湖南八大公山桃葉珊瑚果實與種子的形態(tài)發(fā)育動態(tài)

盧小蓉，劉江濤，余 萍，李 龍，陳錦華，谷志容，何 鋼，田向榮*

(1. 吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000；2. (武陵山區(qū))植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首416000；3. 湖南省八大公山國家級自然保護區(qū)管理處，湖南 張家界 427000；4. 湘西土家族苗族自治州林業(yè)科學研究所，湖南 吉首 416000)

在分類上，桃葉珊瑚Aucubachinensis原來歸屬于山茱萸科Cornaceae，后來經向秋云等學者修訂后，被列入東亞特有的桃葉珊瑚科Aucubaceae[1—4]。桃葉珊瑚科植物均為分布于亞熱帶常綠闊葉林下的典型灌木，可作為亞熱帶常綠闊葉林灌木種群研究的重要材料。同時，由于其葉色常綠、葉形優(yōu)美、花果顏色鮮艷，因而常用作園林植物[1]；而且其所富含的次生代謝產物桃葉珊瑚苷是一些藥物的中間體和抗氧化劑。因此，桃葉珊瑚是一種多用途植物。

目前，對桃葉珊瑚的研究主要集中在分類系統(tǒng)位置[5—6]、次生代謝產物[7—10]及其藥理作用[11—13]等方面，對其園林應用和天然產物開發(fā)相關的種苗繁育研究還非常有限[14—16]。為了滿足園林應用和天然產物開發(fā)的需要，桃葉珊瑚種苗繁育的瓶頸問題亟待解決。

果實與種子的發(fā)育特征是與種苗繁育有關的核心問題之一，桃葉珊瑚果實與種子發(fā)育特征的相關研究對其園林應用有重要意義。然而，桃葉珊瑚果實與種子發(fā)育的特征及影響其發(fā)育的生態(tài)限制因子尚不清楚?！吨袊参镏尽飞详P于桃葉珊瑚的描述表明其花期為1～2 月，果熟期為翌年2 月[17]，說明桃葉珊瑚果實與種子發(fā)育緩慢，可能有花果同期、果期重疊現(xiàn)象。

本研究以湖南桑植八大公山國家級自然保護區(qū)內常綠闊葉林下的桃葉珊瑚為研究材料，通過實地調查、解剖觀察和相關性分析等方法對不同發(fā)育時期桃葉珊瑚果實外部形態(tài)特征、胚與胚乳的形態(tài)特征變化進行研究，主要探討：(1) 桃葉珊瑚果實與種子發(fā)育的形態(tài)變化規(guī)律；(2) 果實/種子形態(tài)變化與溫度和降雨量等生態(tài)因子的相關性；(3) 發(fā)育緩慢導致花果同期、果期重疊的原因等問題。通過對果實與種子的發(fā)育及其對生態(tài)因子響應規(guī)律的闡釋，為桃葉珊瑚的保護和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2021 年4 月～2022 年4 月(13 個月)，每月定期在湖南省桑植縣八大公山國家級自然保護區(qū)天平山林區(qū)內(29°78′ N、110°09′ E，海拔1316.1～1462.4 m)采集桃葉珊瑚果實，選擇野外坐果率最高的10 株為定點觀測和采樣植株(圖1A、B)，花冠凋落后開始采樣測定，每月測定1 次，直至果實完全自然掉落，帶回實驗室觀測。

圖1 八大公山國家級自然保護區(qū)天平山林區(qū)內的桃葉珊瑚Fig. 1 Aucuba chinensis plants in Tianpingshan forest area of Badagongshan National Nature Reserve

1.2 方法

1.2.1 果實形態(tài)測量

每次從植株不同方位隨機摘取發(fā)育正常、無病蟲害的果實30 個，用體視顯微鏡(Leica M205C)對果實長度、寬度、果皮厚度進行測量與拍照。發(fā)育時間以花冠凋落后的月份數(Months after withering，MAW)表示，果形指數以果實平均長度和果實平均寬度的比表示。

