付昆，楊艷，陸一菱，仲蓬，趙嵐，徐敏（成都市第三人民醫(yī)院，西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院，四川 成都 610031）

哮喘是全世界最流行的慢性呼吸道疾病，其患病率是慢性阻塞性肺病的兩倍[1]。近年來，哮喘的發(fā)病率呈上升趨勢，已經(jīng)成為危害人類生命健康的世界性公共衛(wèi)生問題之一。祖國醫(yī)學(xué)采用中醫(yī)藥防治哮喘積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，通過多種途徑的治療方法，取得了良好的治療效果。穴位貼敷法是其中一種中醫(yī)外治的方法。清代醫(yī)家張璐的“白芥子涂方”被后世醫(yī)家視為穴位貼敷治療支氣管哮喘和支氣管炎的經(jīng)典方法而一直沿用至今，我院開展的伏九貼敷也是在此基礎(chǔ)上加減而來，由白芥子、甘遂、延胡索、細(xì)辛組成。該法通過藥物和腧穴共同作用防治哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病。課題組前期研究[2]亦證實(shí)其對哮喘動物模型的肺組織炎癥和免疫失調(diào)有明顯的抑制作用，本研究擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示其防治哮喘的作用機(jī)理，對哮喘的臨床治療意義重大。

1 材料與方法

1.1 動物SD 大鼠SPF 級雄性，體質(zhì)量（160±10）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號：110322220102332836，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008。動物飼養(yǎng)于四川生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，動物使用許可證號：SYXK（川）2020-199。動物飼養(yǎng)條件：自由進(jìn)食、飲水，動物房溫度：（23±2）℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)四川生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院動物管理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：[2022]S-156。

1.2 藥物芥子、炒芥子、醋延胡索、醋甘遂、細(xì)辛、生姜均從四川省中藥飲片有限責(zé)任公司購買，批號分別為：211218、220108、220427、211213、220518、220521。將炒芥子∶醋延胡索∶醋甘遂∶細(xì)辛按2（生、炒各半）∶1∶1∶1 比例粉碎為細(xì)粉，過120目篩網(wǎng)混合，以新鮮生姜汁調(diào)成糊狀制成伏九貼敷藥物備用。地塞米松磷酸鈉注射液，遂成藥業(yè)股份有限公司，批號：22206071。

1.3 主要試劑Al（OH）3購于成都科隆化學(xué)品有限公司，批號：2021010801，用0.9%生理鹽水配成10%佐劑備用。卵清蛋白（OVA）來自美國Solarbio 公司，貨號：516S051，稱取1 g OVA 溶于10%佐劑10 mL中，充分溶解備用；另將100 mg OVA 溶于生理鹽水溶液10 mL中，充分溶解，即得1% OVA 溶液。枸櫞酸抗原修復(fù)液（pH6.0）、Protein Phosphatase Inhibitor、Anti-IL-17 Rabbit pAb（稀釋比1∶50），均購自武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號分別為：G1201、G2007-1ML、GB11110-1；Flow cytometry Staining buffer、Fix & Perm Kit、Anti-Rat CD25APC（Clone：OX39），杭州聯(lián)科生物，批號：10432、A11224、AR02505；Rabbit Anti-Foxp3 antibody，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-10211R，稀釋比1∶100；Goat Anti-Rabbit IgG HRP，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號：GAR007，稀釋比1∶200；FITC Anti-Rat CD4（domain 1）Antibody、EF Red 780 Anti-Rat CD3 Antibody和PerCP/Cyanine5.5 Anti-Rat CD8a Antibody，武漢Elabscience 生物科技有限公司，貨號分別為：E-AB-F1105C、E-AB-F1228S、E-AB-F1098J；Foxp3 Monoclonal Antibody（FJK-16s）PE、Anti-Mo/Rt IL-17 PE，美國eBioscience 公司，貨號分別為：12-5773-82、12-7177-81；BCA 試劑盒，安徽Biosharp公司，貨號：BL521A；DAB顯色劑，北京Solarbio公司，貨號：DA1016；Beta Actin-Ab，江蘇Affinity生物公司，貨號：AF7018，稀釋比1∶5 000；Rabbit Polyclonal to IL-2、IL-6、Phospho-STAT3、STAT3、Phospho-STAT5、STAT5 Ab，均來自美國Affinity 生物公司，貨號分別為：DF6095、DF6087、AF3293、AF6294、AF3305、AF6305，抗體稀釋比均為1∶1 000。

