鄒 宏,羅 干,李 玲,夏應菊,徐 璐,趙俊杰,張乾義

(1. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,國家/WOAH豬瘟參考實驗室,北京 海淀 100081 ;2. 重慶市萬州區(qū)畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心,重慶 萬州 404100)

隨著豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)C株疫苗株的發(fā)現(xiàn)[1],通過科學的生物安全防控措施和疫苗接種策略,豬瘟(Classical swine fever,CSF)在大多數(shù)國家已被成功消滅,但在一些養(yǎng)豬體量大的國家,如印度和越南等,豬瘟仍難以消滅,且還存在著慢性豬瘟和非典型豬瘟的流行,導致豬瘟的流行趨勢更加復雜多樣[2]。CSFV基因組長度約為 12.3 kb,包含1個開放閱讀框和2個非編碼區(qū)(Untranslated region,UTR),翻譯成1種多聚蛋白[3],該多聚蛋白在病毒和宿主細胞酶的作用下形成4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1和E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B),這些蛋白在CSFV的復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、致病作用和免疫逃避中發(fā)揮重要作用[4]。其中,非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B被證實參與CSFV生命周期內(nèi)病毒的復制、翻譯、致病作用和免疫逃避,但其具體機理尚不清楚[5]。

在黃病毒科(Flaviviridae)人獸共患傳染病病原體中,登革熱病毒(Dengue virus,DV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)等的NS4B蛋白已被大量研究報道[6]。通過對黃病毒科NS4B蛋白結(jié)構(gòu)預測和核酸序列比對發(fā)現(xiàn),CSFV的NS4B蛋白和牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的同源性最高,研究發(fā)現(xiàn)CSFV和BVDV有相似的血清抗原,存在60%以上的同源性[7]。但關于CSFV和BVDV NS4B蛋白的相關研究報道較少,因此只能依賴其他黃病毒科NS4B蛋白的研究資料推導CSFV NS4B蛋白可能存在的相關作用機理,如其與DExD-box 解旋酶 39B(DExD-box helicase 39B,DDX39B)、核糖體蛋白L15(Ribosomal protein L15,RPL15)和核糖體蛋白S3(Ribosomal protein S3,RPS3)等蛋白的相互作用[8]。本文對CSFV NS4B蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其與宿主其他蛋白的相互作用方面進行概述,以期為CSFV致病機理研究和感染防控提供參考。

1 CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B的結(jié)構(gòu)和功能

通過對黃病毒科瘟病毒屬NS4B蛋白的對比發(fā)現(xiàn),CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B與BVDV相似性最高,也是一種疏水性膜蛋白[9],分子質(zhì)量大小約為38 kDa,由NS3蛋白切割而來[10]。預測NS4B蛋白包含4個由跨膜區(qū)域隔開的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域,兩側(cè)是位于細胞質(zhì)中的 N 端和 C 端區(qū)域,C 端區(qū)域包含2個螺旋結(jié)構(gòu),N端區(qū)域包含2個保守的親性螺旋,在NS4B蛋白被切割時可以變成跨膜結(jié)構(gòu)域[11],且N端結(jié)構(gòu)域在CSFV RNA復制和致病過程中發(fā)揮重要作用[12]。

Thompson等[13]在HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B中發(fā)現(xiàn)了1個保守的核苷酸結(jié)合基序,該基序能水解三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)、三磷酸鳥苷(Guanosine triphosphate,GTP)和二磷酸鳥苷(Guanosine diphosphate,GDP),還具有核苷三磷酸(Nucleoside triphosphate,NTP)激酶活性,對HCV的體外復制、細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成至關重要,且該基序在瘟病毒屬中也同樣存在。在CSFV中,該基序包含Walker A和Walker B兩個基序,位于NS4B蛋白C末端氨基酸殘基第209～216位和第335～342位[5]。Walker A基序由富含G的磷酸鹽結(jié)合環(huán)組成,其共識序列為G/AXXXXGKS/T(其中X可以是任何殘基),參與NTP的β-磷酸鹽和γ-磷酸鹽結(jié)合;Walker B基序由Asp殘基組成,其前有一段疏水氨基酸(h)hhhhD或hhhhDD/E,能螯合Mg-NTP復合物的Mg2+,共識序列為DXXG[14]。Gladue等[5]通過進一步研究發(fā)現(xiàn),CSFV NS4B蛋白的NBM基序同樣能水解ATP、GTP和GDP,具有NTP激酶活性,這種活性是由Walker A和Walker B基序介導的。通過對Walker A或Walker B基序特定氨基酸的突變發(fā)現(xiàn),Walker A基序?qū)TP激酶活性的影響大于Walker B基序,這可能與Walker B基序的高度保守有關。與其他瘟病毒屬Walker A基序不同,CSFV NS4B蛋白中的Walker A基序在GKS/T特征序列中缺乏保守的K殘基,其中K被V或I取代,K殘基與NTP帶負電荷的β-磷酸和γ-磷酸相互作用,從而在體外促進ATP和GTP的水解[15]。研究發(fā)現(xiàn),NTP激酶活性可影響CSFV蛋白對核苷酸的結(jié)合和水解所介導的信號傳導、膜運輸和膜融合,在病毒復制、活力和毒力中起關鍵作用[16]。