1.2.2 果實顏色測定

參考梁森苗等[18]測定果實顏色的方法，用國際標準色卡(CMYK RGB)與果皮顏色對照，鑒定每個月的果實顏色，并記錄其對應的紅綠藍(RGB)數值。

1.2.3 種子與胚形態(tài)測量

參考鄭國琦等[19]測定種胚形態(tài)的方法，用解剖刀將果實沿著背縫線對半切開，然后置于體視顯微鏡下測量果實、子房壁與果皮厚度，胚乳、胚的大小，胚率為胚長度與種子長度的比值。

1.3 數據獲取與統(tǒng)計分析

果實與種子形態(tài)數據均為平均值±標準差(mean±SD)。使用SPSS22.0 中One Way ANOVA 方法進行差異顯著性分析(P＜0.05)。

氣溫與降水等氣象數據來自于采集地八大公山氣象站58 年(1961～2018 年)年間的連續(xù)記錄數據。將果形指數、胚比分別與月平均氣溫和降水進行Pearson 相關性分析，以確定果實/種子發(fā)育受生態(tài)因子影響的關聯(lián)度。使用Origin 2018 繪圖。

2 結果與分析

2.1 桃葉珊瑚的花期與果期

八大公山國家級自然保護區(qū)內野生桃葉珊瑚的花期為3～4 月，其中雄花花期為3 月(圖1 C)，雌花花期為4 月(圖1 D)；果熟期至翌年4 月(圖1 E、F)，從4 月坐果到次年4 月完成自然掉落共經歷13個月，由于果期較長，花和果實發(fā)育期在3～4 月重疊，因此出現(xiàn)了花果同期(圖1 E)和果期重疊(圖1 F)現(xiàn)象。據實地調查42株桃葉珊瑚植株結果量發(fā)現(xiàn)，其果實產量較高，平均結果量為45±40 個，其中最少結果量為7 個，最多的可達173 個。

2.2 發(fā)育期果實外部形態(tài)與顏色的變化

通過對果實長度、寬度與果皮厚度進行測量，發(fā)現(xiàn)果實的生長發(fā)育呈現(xiàn)“慢-快-慢-快”的趨勢，依據生長曲線可將果實形態(tài)發(fā)育過程大致分為4 個階段(圖2、圖3)。

圖2 桃葉珊瑚果實長度、寬度(A)與果形指數、果皮厚度(B)生長發(fā)育動態(tài)變化Fig. 2 Dynamic changes of fruit length, width (A) and fruit shape index, ovary wall and pericarp thickness (B) of Aucuba chinensis

圖3 桃葉珊瑚果實不同發(fā)育時期顏色與基色色度值變化Fig. 3 Changes of color and primary chromaticity value of Aucuba chinensis fruits at different developmental stages

啟動期(1～4 MAW)：果實長度、寬度以及果皮厚度的平均月增長量分別為0.80 mm、0.22 mm、0.04 mm；凈增量占掉落時成熟果實長度的14.83%、寬度的6.86%以及果皮厚度的8.18%；此階段果實長度的增長顯著大于寬度，果形指數保持在2.49～2.63之間，果實整體呈長圓柱形。結合圖3 可知，果實顏色為青綠色，藍色色值緩慢增加。該階段果實發(fā)育處于蓄勢待發(fā)的啟動狀態(tài)。

生長期 Ⅰ(4 ～8 MAW)：果實長度、寬度以及果皮厚度的平均月增長量分別為1.1 mm、1.24 mm、0.11 mm；凈增量占掉落時果實長度的27.30%、寬度的51.66%、果皮厚度的27.04%；果實寬度的生長速率大于長度，果實迅速膨大，果形指數迅速減小至1.57，果實由長圓柱形變至近卵圓形。果實仍然為青綠色，藍色色值一直處于增加狀態(tài)，紅色和綠色色值波動較大(圖3)。整體而言，果實發(fā)育進入第一個迅速增長高峰期。