1.4 主要儀器2202030602型霧化機(jī)，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；DM0412S 低速離心機(jī)、D3024R臺式高速冷凍離心機(jī)，美國SCILOGEX 公司；STP420 ES 組織脫水機(jī)、HM325 切片機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific 公司；JB-P5 包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司；Pannoramic SCANⅡ病理切片掃描儀，匈牙利3DHISTECH Kft 公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀，美國Beckman coulter 公司；PowerPac Basic 電泳儀，美國Bio-Rad Laboratories 公司；μQuant 光譜儀，美國伯騰BioTek 公司；ChemiScope 6100 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、ChemiScope 圖像采集分析軟件，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.5 動物模型制備參考有關(guān)研究[3]方法，并進(jìn)行改良后制備哮喘大鼠模型。于實(shí)驗(yàn)第1、7 天向大鼠腹腔注射含OVA（100 mg）、氫氧化鋁（100 mg）的混合液1 mL 致敏。第15 天開始每天給予1% OVA 霧化激發(fā)，每天1 次，每次20 min，連續(xù)7 d。密切觀察大鼠激發(fā)后的反應(yīng)情況，以大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸頻率加快、幅度加大、點(diǎn)頭呼吸運(yùn)動、腹肌痙攣、頻繁撓鼻等典型哮喘樣癥狀為激發(fā)成功。

1.6 分組、給藥及標(biāo)本采集將SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、假貼敷組、伏九貼敷組和地塞米松組，每組8只。除正常組外的各組大鼠均按“1.5”項(xiàng)下方法制備模型。正常組按同法在第1 天和第7 天時，于大鼠腹腔注射生理鹽水1 mL；從第15 天開始，同法給予生理鹽水霧化吸入，連續(xù)7 d。末次霧化結(jié)束后，假貼敷組和伏九貼敷組對取穴部位進(jìn)行脫毛，第2天取調(diào)制好的伏九貼敷藥物切成1 cm×1 cm，厚約0.3 cm 的塊狀，按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]取穴方法敷于伏九貼敷組大鼠大椎、肺俞（雙側(cè)）、腎俞（雙側(cè)）穴并用膠布固定，假貼敷組同樣位置貼上無藥空白膠布，均每次貼敷4 h，隔日貼敷1 次，持續(xù)14 d；地塞米松組大鼠腹腔注射地塞米松0.5 mg·kg-1，隔日1 次，共7 次；正常組和模型組不做任何處理。末次給藥后第二天，腹主動脈取血處死，血液室溫靜置20 min，以3 500 r·min-1離心10 min（離心半徑6 cm），分離血清，-20 ℃保存；分離肺組織，取右肺，-80 ℃保存。

1.7 肺組織中Th17 細(xì)胞因子IL-17 和Treg 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 陽性表達(dá)的檢測取右肺4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片；脫蠟至水；檸檬酸修復(fù)緩沖液抗原修復(fù)；放入3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；3%山羊血清封閉；滴加按工作稀釋比配好的一抗4 ℃孵育過夜；復(fù)溫10 min，滴加相應(yīng)種屬的二抗（HRP 標(biāo)記，1∶200），37 ℃孵育30 min，顯色；復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片。顯微鏡鏡檢，隨機(jī)選取200 倍視野進(jìn)行拍照，Image-pro plus 6.0（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA）進(jìn)行圖像采集分析，得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度值（average optical density，AOD 值），AOD=IOD/AREA。AOD值越大表明陽性表達(dá)水平越高。

