田啟會,張 亮,龍亞麗

(甘肅畜牧工程職業(yè)技術學院,武威 733006)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的工程細胞[1-2]。在治療過程中,需要依靠其不斷的自我更新和增殖能力維持發(fā)揮其長期治療或者輔助治療作用,例如受損組織器官的再生與修復[1-4]。但是,異常微環(huán)境通常會引起B(yǎng)MSCs增殖能力的下降,限制其發(fā)揮長期的治療作用,其中缺氧微環(huán)境是引起干細胞治療過程效果不佳的主要的因素之一[5]。文獻研究發(fā)現,缺氧環(huán)境可以導致BMSCs增殖、分化等生物學特性發(fā)生改變,這為干細胞的臨床應用提出挑戰(zhàn)[6]。BMSCs增殖活性是受損的組織器官再生和修復的基礎,因此,如何防護缺氧所引起的BMSCs的增殖活性的異常改變已成為BMSCs應用前必需解決的關鍵問題。

BMSCs大量存在于脊髓中,黃芪作為補氣類中藥,具有健脾補中,升陽舉陷,益衛(wèi)固表的功效。前期已有文獻證實黃芪成分(如黃芪多糖)能夠維護MSCs的生物學穩(wěn)定性[6-7]。基于以上分析,推測黃芪可能對BMSCs的增殖活性具有調節(jié)作用、是維持缺氧環(huán)境中BMSCs增殖活性的潛在藥物。本研究擬通過建立缺氧微環(huán)境,探究黃芪對缺氧環(huán)境中BMSCs增殖活性的影響,并初步探討黃芪的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

骨髓間充質干細胞(BMSCs)細胞株,購自美國 ScienCell 公司(編號:7500)。

1.2 主要試劑與儀器

黃芪購自甘肅省中醫(yī)院;間充質干細胞基礎培養(yǎng)基、胎牛血清(ScienCell,22846);兔抗人p-PI3K(Immunoway,YP0765)、p-AKT(Immunoway,YP0006)多克隆抗體;山羊抗兔多克隆抗體二抗(Immunoway,RS0002);RT-PCR轉錄試劑盒(TaKaRa公司,批號:AKG1212A),RT-PCR熒光定量試劑盒(TaKaRa公司,批號:AL12412A);山羊抗兔多克隆抗體二抗(Alexa Fluor ? 594)(Abcam公司,GR596447);JC-10細胞線粒體膜電位(MMP)活細胞熒光染料(美國AAT公司,批號:2191362)。

CO2細胞低氧培養(yǎng)箱(Thermo,SKYJH);酶標儀(BIO-RAD,IMARK);激光共聚焦顯微鏡FV10-ASW 2.1 Viewer(Olympus,IX80),高內涵成像系統(tǒng)(PerkinElmer,Operetta CLS)。

1.3 試驗分組

試驗以BMSCs為研究對象,分為空白對照組(Ctrl)、低氧模型組(M)、黃芪凍干粉低劑量組(HQ-D)、黃芪凍干粉中劑量組(HQ-Z)、黃芪凍干粉高劑量組(HQ-G),細胞培養(yǎng)氧濃度為10%,黃芪凍干粉溶液低、中、高組濃度分別為100、200、400 μg·mL-1。

1.4 黃芪凍干粉溶液制備

將100 g黃芪用0.5 L蒸餾水煮沸1 h,提取水煎液,然后用濾紙過濾,將濾液放入冷凍干燥機內凍干。黃芪凍干提取物的提取率約為30%。凍干粉在使用前溶于蒸餾水,然后用0.22 μm注射器過濾器過濾。

1.5 細胞培養(yǎng)

取第 3 代的狀態(tài)良好的 BMSCs 細胞,使用 MSCM 完全培養(yǎng)基調整成細胞濃度為 1×104·mL-1的單細胞懸液,每孔4 mL接種于細胞培養(yǎng)瓶內,每組設3個平行重復。將細胞置于常氧環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞匯合達到60%時棄去瓶內培養(yǎng)基,加入新鮮完全培養(yǎng)基開始干預。黃芪凍干粉溶液組分別加入含有100、200、400 μg·mL-1的黃芪凍干粉完全培養(yǎng)基,低氧組和黃芪凍干粉溶液組置于10%的氧濃度環(huán)境中培養(yǎng)24 h。