停滯期(8～10 MAW)：該階段果實生長極為緩慢，果實長度、寬度、果皮厚度的平均月增長量分別為0.34 mm、0.2 mm、0.04 mm；凈增量占掉落時果實長度的4.22%、寬度的4.16%、果皮厚度的4.40%；果形指數一直維持在1.56～1.57 之間，果實保持近卵圓形。該階段果實顏色由青綠色轉為黃色。

生長期 Ⅱ(10 ～13 MAW)：果實長度、寬度、果皮厚度的平均月增長量分別為0.99 mm、0.42 mm、0.18 mm；凈增量占掉落時果實長度的18.36%、寬度的13.20%、果皮厚度的33.3%；果形指數由1.57增長至1.70，果實長度增長快于寬度，果實向長卵圓形變化。該時期果實顏色迅速轉變?yōu)榧t色，主要是在紅色色值穩(wěn)定的情況下，綠色和藍色色值迅速下降所致。

2.3 胚乳形態(tài)變化

胚乳生長發(fā)育過程與果實形態(tài)變化規(guī)律基本相似(圖4～圖5)，也可分為4 個階段。

圖4 不同發(fā)育時期的桃葉珊瑚果實與胚形態(tài)變化Fig. 4 Morphological changes of fruits and embryos of Aucuba chinensis at different development periods

圖5 桃葉珊瑚果實在發(fā)育過程中的胚乳長度、寬度(A)與胚乳長度/寬度比值變化(B)Fig. 5 Changes of endosperm length and width (A) and endosperm length / width ratio (B) at different developmental stages of Aucuba chinensis fruits

啟動期(1～4 MAW)：此時的種子以胚珠的形式存在，胚珠和果皮之間有一個較大的空隙，大多數的果實只是在胚珠的中心對應胚乳的部位有一個小型的凹陷，尚未發(fā)育成胚乳。在體視顯微鏡下未能觀察到胚乳。

生長期 Ⅰ(4 ～8 MAW)：胚乳長度的增長略大于寬度，長度和寬度的平均月增長量分別為1.96 mm、1.67 mm，凈增量占掉落時胚乳長度的45.29%、寬度的71.71%；這一階段，胚乳長與寬的比值從4 MAW 的2.59 下降至8 MAW 的1.51。

停滯期(8～10 MAW)：胚乳長度和寬度的平均月增長量分別為0.49 mm、0.24 mm；凈增量占掉落時胚乳長度的11.27%、寬度的10.29%；胚乳長與寬的比值維持在1.5 左右。

生長期 Ⅱ(10 ～13 MAW)：胚乳長度和寬度的平均月增長量分別為1.01 mm、0.11 mm，凈增量占掉落時胚乳長度的23.30%、寬度的4.57%；胚乳長與寬的比值由1.50 增長至1.71。

2.4 發(fā)育期胚形態(tài)變化

2.4.1 胚生長與胚率變化

依據桃葉珊瑚種子的胚長度、寬度的變化曲線(圖6)，也可將其生長發(fā)育過程分為4 個階段。

圖6 桃葉珊瑚種子不同發(fā)育時期胚長度、寬度(A)以及胚率、胚長/寬比值(B)變化Fig. 6 Embryo length and width (A), embryo rate and ratio of embryo length to width (B) at different developmental stages of Aucuba chinensis seeds

啟動期(1～5 MAW)：體視顯微鏡下未能觀察到種胚。

生長期Ⅰ(5～8 MAW)：胚長度和寬度平均月增長量為0.57 mm 和0.16 mm；凈增量占掉落時胚長度的40.67%、寬度的39.34%；由于長度增長明顯高于寬度，胚的長寬比也從1.83 增至2.56；胚率由0.17增至0.27；該階段與果實長度和寬度的生長期基本同步。

停滯期(8～12 MAW)：胚長度和寬度的平均月增長量分別為0.06 mm、0.02 mm；凈增量占掉落時胚長度的5.98%、寬度的5.74%；胚長與寬的比值從2.56 增長至2.93；胚率一直穩(wěn)定在0.27～0.30，基本與果實發(fā)育同步，但這種緩慢生長持續(xù)到花冠凋落后的第12 MAW。