1.8 外周血中Th17、Treg 細(xì)胞比例的檢測

1.8.1 Th17 細(xì)胞檢測 取125 μL 肝素抗凝血至流式管中，加入125 μL 不含血清的培養(yǎng)基和1 μL PMA/Ionomycin Mixture（250×）和1 μL BFA/Monensin Mix?ture（250×）。以125 μL 抗凝血和125 μL 不含血清的培養(yǎng)基作為對照?；靹?，37 ℃孵育4 h。然后取100 μL轉(zhuǎn)移至新的流式管中，加入5 μL ER780 Anti-Rat CD3 Antibody和5 μL PerCP/Cyanine5.5 Anti-Rat CD8a An?tibody室溫避光孵育15 min。加入100 μL固定破膜劑A 孵育破膜15 min，加入2 mL 流式染色緩沖液，以300×g離心5 min，棄上清。加入100 μL 固定破膜劑B 和5 μL Anti-Mo/Rt IL-17 PE 再次孵育15 min，離心，去上清。加入500 μL 染色緩沖液重懸后上機(jī)檢測。

1.8.2 Treg 細(xì)胞檢測 取100 μL 肝素抗凝血于流式管中，加入5 μL FITC-CD4 抗體和5 μL CD25-APC 抗體，4 ℃避光孵育30 min。加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液4 ℃避光孵育10 min；裂解后加入10 mL 的PBS 終止裂解，以4 ℃、300×g離心5 min，棄上清。用1 mL固定破膜劑室溫孵育30 min，然后加入2 mL 破膜緩沖液終止破膜，4 ℃、300×g離心5 min，去上清。用100 μL 破膜緩沖液重懸沉淀，細(xì)胞懸液中加入2 μL正常大鼠血清進(jìn)行阻斷，再加入5 μL Foxp3-PE mAb孵育至少30 min，離心，棄上清。以500 μL 染色緩沖液重懸，上機(jī)檢測。

1.9 肺組織中IL-6、IL-2、STAT3、p-STAT3、STAT5、p-STAT5 蛋白量的檢測肺組織用RIPA勻漿裂解，提取總蛋白，以4 ℃、12 000×g離心5 min，收集上清。BCA 法測定蛋白濃度。取蛋白樣品加入相應(yīng)量的5×SDS 上樣緩沖液，120 V 電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1 h。用5%的脫脂牛奶（TBST 配制），封閉1 h，按工作稀釋比加入一抗，室溫孵育3 h。用TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入稀釋好的二抗，室溫孵育1 h后再次洗膜3 次，然后用ECL 發(fā)光底物顯影。采集圖像，ChemiScope analysis軟件進(jìn)行灰度分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。所有計(jì)量資料服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間樣本均數(shù)采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較時如果方差齊采用LSD 檢驗(yàn)；方差不齊則用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。以P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織IL-17 和Foxp3 的陽性表達(dá)見圖1、圖2。肺組織切片免疫組化染色細(xì)胞核為藍(lán)色，目的蛋白的陽性表達(dá)顯棕黃色。造模后，較之正常組，哮喘模型組IL-17 高表達(dá)，平均光密度值（AOD 值）比正常對照組升高（P＜0.01）；而Foxp3 則低表達(dá)，AOD 值則比正常組降低（P＜0.01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)治療后，與模型組比較，伏九貼敷組和地塞米松組大鼠IL-17 的AOD 值明顯降低（P＜0.01），F(xiàn)oxp3 的AOD 值明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），表明伏九貼敷藥物和地塞米松使得哮喘大鼠肺中IL-17 的陽性表達(dá)量減少，而Foxp3 的陽性表達(dá)量增加。假貼敷組與模型組比較，兩個指標(biāo)的AOD值的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織中IL-17 的陽性表達(dá)（×200；±s，n=6）Figure 1 Positive expression of IL-17 assessed by immunohistochemistry in lung tissues of rats in each group（×200；±s，n=6）

圖2 各組大鼠肺組織中Foxp3 的陽性表達(dá)（×200；±s，n=6）Figure 2 Positive expression of Foxp3 assessed by immunohistochemistry in lung tissues of rats in various groups（×200；±s，n=6）

