西雙版納傣族自治州普洱市景東彝族自治縣常綠闊葉林山坡，沈志軍2019122601，存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源標(biāo)本館。

分布：越南[18]。中國(guó)首次記錄。

2.2 金線蓮苷含量測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系

金線蓮苷和goodyeroside A 的回歸方程分別為y=1.6721x-2.5841 (相關(guān)系數(shù)r=0.9981)和y=1.5128x-2.1405 (相關(guān)系數(shù)r=0.9977)，結(jié)果表明金線蓮苷和goodyeroside A 在100～500 μg·mL-1質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

測(cè)得金線蓮苷和goodyeroside A 峰面積的RSD值分別為2.05%和2.65%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

測(cè)得金線蓮苷和goodyeroside A 峰面積的RSD值分別為1.99%和2.24%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

測(cè)得金線蓮苷和goodyeroside A 峰面積的RSD值分別為3.44%和2.56%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

測(cè)得金線蓮苷和goodyeroside A 的平均回收率分別為97.38%和101.59%，RSD 值分別為1.38%和1.93%，表明該方法樣品的加樣回收率良好。

2.2.6 樣品含量

安南金線蘭的HPLC-ELSD 色譜圖見(jiàn)圖2。安南金線蘭中金線蓮苷和goodyeroside A 含量分別是53.34±1.21 mg·g–1和29.32±0.45 mg·g–1，金線蓮苷含量高于goodyeroside A 含量。

圖2 安南金線蘭HPLC-ELSD 色譜圖Fig. 2 HPLC-ELSD chromatogram of Anoectochilus annamensis

3 討論

安南金線蘭與麗蕾金線蘭植株形態(tài)相似[18—19]，不同的是，安南金線蘭唇瓣中部?jī)蓚?cè)各具2～5 條長(zhǎng)短不等的短流蘇，而麗蕾金線蘭唇瓣中部?jī)蓚?cè)為1～3 短的細(xì)齒，兩者區(qū)別明顯。金線蓮苷(內(nèi)酯苷類成分)是金線蘭的主要活性成分之一，在金線蘭中其含量為10%左右，具有降血糖、抗高脂血癥和抗自身免疫性肝炎等多種生物活性，goodyeroside A 是金線蓮苷的差向異構(gòu)體，卻不具以上活性。HPLC-ELSD檢測(cè)結(jié)果顯示，安南金線蘭中金線蓮苷含量高于goodyeroside A 含量。課題組前期研究顯示，麗蕾金線蘭中的內(nèi)酯苷類成分主要是goodyeroside A，含量遠(yuǎn)高于金線蓮苷[4]。因此，通過(guò)金線蓮苷和goodyeroside A 的含量差異也可區(qū)分安南金線蘭和麗蕾金線蘭。此外，安南金線蘭中金線蓮苷含量雖然高于goodyeroside A，但僅為53.34 mg·g–1，低于多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道金線蘭的金線蓮苷含量[5]。因此，安南金線蘭能否替代金線蘭作藥用，當(dāng)作金線蓮的替代資源，還有待進(jìn)一步研究。