生長期Ⅱ(12～13 MAW)：胚的發(fā)育進入第二個生長高峰期，雖然胚寬度變化不明顯，但胚長度迅速增長，胚長度和寬度的平均月增長量分別為1.2 mm、0.14 mm；凈增量占掉落時胚長度的28.71%、寬度的11.48%；胚長與寬的比值從2.93增長至3.84，形成較為明顯的長條形。胚率再一次小幅提升，由0.30 增加到0.34；該階段與果實發(fā)育期有部分重疊，但胚率的增長時間較短，然后果實掉落。

2.4.2 胚形態(tài)變化

桃葉珊瑚的胚胎發(fā)育屬雙子葉植物普遍的發(fā)育形式，都經歷球形胚→心形胚→魚雷形胚→子葉胚階段(圖4)。但不同形態(tài)胚的出現(xiàn)時間和不同胚的比例呈現(xiàn)出多態(tài)性(圖7)，魚雷型胚持續(xù)時間長達9 個月，說明種胚發(fā)育緩慢。如圖7 所示，生長期Ⅰ(5～8 MAW)期間，魚雷型胚數量逐漸增多，占比由53%增至97%。停滯期(8～10 MAW)，子葉胚自8 MAW開始出現(xiàn)后，球形胚與心形胚已消失，魚雷型胚占比減少，但仍達90%以上。生長期Ⅱ(10～13 MAW)，子葉胚占比迅速上升，但只達到23%，同期魚雷形胚的占比則降為77%，說明桃葉珊瑚果實自然掉落時(13 MAW)，種胚發(fā)育不完全。

圖7 桃葉珊瑚果實發(fā)育過程不同種胚形態(tài)比例的變化Fig. 7 Changes in the proportion of embryo morphology of different species during fruit and seed development of Aucuba chinensis

2.5 環(huán)境因子與果實/種子形態(tài)變化的相關性

相關性分析表明，果形指數與月平均氣溫、平均降雨量均呈現(xiàn)顯著正相關，相關系數分別為0.58和0.89 (圖8 A、B)，說明溫度越高、降雨量越豐富越有利于桃葉珊瑚果實生長。其中降雨量對果實生長的影響達極顯著水平(P＜0.01)，說明果實生長顯著受降雨量的影響。胚率與平均溫度、降雨量呈顯著正相關(圖8 C、D)，說明胚的生長也要求較高的溫度和降雨量。綜上，桃葉珊瑚的果實和種子生長發(fā)育受水熱條件影響較強烈。

圖8 八大公山國家級自然保護區(qū)58 年(1961～2018 年)的月平均溫度、降雨量與果實/種子生長發(fā)育的相關性分析Fig. 8 Correlation analysis of 58 years (1961-2018) monthly average temperature, rainfall and fruit / seed growth and development in Badagongshan National Nature Reserve

3 結論與討論

3.1 桃葉珊瑚的花期與果期

研究表明，生長于八大公山的桃葉珊瑚果實發(fā)育緩慢，從花冠凋落到果實掉落持續(xù)了13 個月，在此期間出現(xiàn)明顯的花果同期和果期重疊現(xiàn)象。另外，癭椒樹Tapisciasinensis[20]、海州常山Clerodendrum trichotomum[21]和油茶Camelliaoleifera[22]均具有該現(xiàn)象。麻力[20]對癭椒樹果期重疊現(xiàn)象的研究表明其功能是保障雌性功能，以及果實和種子的正常發(fā)育，但并未與生態(tài)因子關聯(lián)起來。

