楊 恒,李占鴻,宋子昂,高 林,李卓然,廖德芳,肖 雷*,李華春*

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,昆明 650214;2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,南京 210095)

帕利亞姆血清群病毒(Palyam virus, PALV)隸屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus),廣泛分布于世界范圍的熱帶、亞熱帶與溫帶地區(qū)。病毒通過(guò)庫(kù)蠓(Culicoidesspp.)對(duì)動(dòng)物的叮咬傳播,主要感染牛、羊等反芻動(dòng)物,引起妊娠期家畜出現(xiàn)生產(chǎn)異常(流產(chǎn)、死胎或腦組織發(fā)育不全的畸形胎)[1-2]。1985—1986年,日本爆發(fā)妊娠牛感染PALV導(dǎo)致的分娩異常,給日本養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。對(duì)牛、羊等反芻動(dòng)物的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,PALV在我國(guó)由南(海南)至北(內(nèi)蒙),由東(江蘇)至西(新疆)的廣泛區(qū)域流行[5-7],建立PALV診斷方法,對(duì)防止疫情的發(fā)生十分重要。

本實(shí)驗(yàn)室于2012年首次從我國(guó)云南省的哨兵牛上分離出Chuzan virus(CHUV)[8],隨后在云南、廣東與廣西設(shè)立的哨兵牛中開(kāi)展PALV的監(jiān)測(cè)與病毒分離工作,除分離獲得多株CHUV外,還在我國(guó)首次分離出D’Aguilar Virus(DAV)與Bunyip Creek virus(BCV)[9],表明多種血清型的PALV流行于我國(guó)南方地區(qū),對(duì)我國(guó)牛羊養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了潛在威脅。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高與重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì),目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)PALV血清型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的報(bào)道。本研究根據(jù)我國(guó)流行PALV毒株基因節(jié)段2(Seg-2)序列特征,首次報(bào)道了我國(guó)流行PALV三種血清型(CHUV、BCV與DAV)的qRT-PCR檢測(cè)方法,為開(kāi)展PALV診斷與流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒、血液樣品與核酸樣品

自我國(guó)云南省、廣西壯族自治區(qū)與廣東省分離到的CHUV(14株)、BCV(8株)與DAV(6株)共計(jì)28株P(guān)ALV由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。藍(lán)舌病毒(BTV)、流行性出血癥病毒(EHDV)、西藏環(huán)狀病毒(TIBOV)與阿卡斑病毒(AKAV)由本實(shí)驗(yàn)室從設(shè)立于云南省的哨兵牛上分離保存。CHUV、BCV與DAV陽(yáng)性血液樣本各30份,采集自云南省設(shè)立的哨兵動(dòng)物。PALV基因節(jié)段7全長(zhǎng)序列克隆質(zhì)粒PLB-CHUV/V144/Seg-7質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[10]。

1.2 主要試劑

磁珠法病毒RNA抽提試劑盒MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo-Fisher公司;RNAiso-Plus、病毒DNA/RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒與逆轉(zhuǎn)錄酶等購(gòu)自大連寶生物公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

從GenBank中下載PALV的Seg-2序列,與本實(shí)驗(yàn)室獲取中國(guó)流行CHUV、BCV與DAV毒株Seg-2全長(zhǎng)序列進(jìn)行序列比對(duì),選擇序列保守區(qū)域,使用Beacon Designer 8.0軟件進(jìn)行特異性擴(kuò)增引物與TaqMan探針的設(shè)計(jì)(表1)。

表1 CHUV、BCV與DAV檢測(cè)用qRT-PCR引物與探針信息Table 1 Information of qRT-PCR primers and probes for CHUV, BCV and DAV detection

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制和敏感性試驗(yàn)

以10倍梯度稀釋的PLB-CHUV/V144/Seg-7質(zhì)粒為模板(核酸拷貝數(shù)1.2×102～1.2×108copies·μL-1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),取1 μL合成的CHUV、BCV與DAV參考毒株 cDNA為模板,通過(guò)PALV群特異性qRT-PCR[10]進(jìn)行絕對(duì)定量qPCR反應(yīng),計(jì)算參考毒株cDNA拷貝數(shù)。將cDNA稀釋為101～108copies·μL-1,使用設(shè)計(jì)的血清型特異性熒光定量引物(表1),每個(gè)稀釋度重復(fù)進(jìn)行3次qPCR反應(yīng)。以病毒核酸拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以熒光信號(hào)值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算相關(guān)系數(shù)(R2)和擴(kuò)增效率(E值),分析PALV 血清型qRT-PCR方法可檢測(cè)核酸拷貝數(shù)的下限。