Tamura等[17]鑒定出CSFV NS4B蛋白中不在NTP激酶基序內(nèi)的2個氨基酸,分別位于N端第2 475位和C端第2 563位,取代這2個位置可以影響NS4B復制酶復合物的穩(wěn)定性,并影響CSFV RNA復制的效率和病毒的毒力。此外,有研究在CSFV NS4B蛋白 C端區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了Toll-白細胞介素-1受體(Toll-interleukin-1 receptor,TIR)樣結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含3個保守基序:box 1、box 2 和box 3[16]。TIR結(jié)構(gòu)域能參與Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)的信號轉(zhuǎn)導,促進各種外源性或內(nèi)源性微生物成分的識別,激活宿主免疫應答反應[18]。對CSFV強毒株(BICv)NS4B蛋白的box 1進行突變可導致病毒活力喪失;對box 2進行替換可導致病毒毒力衰減,僅在扁桃體中局部復制,表明TIR結(jié)構(gòu)域不僅在CSFV復制中發(fā)揮作用,還參與CSFV的致病過程。

2 CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B與宿主蛋白的相互作用

黃病毒科病毒NS4B蛋白與其他蛋白的相互作用常有報道,如HCV NS4B蛋白抑制雙鏈RNA觸發(fā)的干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)介導的干擾素(Interferon,IFN)產(chǎn)生[19];DV NS4B蛋白的表達可通過干擾信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)磷酸化來阻斷IFN誘導的信號轉(zhuǎn)導[20];BVDV中NS4B蛋白殘基第15位的突變(Y至C)會導致病毒對細胞產(chǎn)生致病性[21]。在CSFV感染中,Lv等[22]也篩選出14種與NS4B蛋白相互作用的宿主蛋白,包括DDX39B蛋白、細胞色素C氧化酶亞基 7C(Cytochrome C oxidase subunit 7C,COX7C)蛋白、鐵蛋白重鏈(Ferritin heavy chain 1,FTH1)蛋白、線粒體抗病毒信號(Mitochondrial antiviral signaling,MAVS)蛋白、核受體亞族2,F組第6號成員(Nuclear receptor subfamily 2,group F,member 6,NR2F6)蛋白、核糖體蛋白側(cè)柄亞基 P1(Ribosomal protein lateral peduncle subunit P1,RPLP1)蛋白、26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基6B(26S protease regulatory subunit 6B,PSMC4)蛋白、纖維蛋白原樣 2(Fibrinogen like 2,FGL2)蛋白、Makorin環(huán)指蛋白1(Makorin ring finger protein 1,MKRN1)蛋白、RPL15蛋白、RPS3蛋白、Rab22a(Rab protein 22a,Rab22a)蛋白、腫瘤蛋白 p53 結(jié)合蛋白 2(Tumor protein p53 binding protein 2,TP53BP2)和TANK結(jié)合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1),這些蛋白參與細胞內(nèi)的氧化還原反應、信號轉(zhuǎn)導、生物調(diào)控、催化反應和蛋白定位等過程,在宿主細胞代謝中發(fā)揮作用,但具體的相互作用機理有待進一步研究。