在自然條件下，植物的花期、果期明顯受到水熱條件影響。邵周玲等[23]研究表明，四川米倉山區(qū)植物開花物候期隨著水熱條件的限制而明顯推遲；三島柴胡Bupleurumangustissimum[24]和新疆野杏Prunusarmeniaca[25]等的研究案例也表明水熱條件是影響花期與果期的關鍵生態(tài)因子?；诖?，我們對《中國植物志》記載的桃葉珊瑚屬11 個種的花期、果期和原生地植被類型與氣候特征進行整理(表1)[17]。從表1 可知，花期較早的是廣西東蘭的粗梗桃葉珊瑚A.robusta、香港的桃葉珊瑚和云南潞西、勐嘎的枇杷葉珊瑚A.eriobotryifolia，它們均處于水熱條件更為豐沛的南亞熱帶常綠闊葉林下；花期較晚的是印度大吉嶺的喜馬拉雅珊瑚A.himalaica、浙江南部的青木A.japonica、湖北宜昌的倒心葉珊瑚A.obcordata、重慶南川金佛山的斑葉珊瑚A.albopunctifolia和湖南八大公山的桃葉珊瑚，均處于中亞熱帶常綠闊葉林下；同樣果期最晚的也是處于中亞熱帶常綠闊葉林下的類群。這體現(xiàn)了桃葉珊瑚屬植物開花結實的物候期隨著水熱條件虧缺而依次延遲的特性。的公開數據。

表1 桃葉珊瑚屬植物的花、果期與生境特征Table 1 Floral, fruiting and habitat characteristics of Aucuba species

經比較發(fā)現(xiàn)，八大公山桃葉珊瑚的花期與果期較香港的桃葉珊瑚明顯延遲，說明桃葉珊瑚開花結實的物候期隨著緯度與海拔的升高而推遲，且受水熱條件限制，進而形成了水熱限制的時間窗口。這種水熱窗口限制與板栗Castaneamollissima[26]、梨橙[27]等的相關研究結果相一致。

3.2 桃葉珊瑚果實與種子的生長發(fā)育特性

3.2.1 果實與種子發(fā)育的階段性

不同植物的果實，其生長發(fā)育曲線類型不盡相同，但大體上可以分為兩種，即單“S”型曲線和雙“S”型曲線[19]。對桃葉珊瑚不同發(fā)育時期果實及種子長寬的測量結果表明，桃葉珊瑚果實的生長發(fā)育曲線屬于典型的雙“S”型，這與山茱萸Cornus officinalis[28]、杏Prunusarmeniaca[29]、李Prunus salicina[30]、油橄欖Canariumoleosum[31]等大多數核果類果實生長發(fā)育相似。雖然發(fā)育方式相同，但果實生長發(fā)育的最佳時期不同。桃葉珊瑚果實的2 個快速生長期分別為7～11 月(生長期Ⅰ)、翌年1 月～4 月(生長期Ⅱ)。而山茱萸果實的2 個快速生長期分別為4～6 月、7～8 月[28]；杏為4～6 月初、6 月中旬～6 月下旬[29]；楊梅果實為4～5 月、6 月[32]。由此可見，植物的果實發(fā)育不僅有其自身特性，也可能與生長區(qū)域及氣候條件有關。桃葉珊瑚果實的第1 個快速生長期持續(xù)時間更長，且在該時期果實迅速膨大，因此說明生長期 Ⅰ(4 ～8 MAW)為果實生長發(fā)育的最佳時期。

桃葉珊瑚果實發(fā)育初期保持綠色，提示其葉綠素含量一直較高[33]，但該過程藍色色值的增加也提示類胡蘿卜素的增長；果實成熟時變?yōu)榧t色，變紅則主要是在紅色色值穩(wěn)定的情況下，綠色和藍色色值迅速下降導致的，這似乎可歸因于該時期葉綠素含量降至最低，而花青苷含量和類胡蘿卜素含量顯著增加[18]。

種胚生長與果實發(fā)育同步，生長期Ⅰ階段仍是迅速生長的關鍵時期。同大多數雙子葉植物一樣，桃葉珊瑚種子的胚發(fā)育也經歷球形、心形、魚雷形和子葉型胚等階段，但其果實成熟掉落時胚仍為魚雷形胚(圖7)，有明顯的發(fā)育遲滯特性。有研究發(fā)現(xiàn)，很多果實掉落前存在種胚形態(tài)發(fā)育遲滯的現(xiàn)象，比如箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum種子胚發(fā)育長期停留在球形胚階段[34]，鐵筷子Helleborus thibetanus[35]和羌活Hanseniaweberbaueriana[36]的種子也存在種胚形態(tài)發(fā)育不完全的現(xiàn)象。桃葉珊瑚種子掉落時的胚發(fā)育停滯必然導致其種子在萌發(fā)過程中具有明顯的形態(tài)休眠，此后必然要經歷形態(tài)后熟后才能在適宜的條件下萌發(fā)，這也與Carol 等[37]總結的具有形態(tài)休眠的科中包含桃葉珊瑚科的描述一致。