1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取低濃度(102copies·μL-1)、中濃度(105copies·μL-1)與高濃度(108copies·μL-1)的CHUV、BCV與DAV參考毒株cDNA 1 μL為模板,進(jìn)行3次批次內(nèi)和批次間平行qPCR試驗(yàn),計(jì)算所得Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差(STD)與變異系數(shù)(CV),分析方法的重復(fù)性。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)效果的驗(yàn)證

提取我國(guó)分離28株P(guān)ALV的核酸,取1 μL核酸為模板進(jìn)行PALV血清型qRT-PCR檢測(cè)。取90份PALV感染陽(yáng)性動(dòng)物的血液樣本,使用MagMax Express核酸自動(dòng)提取儀提取病毒核酸,取5 μL提取的核酸為模板,進(jìn)行PALV血清型的qRT-PCR驗(yàn)證,將反應(yīng)產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(xiàn),而且Ct值<38.0判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.7 PALV血清型qRT-PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

取2019年在云南省師宗縣五龍鄉(xiāng)采集的庫(kù)蠓樣本,將50～60只庫(kù)蠓分為一批。在庫(kù)蠓樣本中加入200 μL PBS,使用TissueLyser II勻漿器(Qiagen)進(jìn)行勻漿,使用RNAiso-Plus提取勻漿樣本的核酸,使用PALV群特異性qRT-PCR檢測(cè)樣本中PALV核酸,對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行病毒血清型qRT-PCR鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 PALV血清型特異性qRT-PCR的靈敏度性分析

反轉(zhuǎn)錄合成CHUV、BCV與DAV參考毒株的cDNA,進(jìn)行絕對(duì)定量qPCR分析,顯示其拷貝數(shù)分別為2.45×108、2.28×108與2.85×108copies·μL-1。將合成的cDNA稀釋為101至108copies·μL-1,每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)進(jìn)行qPCR反應(yīng)。結(jié)果顯示,3種血清型PALV的qPCR反應(yīng)擴(kuò)增效率(E)范圍為92.53%～106.00%,相關(guān)系數(shù)(R2)值>0.998,可檢出核酸最低拷貝數(shù)均<30 copies(圖1、表2),表明建立的PALV血清型qRT-PCR方法具有良好的靈敏度。

2.2 PALV血清型特異性qRT-PCR的特異性與重復(fù)性試驗(yàn)

取1 μL提取的 CHUV、BCV、DAV、BTV、EHDV、TIBOV與AKAV核酸為模板,以RNase-Free H2O為陰性對(duì)照,進(jìn)行PALV血清型qRT-PCR反應(yīng),顯示僅CHUV、BCV與DAV的核酸模板有相應(yīng)的擴(kuò)增曲線(xiàn)產(chǎn)生,而其它病毒的核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性,表明建立PALV血清型特異性qRT-PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性(圖1)。分別以102、105和108copies·μL-1等3個(gè)濃度的CHUV、BCV和DAV核酸為模板,進(jìn)行組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗(yàn),結(jié)果顯示組內(nèi)Ct值的CV值在0.42%～1.41%之間,組間Ct值的CV值在1.03%～1.88%之間,組內(nèi)與組間CV值均小于2%,表明方法具有良好的重復(fù)性。

A～C. 分別為CHUV、BCV與DAV 血清型特異性qRT-PCR靈敏度分析結(jié)果:1～8. 將病毒的cDNA模板進(jìn)行1×10-1至1×10-8倍梯度稀釋。D. 特異性分析結(jié)果。圖中橫坐標(biāo)表示PCR循環(huán)數(shù),縱坐標(biāo)(Rn)表示熒光信號(hào)強(qiáng)度 A-C. Results of CHUV, BCV and DAV qRT-PCR sensitivity analysis: 1-8. cDNA templates were gradient diluted from 10-1 to 10-8. D. Results of specificity analysis. Abscissa and ordinate indicated number of PCR cycles and fluorescence signal intensity (Rn), respectively圖1 PLAV血清型特異性qRT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度與特異性分析結(jié)果Fig.1 Sensitivity and specificity analysis results of PLAV serotype-specific qRT-PCR

表2 PALV血清型特異性qRT-PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和靈敏度分析Table 2 Standard curves and sensitivity assay results of PALV serotyping qRT-PCR