2.1 NS4B與RPLP1相互作用 Zhang等[23]通過免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)試驗、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)融合蛋白沉降技術和共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)RPLP1與CSFV NS4B蛋白相互作用,用慢病毒介導敲低RPLP1可抑制CSFV生長,過表達RPLP1可促進CSFV增殖,且CSFV感染會明顯上調(diào)RPLP1的表達。RPLP1蛋白是60S 核糖體亞基的重要組成成分,負責協(xié)調(diào)翻譯的延伸,可作為病毒粒子的受體蛋白參與病毒粒子的復制和組裝等[24]。研究發(fā)現(xiàn),核糖體蛋白 S25(Ribosomal protein S25,RPS25)在HCV內(nèi)部核糖體進入位點(Internal ribosome entry sites,IRES)介導的病毒蛋白的翻譯中起促進作用,一旦RPS25耗盡,HCV的傳播就會受損,而RPLP1對CSFV的IRES活性卻沒有影響[6]。進一步研究發(fā)現(xiàn),在CSFV感染的第1個生命周期內(nèi),RPLP1會降低細胞內(nèi)外子代病毒滴度和E2蛋白的表達,但不影響細胞內(nèi)病毒基因組的復制和蛋白合成,推測RPLP1主要在CSFV基因組的翻譯中起作用,其C端第66～114位氨基酸與NS4B蛋白相結(jié)合[13]。

2.2 NS4B與FHC相互作用 鐵蛋白重鏈(Ferritin heavy chain,FHC)是一種鐵蛋白,可將Fe2+轉(zhuǎn)化為Fe3+,并降低細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量,防止ROS的細胞毒性,此外,FHC還可介導細胞凋亡,促進核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的產(chǎn)生[25]。Qian等[26]研究發(fā)現(xiàn),用慢病毒介導敲低FHC會抑制CSFV復制,過表達FHC會增強CSFV傳播,且NS4B蛋白表達會上調(diào)FHC表達,進一步研究表明,FHC可促進CSFV增殖和抗細胞凋亡,但具體的作用機理有待進一步研究,且 FHC的抗凋亡作用依賴于其濃度,超過閾值時,其細胞毒性作用會抑制CSFV生長;而CSFV病毒滴度過高會擾亂FHC蛋白與CSFV之間的平衡,導致細胞發(fā)生鐵死亡。

2.3 NS4B與Rab22a相互作用 Rab22a蛋白作為Ras相關GTP結(jié)合蛋白(Ras-related GTP-binding protein,Rab)家族成員之一,在囊泡轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[27]。劉雅茹[28]通過激光共聚焦、co-IP和GST pull-down試驗證實了Rab22a與NS4B蛋白相互作用,干擾細胞Rab22a會顯著抑制 CSFV的復制過程,過表達Rab22a則會促進CSFV的復制和增殖;對 Rab22a 進行突變也能抑制CSFV的復制和增殖,進一步證明了Rab22a對CSFV復制的促進作用。CSFV作為囊膜病毒,在感染早期可通過細胞內(nèi)吞作用入侵細胞,并在多種轉(zhuǎn)運蛋白的作用下運送至復制靶點進行病毒的復制和增殖,而 Rab5蛋白和Rab7蛋白是CSFV在入侵宿主細胞后,病毒從早期內(nèi)體演變?yōu)橥砥趦?nèi)體的關鍵因子[29],病毒入侵后先形成早期內(nèi)體,后形成晚期內(nèi)體,在細胞內(nèi)環(huán)境pH發(fā)生變化后發(fā)生囊膜融合,最后病毒暴露核酸進行增殖[30]。有研究報道顯示,Rab22a-Rab5-NS4B的相互結(jié)合可促進CSFV的復制,但具體機理仍有待進一步研究[31]。

2.4 NS4B與FASN相互作用 有研究表明,CSFV膜結(jié)構(gòu)的形成需要脂肪酸的生物合成,該過程受脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)的調(diào)節(jié),而CSFV NS4B蛋白在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜網(wǎng)的組裝中發(fā)揮重要作用[32]。Liu等[33]研究發(fā)現(xiàn),脂肪酸合成途徑中的2種限速酶會影響CSFV復制,FASN抑制劑會破壞CSFV的復制,但不影響病毒的內(nèi)吞,表明FASN對CSFV的積極作用;進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達NS4B蛋白會導致與NS4B相互作用的FASN上調(diào),其相互作用位置主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng);脂滴(Lipid droplets,LDs)上的Rab18可通過與NS4B蛋白相互作用調(diào)節(jié)NS4B與FASN的作用,進一步增加LDs的數(shù)量,促進CSFV的復制。