桃葉珊瑚胚乳的發(fā)育與果實形態(tài)發(fā)育基本同步，且無明顯的漿狀期，提示其發(fā)育類型屬于細胞型[38-39]。大多數雙子葉植物的胚乳作為營養(yǎng)物質的臨時貯存庫，會隨著胚的發(fā)育逐漸被吸收和消耗[40—41]。譬如，葉立新[42]發(fā)現(xiàn)，山茱萸種子的胚乳在發(fā)育中被消耗。但是，本研究表明桃葉珊瑚果實成熟時胚乳仍然占據整個種子的絕大部分，與箭葉淫羊藿[34]、黃連Coptischinensis[43]類似，其保留的大量胚乳是為種子后熟提供營養(yǎng)支持的。

3.3 影響桃葉珊瑚果實與種子生長發(fā)育的環(huán)境因素

不同植物果實生長對水熱的要求不同。許越等[44]發(fā)現(xiàn)降水增加會抑制槜李Prunussalicinavar.salicina果實的生長，這說明該植物的果實對水分的要求較低。而何璇[45]的研究表明，冬棗Ziziphus jujuba生長期需要較多水分，以便能為果實膨大提供充足的水分。在本研究中，桃葉珊瑚果實的發(fā)育與降水的相關性較高，即雨量豐沛季節(jié)其果形指數明顯增加。當然，溫度對果實發(fā)育也有顯著影響。低溫環(huán)境會使蘋果MaluspumilaMill 停止生長并進入休眠[46]，低溫維持時間與桃Prunuspersica的果形指數呈顯著負相關[47]；相反，高溫促進柑桔citrus reticulata的生長，低于適宜溫度會使溫州蜜柑Citrus reticulata'Unshiu'的膨大受到抑制[48]。在本研究中，高溫顯著促進桃葉珊瑚果形指數的增加。但就環(huán)境因素的相關性而言，降雨量的影響要強于溫度。換言之，降雨量對桃葉珊瑚的果實發(fā)育更為關鍵。

一般認為，胚生長對溫度的要求較高，大麥Hordeumvulgare[49]、人參Panaxginseng[50]等的種胚發(fā)育均會因溫度不足而被抑制甚至停滯。在本研究中，相關分析結果表明，桃葉珊瑚種胚發(fā)育明顯受到溫度的調控，且體現(xiàn)為明顯的正相關。值得指出的是，其發(fā)育過程的高溫期(4～6 MAW)會迅速地促進胚的生長，但這種溫度促進僅能使大部分胚發(fā)育進入魚雷形胚時期，而其真正的完熟可能還需要一個高溫期的促進才能完成。這種溫度促進效應的分段現(xiàn)象與前面提及的水熱條件限制形成生態(tài)限制因子窗口應當有密切的關聯(lián)。

總之，桃葉珊瑚果實的生長要求高溫適濕的環(huán)境，這可能與其長期適應常綠闊葉林下環(huán)境形成的陰生特性有關。因此，我們認為水熱窗口期足夠長，其果實和種胚很可能就會具備正常的花、果期，從而不會出現(xiàn)花果同期甚至果期重疊的現(xiàn)象，即影響種子發(fā)育從而導致種苗繁育困難的可能主要是水熱窗口時間的長度。

同時，果實掉落時胚尚未完成分化，必然導致其種子具有形態(tài)休眠，并在種子脫離母體后經歷后熟過程而發(fā)育完全。因此，為了更好地理解桃葉珊瑚種子的萌發(fā)特性，尚需進一步研究其種子在后熟過程中的胚形態(tài)與生理生化變化，以及胚形態(tài)變化的生態(tài)效應。