1.6 細胞增殖檢測

將干預后的細胞轉移至96孔板中,每組3個復孔。貼壁后將細胞培養(yǎng)板放置到高內涵成像系統(tǒng)內,設置24 h無標記成像,記錄細胞增殖、分化過程。

1.7 細胞運動檢測

細胞前處理同上,利用高內涵成像系統(tǒng)實時無標記示蹤程序,對細胞運動軌跡進行示蹤并標記。根據細胞運動軌跡分析細胞運動速度、位移距離和路程。

1.8 細胞線粒體膜電位檢測

干預完成后,用PBS對細胞清洗1遍后,加入新鮮培養(yǎng)基,將JC-10熒光探針工作液加入培養(yǎng)基中,37 ℃條件下避光孵育20 min后,在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。當膜電位水平低時,激發(fā)波長527 nm,通過AF 488熒光通道觀察拍照;當膜電位水平高時,激發(fā)波長590 nm,通過AF 594熒光通道觀察,每組細胞進行3次重復。

1.9 激光共聚焦顯微鏡檢測p-PI3K和p-AKT蛋白熒光表達

將蓋玻片平鋪入24孔細胞培養(yǎng)板中,將干預后的細胞消化、吹散并接種于6孔板中,匯合度控制在20%左右,進行培養(yǎng)。待細胞匯合度達到60%～70%時,每個孔中加1 mL 4%多聚甲醛,室溫固定20 min,棄多聚甲醛,再加入1 mL甲醇繼續(xù)固定5 min。棄甲醇,加入1 mL免疫熒光用Blocking buffer,室溫封閉10 min。棄封閉液,加入含兔抗p-PI3K抗體(1∶500)和p-AKT抗體(1∶500)的Blocking buffer,慢搖過夜。PBS液,洗3遍后,加入1 mL含Alexa Fluor? 594 (ab)羊抗兔熒光二抗(500∶1)的Blocking buffer,避光慢搖1 h。PBS液潤洗細胞5遍,每遍5 min。載玻片上滴加含DAPI染料的封片液,將蓋玻片取出并倒扣在封片液上,于激光共聚焦顯微鏡下觀察,每組細胞隨機挑選3個視野,每個視野隨機選擇10個細胞進行熒光定量,熒光表達水平通過FV10-ASW 2.1 Viewer軟件進行分析。

1.10 RT-PCR檢測成骨分化關鍵基因表達水平

干預完成后,提取各組細胞中RNA并進行濃度測定。以20 μL的體系反轉錄合成cDNA,并進行實時熒光定量檢測,反應條件:95 ℃變性1 min,[95 ℃ 10 s,57 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s收集熒光]40個循環(huán),熔解曲線制備65～95 ℃,0.5 ℃·s-1。

表1 RT-PCR檢測成骨分化關鍵基因的引物序列Table 1 Primer sequences for detecting key genes for osteogenic differentiation by RT-PCR

1.11 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 黃芪對低氧環(huán)境中BMSCs增殖的影響

本研究首先觀察不同濃度的黃芪凍干粉溶液對缺氧環(huán)境中BMSCs增殖的影響。通過高內涵成像系統(tǒng)24 h無標記動態(tài)監(jiān)測,與Ctrl組細胞相比,M組細胞在各時間點數量明顯減少(圖1 A和B),細胞分化代數明顯減少(圖1C),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與M組相比,HQ-Z和HQ-G組細胞數量增多(圖1、2),HQ-G組細胞分化代數增高(圖1C),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)。上述結果提示,黃芪凍干粉溶液具有逆轉缺氧環(huán)境導致的BMSCs增殖能力下降的作用。