2.2 各組大鼠外周血中Th17 和Treg 細(xì)胞比例由圖3、圖4 可以看出，模型組大鼠血中Th17 細(xì)胞百分比較正常組大鼠明顯增加（P＜0.01），Treg 細(xì)胞百分比較正常組明顯減少（P＜0.01），提示哮喘大鼠出現(xiàn)Th17/Treg 向Th17 偏移的現(xiàn)象。藥物干預(yù)后，伏九貼敷組和地塞米松組大鼠血中Th17 細(xì)胞比例較模型組降低（P＜0.01），而Treg細(xì)胞百分比較模型組升高（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。假貼敷組與模型組比較，Th17 和Treg 細(xì)胞所占比例的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明未加藥的空白膠布貼敷對哮喘大鼠Th17/Treg細(xì)胞比例沒有影響。

圖3 各組大鼠外周血中Th17 細(xì)胞百分比（±s，n=6）Figure 3 Percentage of Th17 cells detected by flow cytometry in peripheral blood of rats in different group（±s，n=6）

圖4 各組大鼠外周血中Treg 細(xì)胞百分比（±s，n=6）Figure 4 Percentage of Treg cells detected by flow cytometry in peripheral blood of rats in each group（±s，n=6）

2.3 各組大鼠肺組織IL-6/STAT3 和IL-2/STAT5

通路相關(guān)蛋白表達(dá)如圖5 顯示，模型組大鼠肺中IL-6、p-STAT3相對蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對照組（P＜0.01），而IL-2、p-STAT5 相對表達(dá)水平明顯低于正常組（P＜0.01）。給藥后，與模型組比較，伏九貼敷和地塞米松組的IL-6、p-STAT3 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；伏九貼敷組IL-2 和p-STAT5 的表達(dá)水平明顯增高（P＜0.01），但地塞米松組IL-2 和p-STAT5 的表達(dá)較模型組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。假貼敷組較之模型組，各指標(biāo)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，STAT3 和STAT5 總蛋白的表達(dá)水平各組間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 各組大鼠肺組織IL-6、IL-2、STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5 的相對蛋白表達(dá)（±s，n=3）Figure 5 Relative protein expression of IL-6，IL-2，STAT3，STAT5，p-STAT3 and p-STAT5 analyzed with Western Blot in lung tissues of rats in each group（±s，n=3）