2.5 NS4B與MAVS相互作用 在識別CSFV感染的過程中,各種模型識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)在宿主的先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,CSFV可以被維甲酸誘導基因蛋白I樣受體[The retinoid acid-inducible gene-I (RIG-I) like receptors,RLRs]識別,并與MAVS蛋白結(jié)合,激活免疫反應[34]。Dong 等[35]研究發(fā)現(xiàn),CSFV感染可導致豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)中MAVS表達增加,MAVS可增強抗病毒和促炎細胞因子的誘導和細胞凋亡,并可抑制CSFV的復制;但CSFV Npro蛋白可抑制MAVS誘導的干擾素和促炎細胞因子的釋放以及細胞凋亡,且IRF3敲低也可抑制MAVS誘導的宿主細胞防御,表明Npro蛋白能通過降解IRF3來抑制MAVS介導的宿主細胞防御。Dong等[36]研究發(fā)現(xiàn),CSFV NS4B蛋白可與MAVS相互作用,NS4B的表達不影響 MAVS 的表達,但會抑制MAVS介導的NF-κB活化和IRF3表達,從而抑制IL-8表達,表現(xiàn)出和Npro蛋白相似的作用。

2.6 NS4B與Tsg101相互作用 研究證實,內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復合體(Endocytic sorting complex required for transport,ESCRT)參與CSFV的入侵和排出[37]。Liu等[38]研究發(fā)現(xiàn),ESCRT-I蛋白中的腫瘤易感基因 101(Tumor susceptibility gene 101,Tsg101)蛋白可協(xié)助CSFV從晚期內(nèi)體Rab7和Rab9向溶酶體運輸,并通過形成NS4B-NS5B-Tsg101復合物調(diào)節(jié)CSFV的復制。

2.7 NS4B與pRNF114相互作用 RING 結(jié)構(gòu)域 E3 連接酶 (RING domain E3 ligases,RING E3s) 是一組包含 RING 指結(jié)構(gòu)域的 E3 連接酶,可參與宿主免疫反應,抑制病毒復制[39]。Zhang等[40]篩選到1種RING E3 連接酶,即豬指環(huán)蛋白114(Porcine RING finger protein 114,pRNF114),并發(fā)現(xiàn)該蛋白C末端結(jié)構(gòu)域可與CSFV NS4B蛋白相互作用,通過蛋白酶體依賴的途徑導致K27連接的多泛素化和NS4B蛋白的降解,從而抑制CSFV的復制,但pRNF114的抗病毒作用取決于E3連接酶的活性。

3 小結(jié)與展望

CSFV NS4B蛋白與宿主蛋白Tsg101、Rab22a和FASN相互作用,參與病毒粒子內(nèi)吞、釋放和膜網(wǎng)結(jié)構(gòu)形成,促進病毒復制;與宿主蛋白RPLP1相互作用,介導病毒粒子的翻譯過程;與宿主蛋白MAVS和FHC相互作用,參與病毒的免疫逃避;與宿主蛋白pRNF114相互作用,抑制病毒的復制。此外,CSFV NS4B蛋白結(jié)構(gòu)特定的氨基酸取代還會影響病毒的活力和毒力,可見其對CSFV生命周期的影響作用極大。非構(gòu)蛋白NS4B還存在很多蛋白相互作用模式,如DV NS4B蛋白可與人工抑制劑相互作用,導致NS3-NS4B復合物形成受阻,從而抑制NS4B蛋白的復制過程[41];DV NS4B蛋白可與NS2B-NS3蛋白酶解旋酶結(jié)合促進病毒復制,可與NS5相互作用逃避宿主免疫反應[42]。Zou等[43]研究發(fā)現(xiàn),DV NS4A-NS4B相互作用所需的最小區(qū)域為NS4A氨基酸第40～76位和NS4B氨基酸第84～146位,表明非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B不僅可與宿主蛋白相互作用,還可與自身的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白,如DDX39B、COX7C、NR2F6、PSMC4、FGL2、MKRN1、RPL15、RPS3、TP53BP2和TBK1蛋白等相互作用,但CSFV的這種相互作用模式報道較少,還有待進一步驗證和研究[44,45]。進一步闡明CSFV NS4B蛋白復雜的相互作用網(wǎng)絡可以在一定程度上解釋CSFV的復制機理和致病機理,為抗病毒策略制定、疫苗研究和新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。