A. 不同干預條件下細胞實時動態(tài)增殖情況監(jiān)測(24 h細胞無標記動態(tài)增殖情況,每3 h同視野成像記錄,10×);B. 不同干預條件下細胞實時動態(tài)增殖情況統(tǒng)計;C. 24 h不同干預條件下細胞分化代數;n=3,*.P<0.05,**.P<0.01 A. Real time dynamic cell proliferation monitoring in different intervention conditions (24 hours of unmarked dynamic cell proliferation, recorded every 3 hours with the same field imaging, 10×); B. Real time dynamic cell proliferation statistics in different intervention conditions; C. Cell differentiation generation in different intervention conditions within 24 hours; n=3,*.P<0.05,**.P<0.01圖1 黃芪對缺氧環(huán)境中BMSCs增殖的影響Fig.1 Effects of Astragalus membranaceus on the proliferation of BMSCs in hypoxic environments

2.2 黃芪對低氧環(huán)境中BMSCs運動能力學影響

細胞運動能力是反映細胞活力的重要標志,本研究進一步對各干預條件下的細胞進行運動軌跡的示蹤,并分析細胞在不同干預條件下的運動速度、位移距離和運動路程。與Ctrl組細胞相比,M組細胞運動速度、位移距離和總運動路程均明顯減少(圖2),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與M組相比,HQ-Z和HQ-G組細胞運動速度、位移距離和總運動路程均有所增加(圖2),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)。以上結果提示,缺氧環(huán)境導致BMSCs運動活力下降,而黃芪中、高劑量的黃芪凍干粉對缺氧環(huán)境中BMSCs的運動活力具有一定的保護作用。

A. 24 h不同干預條件下細胞運動軌跡示蹤(細胞運動軌跡由計算機進行動態(tài)模擬,為區(qū)分單個細胞由不同顏色進行標記,40×);B. 24 h不同干預條件下細胞平均運動速度;C. 24 h不同干預條件下細胞位移距離;D. 24 h不同干預條件下細胞運動路程;n=3,*.P<0.05,**.P<0.01 A. Tracing of cell movement trajectory in 24 hour continuous intervention conditions (The trajectory of cell movement is dynamically simulated by computer, and different colors are used to distinguish individual cells, 40×); B. 24 h Mean motion speed of cells in different intervention conditions; C. Cell displacement distance in different intervention conditions within 24 hours; D. Cell movement distance in different intervention conditions within 24 hours; n=3,*.P<0.05,**.P<0.01圖2 黃芪對低氧環(huán)境中BMSCs運動能力學影響Fig.2 Effects of Astragalus membranaceus on the movement ability of BMSCs in hypoxic environments

2.3 黃芪對低氧環(huán)境中BMSCs線粒體膜電位的影響

線粒體是為細胞提供能量的關鍵細胞器,缺氧易導致線粒體受損,并引起細胞的活力減弱,因此本研究通過JC-10熒光探針對線粒體膜電位的標記,來評價不同干預條件下線粒體的活性。當線粒體膜電位較高時,JC-10聚集在線粒體的基質中,形成聚合物,為橘紅色熒光(594 nm);當線粒體膜電位降低時,JC-10不能聚集在線粒體基質中,此時JC-10為單體,主要為綠色熒光(488 nm)。Ctrl組細胞胞質中有大量橘紅色JC-10聚合物,綠色JC-10單體較少;與Ctrl組細胞相比,M組細胞線粒體膜電位降低明顯,細胞胞質中橘紅色JC-10聚合物減少,綠色JC-10單體明顯增多;與M組相比,HQ各劑量組細胞線粒體膜電位均有所升高,細胞胞質中橘紅色JC-10聚合物增多,綠色JC-10單體減少(圖3)。提示缺氧可能通過影響線粒體活性導致BMSCs增殖和運動狀態(tài)異常,而黃芪凍干粉能夠一定程度上維持缺氧環(huán)境中BMSCs線粒體活性。