2.3 PALV血清型特異性qRT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果

選擇我國(guó)2012年至2020年在云南省、廣西壯族自治區(qū)與廣東省分離的28株P(guān)ALV,進(jìn)行PALV血清型qRT-PCR的回復(fù)驗(yàn)證。結(jié)果顯示,建立的CHUV、BCV與DAV血清型特異性qRT-PCR均可檢測(cè)對(duì)應(yīng)血清型PALV毒株,吻合率為100%,反應(yīng)的Ct值在9.9～19.7之間,表明建立的PALV血清型qRT-PCR可對(duì)我國(guó)不同時(shí)間與不同地域流行的PALV毒株進(jìn)行血清型定型。

取CHUV、BCV與DAV感染哨兵動(dòng)物上采集的血液樣本各30份,提取核酸進(jìn)行PALV的群特異性qRT-PCR檢測(cè)。根據(jù)獲取的Ct值,可將血液樣本分為“強(qiáng)陽(yáng)性樣本”(Ct值在29.0～34.0之間)與“弱陽(yáng)性樣本”(Ct值在34.0～37.0之間)。建立的PALV血清型特異性qRT-PCR檢測(cè)方法對(duì)“強(qiáng)陽(yáng)性”與“弱陽(yáng)性”血液樣本均可產(chǎn)生有效的擴(kuò)增曲線(xiàn),獲取的Ct值與PALV群特異性qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果基本保持一致,表明本研究建立的qRT-PCR方法可準(zhǔn)確鑒定動(dòng)物感染PALV的血清型。

2.4 庫(kù)蠓樣本中PALV血清型的檢測(cè)

對(duì)2019年在師宗縣采集的6批庫(kù)蠓進(jìn)行PALV核酸的檢測(cè)。結(jié)果在4批庫(kù)蠓中檢測(cè)到PALV核酸,Ct值在25.7～35.3之間。對(duì)庫(kù)蠓攜帶的PALV的血清型進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),與預(yù)期結(jié)果一致,在不同批次的庫(kù)蠓中檢測(cè)到CHUV、BCV與DAV核酸。值得注意是,其中一批庫(kù)蠓,雖然PALV群特型qRT-PCR的Ct值為35.3,但3種血清型PALV的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性,提示在師宗縣還可能存在血清型未知的PALV的流行。

3 討 論

建立的PALV血清型qRT-PCR方法能否對(duì)我國(guó)不同時(shí)間與不同地域流行PALV毒株進(jìn)行鑒定,是衡量方法可靠性的重要指標(biāo)之一。對(duì)此,本研究選擇了2012—2020年我國(guó)云南、廣東與廣西等地分離的28株P(guān)ALV[9]進(jìn)行血清型的qRT-PCR回復(fù)驗(yàn)證,結(jié)果顯示,研究建立的PALV血清型qRT-PCR鑒定結(jié)果與分離毒株的測(cè)序鑒定結(jié)果一致,表明方法具有良好的“覆蓋度”,可有效鑒定我國(guó)不同時(shí)間、不同地域流行PALV毒株的血清型。

為分析建立的血清型qRT-PCR方法能否檢測(cè)PALV不同感染階段動(dòng)物血液中的病毒核酸,取CHUV、BCV與DAV感染哨兵動(dòng)物抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)前1周(病毒感染早期)、抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后1～2周(病毒血癥高峰期)以及抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后2個(gè)月(病毒感染晚期)的血液樣本進(jìn)行PALV血清型qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,建立的PALV血清型qRT-PCR既可檢測(cè)PALV核酸含量較高的“強(qiáng)陽(yáng)性”樣本(病毒血癥高峰期),也可檢測(cè)病毒含量較低的“弱陽(yáng)性”樣本(感染早期與病毒感染晚期)。以上結(jié)果證實(shí),本研究建立的PALV血清型特異性qRT-PCR檢測(cè)方法具有良好的敏感度,可用于不同感染時(shí)期動(dòng)物血液中PALV的血清型鑒定。

將本研究建立的PALV血清型特異性qRT-PCR方法對(duì)2019年師宗縣采集庫(kù)蠓樣本中攜帶的PALV的血清型進(jìn)行鑒定。在庫(kù)蠓中鑒定出了CHUV、BCV與DAV。然而值得注意的是,其中一批被測(cè)庫(kù)蠓雖然PALV核酸檢測(cè)為陽(yáng)性,但是PALV血清型qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性。以上結(jié)果表明,建立的PALV血清型qRT-PCR方法可用于媒介中攜帶PALV血清型的鑒定,同時(shí)也提示在師宗縣可能還存在其它血清型的PALV的流行。

4 結(jié) 論

本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特異強(qiáng)、敏感性與重復(fù)性,可用于PALV感染動(dòng)物與媒介中PALV血清型的鑒定,具有良好的應(yīng)用價(jià)值。