3 討論

哮喘一直是現(xiàn)今社會一個主要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，影響著全球近3.5 億人，其患病率正在穩(wěn)步上升[5]。哮喘的特點(diǎn)表現(xiàn)為伴隨氣道炎癥的支氣管高反應(yīng)性，屬于2型免疫反應(yīng)[6-7]，其病因多種多樣，病理生理復(fù)雜。人們普遍認(rèn)為許多免疫細(xì)胞，特別是活化的T細(xì)胞亞型，釋放細(xì)胞因子并共同作用，導(dǎo)致哮喘的主要癥狀[8]。輔助T（Helper T，Th）細(xì)胞在免疫功能紊亂中起著至關(guān)重要的作用，它促進(jìn)了哮喘的發(fā)展[9]。曾經(jīng)的主流觀點(diǎn)一度認(rèn)為Th2 優(yōu)勢分化的Th1/Th2 失衡是哮喘發(fā)病的一個重要的免疫學(xué)機(jī)制。然而Th 細(xì)胞類型眾多，取決于微環(huán)境中的細(xì)胞因子，原生CD4+T 細(xì)胞可以分化為不同的效應(yīng)亞群，如Th1、Th2、Th17 細(xì)胞[10]。我們對CD4+T 細(xì)胞分化的認(rèn)識已經(jīng)發(fā)生了明顯的變化，新的亞群，如CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+T reguLatory cell，Treg）也逐漸被認(rèn)知[11]。近年來，Th17 和Treg 的發(fā)現(xiàn)使得現(xiàn)有的Th1/Th2 平衡模式并不能完全解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制，這也拓寬了我們對過敏性疾病致病機(jī)理的理解[12]。Th17細(xì)胞是與以Th2 為主的變態(tài)反應(yīng)性疾病息息相關(guān)的，在哮喘、過敏性鼻炎等疾病中均發(fā)現(xiàn)Th17 應(yīng)答增強(qiáng)[13-14]。Treg 細(xì)胞作為自身免疫疾病的負(fù)調(diào)控因子，在維持自我耐受性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子TGF-β 和IL-10，防止炎癥浸潤和組織損傷[15]，對抑制過敏性哮喘炎癥至關(guān)重要[7]。由此可見，Th17 和Treg 細(xì)胞的平衡對維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用，Th17/Treg 的失衡也是哮喘發(fā)病機(jī)制的重要病理生理基礎(chǔ)。因此，恢復(fù)Th17/Treg 免疫平衡是治療哮喘的關(guān)鍵，目前已成為研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本研究以O(shè)VA+Al（OH）3聯(lián)合致敏復(fù)制大鼠哮喘模型，造模后流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠外周血中Th17細(xì)胞百分比升高，而Treg細(xì)胞百分比下降，出現(xiàn)了Th17 分化占優(yōu)的Th17/Treg 失衡現(xiàn)象。給藥后，伏九貼敷藥物使得大鼠血中Th17、Treg 細(xì)胞比例一降、一升，促進(jìn)Th17/Treg 細(xì)胞趨于平衡，從而使哮喘大鼠Th17/Treg 失衡狀態(tài)得到一定的糾正。但是，伏九貼敷藥物重塑Th17/Treg 平衡的具體機(jī)制尚不明確，本研究試圖以IL-6/STAT3 和IL-2/STAT5信號通路為切入點(diǎn)進(jìn)一步探索伏九貼敷藥物調(diào)控Th17/Treg免疫平衡的抗哮喘作用機(jī)制。

CD4+T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞的分化依賴于細(xì)胞因子的類型和數(shù)量（或暴露于細(xì)胞因子的程度）[16]?；罨腃D4+T 細(xì)胞能分泌細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β 和IL-6[17]。多效性細(xì)胞因子IL-6 對于Th17 細(xì)胞的分化以及致病性Th17 和保護(hù)性Treg 之間的平衡至關(guān)重要[18]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是一種潛在的轉(zhuǎn)錄因子，通過與細(xì)胞表面的多肽受體相互作用來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號。翻譯后主要通過酪氨酸磷酸化激活，形成STAT3 二聚體，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與靶基因的序列特異性DNA 元素結(jié)合而持續(xù)表達(dá)[19]。IL-6 可驅(qū)動STAT3 的磷酸化，進(jìn)而激活Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子維A 酸相關(guān)孤兒受體γt（retinoic acid related orphan receptor γt，RORγt），最終促進(jìn)Th17分化[20]。由此可見，IL-6/STAT3 信號通路在誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化中扮演著重要角色。

在抗原的刺激和激活下，Th17 細(xì)胞分泌促炎因子，如IL-17，它參與了成纖維細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和活化，也參與了IL-8/CXCL-1 趨化因子的釋放，這些都利于造成氣道重塑損傷和氣道高反應(yīng)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，并吸引中性粒細(xì)胞進(jìn)入氣道[21]?；谠絹碓蕉嗟膱?bào)道Th17 細(xì)胞與哮喘炎癥反應(yīng)有關(guān)的證據(jù)，我們研究了在伏九貼敷治療過程中伏九貼敷藥物對Th17 細(xì)胞分化的影響。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)伏九貼敷藥物顯著抑制了細(xì)胞因子IL-6 的表達(dá)，使得STAT3（Th17 細(xì)胞中的一種主要轉(zhuǎn)錄因子）磷酸化驅(qū)動不足，p-STAT3 表達(dá)被抑制，不能正?；罨疪ORγt 受體以誘導(dǎo)Th17 分化。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了伏九貼敷藥物可以通過抑制Th17 的轉(zhuǎn)錄來抑制Th17 細(xì)胞的分化，而促炎因子IL-17 的陽性表達(dá)數(shù)量亦隨之減少，這些都有助于哮喘炎癥反應(yīng)的緩解。