2.4 黃芪對低氧環(huán)境中BMSCs p-PI3K和p-AKT蛋白熒光表達的影響

為了證實黃芪凍干粉溶液對BMSCs的調節(jié)作用是否與PI3K-AKT信號通路相關,本研究通過免疫熒光檢測了通路中關鍵蛋白p-PI3K和p-AKT的熒光表達情況。與Ctrl組細胞相比,M組細胞對p-PI3K和p-AKT蛋白的熒光表達降低(圖4、5);與M組相比,HQ各劑量組細胞p-PI3K和p-AKT蛋白的熒光表達升高,其中HQ-Z和HQ-G組升高更明顯(P<0.05或0.01)(圖4、5)。以上結果提示,缺氧條件抑制了PI3K-AKT信號通路中關鍵蛋白PI3K和AKT蛋白的磷酸化,而黃芪凍干粉溶液具有一定的逆轉作用,因此,黃芪可能通過恢復PI3K-AKT信號通路的活化發(fā)揮對BMSCs的調節(jié)作用。但蛋白的磷酸化修飾不能完全代表信號通路的活化,仍然需要進一步檢測。

JC-10聚合物發(fā)橘紅色熒光(594 nm),JC-10單體發(fā)綠色熒光(488 nm) JC-10 polymer emits orange red fluorescence (594 nm), while JC-10 monomer emits green fluorescence (488 nm)圖3 不同干預條件下細胞線粒體膜電位情況(60×)Fig.3 Membrane potential of cell mitochondria under different intervention conditions (60×)

A. 不同干預條件下細胞p-PI3K蛋白熒光表達情況,細胞核用藍色DAPI標記(405 nm),p-PI3K蛋白用AF 647標記(647 nm);B. 不同干預條件下細胞p-PI3K蛋白熒光表達值(n=3),*.P<0.05,**.P<0.01 A. Fluorescence expression of p-PI3K protein in cells under different intervention conditions, the nucleus was labeled with blue DAPI (405 nm), the p-PI3K protein was labeled with AF 647 (647 nm); B. Fluorescence expression values of p-PI3K protein in cells under different intervention conditions (n=3),*.P<0.05,**.P<0.01圖4 黃芪對低氧環(huán)境中BMSCs p-PI3K蛋白熒光表達的影響Fig.4 The effect of Astragalus membranaceus on the fluorescence expression of p-PI3K protein in BMSCs in hypoxic environments

2.5 黃芪對低氧環(huán)境中BMSCs PI3K和AKT mRNA表達水平的影響

上述試驗證實了黃芪凍干粉能夠促進PI3K和AKT的磷酸化,提示黃芪凍干粉可能具有激活PI3K-AKT信號通路作用,為進一步驗證,本研究進檢測了黃芪凍干粉溶液對PI3K和AKT在轉錄水平的變化情況。與Ctrl組細胞相比,M組細胞PI3K和AKT mRNA水平降低(圖6、7);但與M組相比,HQ各組細胞PI3K和AKT mRNA水升高(P<0.05或0.01)。以上結果提示,黃芪當干粉不僅能夠促進PI3K和AKT的mRNA水平,還能促進其發(fā)生磷酸化,證明了黃芪凍干粉對PI3K-AKT信號通路的調節(jié)作用。

A. 不同干預條件下細胞p-AKT蛋白熒光表達情況;細胞核用藍色DAPI標記(405 nm),p-AKT蛋白用AF 647標記(647 nm);B. 不同干預條件下細胞p-AKT蛋白熒光值(n=3),*.P<0.05,**.P<0.01 A. Fluorescence expression of p-AKT protein in cells in different intervention conditions, The nucleus was labeled with blue DAPI (405 nm); The p-AKT protein was labeled with AF 647 (647 nm); B. Fluorescence values of p-AKT protein in cells under different intervention conditions (n=3),*.P<0.05,**.P<0.01圖5 黃芪對低氧環(huán)境中BMSCs p-AKT蛋白熒光表達的影響Fig.5 The effect of Astragalus membranaceus on the fluorescence expression of p-AKT protein in BMSCs in hypoxic environments

n=3,*.P<0.05,**.P<0.01圖6 不同干預條件下細胞PI3K mRNA表達情況Fig.6 Expression of PI3K mRNA in cells under different intervention conditions

n=3,*.P<0.05,**.P<0.01圖7 不同干預條件下細胞AKT mRNA表達情況Fig.7 Expression of AKT mRNA in cells under different intervention conditions

3 討 論

課題組在前期研究中已經證實,缺氧會導致BMSCs的自我更新和多向分化的能力降低,本研究希望基于線粒體途徑探討黃芪在維護缺氧條件下的BMSCs增殖活性的作用。

黃芪作為補氣類中藥,具有健脾補中,升陽舉陷,益衛(wèi)固表的功效,對脾氣虧虛等疾病具有很好的調節(jié)作用?，F代研究也發(fā)現,黃芪及其有效成分針對缺氧所介導的相關疾病具有很好的防治作用。趙芳等[8]發(fā)現黃芪甲苷能通過calpain-1/NO信號通路改善慢性間歇性缺氧誘導血管內皮功能障礙;謝耀錕等[9]發(fā)現黃芪注射液可有效通過提升Bcl-2/Bax比值來抑制缺氧的神經細胞凋亡;黃芪多糖能夠通過抑制KLF5/HIF-1α信號通路保護低氧誘導的肺動脈高壓小鼠肺血管重構[10]。為了進一步探討具有補氣作用的黃芪是否對缺氧環(huán)境中的BMSCs的增殖活性具有保護作用,作者對BMSCs的增殖和運動情況進行了24 h的無標記動態(tài)監(jiān)測,發(fā)現黃芪凍干粉溶液能夠維持缺氧環(huán)境中BMSCs的增殖和運動的活性。

線粒體是細胞進行氧化代謝的主要細胞器,也是能量物質氧化釋放能量的場所。線粒體負責的最終氧化的共同途徑是三羧酸循環(huán)與氧化磷酸化,利用這些物質還原氧氣釋放能量合成ATP[11-12]。線粒體是產生能量維持細胞增殖的關鍵場所[13]。盡管前期已有研究發(fā)現黃芪注射液能夠促進體外培養(yǎng)的hMSCs的增殖[14],但未對其調節(jié)機制有詳細的闡明。本研究推測黃芪可能通過調節(jié)線粒體活性進而影響B(tài)MSCs的增殖和運動。通過線粒體膜電位檢測發(fā)現,黃芪干預后線粒體活性明顯增強,基本證實了作者的推測。

PI3K/AKT信號通路在缺氧引起的線粒體損傷過程中扮演者重要的角色[15-17]。有研究報道,血小板生成素通過活化PI3K/AKT通路穩(wěn)定線粒體膜電位防止化學性缺氧所致的細胞凋亡作用[18];白扁豆多糖可通過PI3K/AKT信號轉導通路穩(wěn)定線粒體膜電位、抑制神經細胞的缺氧性凋亡[19]。本研究也發(fā)現,黃芪凍干粉溶液能夠激活缺氧環(huán)境中的PI3K/AKT信號通路,因此,PI3K/AKT信號通路可能是黃芪穩(wěn)定缺氧環(huán)境中BMSCs線粒體活性,維持其增殖穩(wěn)定的主要機制。

盡管本研究證實了黃芪可以激活PI3K-AKT信號通路,同時維持缺氧環(huán)境中BMSCs增殖活性穩(wěn)定,但是,PI3K-AKT信號通路是否是黃芪防護缺氧環(huán)境中BMSCs增殖活性的關鍵通路仍然需要通過敲減或過表達試驗去進一步證實,但黃芪仍然值得被作為維護缺氧條件下干細胞生物穩(wěn)定性的天然化合物進行深入的研究。

4 結 論

缺氧環(huán)境會導致BMSCs增殖和運動能力降低,而黃芪可能通過激活PI3K-AKT信號通路維持缺氧環(huán)境中BMSCs增殖活性穩(wěn)定。