與Th17 相反，Treg 細(xì)胞是免疫耐受和預(yù)防自身免疫性疾病的主要參與者。在各種炎癥和自身免疫性疾病中，Treg的數(shù)量和活性降低。正是鑒于Treg細(xì)胞在控制免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的分化已被推薦作為治療和限制自身免疫性和慢性炎癥性疾病的一種方法[22]。Tregs 特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒P3（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）是Treg 分化和功能的主要調(diào)節(jié)器。Foxp3 缺乏可導(dǎo)致全身性自身免疫[23]。多種分子涉及Treg 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制機(jī)制，包括IL-2 和TGF-β。IL-2 是參與控制Treg 細(xì)胞存活，并維持其功能和穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細(xì)胞因子[24]。Treg 高表達(dá)高親和力IL-2受體（IL-2R），當(dāng)IL-2與IL-2R結(jié)合時，誘導(dǎo)信號級聯(lián)反應(yīng)，引起轉(zhuǎn)錄因子STAT5 的磷酸化和激活[25]。既往研究[26]就有報(bào)道，IL-2 通過STAT5 信號通路調(diào)控人CD4+CD25+Treg 細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)，并參與外周Treg 細(xì)胞的生成、功能和穩(wěn)定。Park 等[27]也指出人參能上調(diào)環(huán)孢霉素處理的脾細(xì)胞中的STAT5 磷酸化水平以促使Treg 分化。從這些證據(jù)可以看出，STAT5 信號通路通過促進(jìn)Foxp3 的表達(dá)并抑制IL-17 等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生影響T 細(xì)胞分化和免疫穩(wěn)態(tài)[28]。近年來，有研究[29]提出了Th17 細(xì)胞和Treg 相互調(diào)控的一個競爭模型，在該模型中，STAT3和STAT5的相對激活直接決定了CD4+T細(xì)胞中IL-17的產(chǎn)生結(jié)果。該項(xiàng)研究指出STAT3 和STAT5 都是與編碼IL-17 的位置上的多個共同位點(diǎn)結(jié)合的，并且IL-2 誘導(dǎo)的STAT5 和這些位點(diǎn)的結(jié)合是和STAT3 在這些位點(diǎn)的結(jié)合較少有關(guān)。因此，抑制STAT3 的治療藥物可能同時上調(diào)STAT5 表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，伏九貼敷藥物治療后使得哮喘大鼠肺組織中IL-2 表達(dá)增加，提高了STAT5（Tregs 中的一種轉(zhuǎn)錄因子）磷酸化水平，p-STAT5 表達(dá)上調(diào)，同時，F(xiàn)oxp3 的陽性表達(dá)量也升高了。Foxp3 和STAT5 都是Treg 細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們的表達(dá)上調(diào)增加了表達(dá)Foxp3 和STAT5 的Treg 細(xì)胞比例，減少的CD4+CD25+Foxp3+Treg 群體的表達(dá)得以恢復(fù)，而哮喘大鼠中出現(xiàn)的Th17 優(yōu)勢分化被抑制，Th17/Treg 免疫細(xì)胞在伏九貼敷藥物作用下趨于平衡。上述結(jié)果表明，在伏九貼敷治療過程中伏九貼敷藥物通過相互調(diào)節(jié)Th17 和Treg細(xì)胞而取得有益抗哮喘的效果。

綜上所述，伏九貼敷藥物通過調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡增強(qiáng)機(jī)體免疫耐受，減輕大鼠對哮喘的免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮抗哮喘效應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制IL-6/STAT3 信號通路，減少Th17 免疫細(xì)胞分化；同時激活I(lǐng)L-2/STAT5 通路，促進(jìn)Treg 細(xì)胞分化有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為伏九貼敷療法有效緩解哮喘癥狀，減少發(fā)作次數(shù)，增強(qiáng)患者抵抗力的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。