王道滇, 魏光強(qiáng), 陶繼芳, 李 祥, 趙興文, 黃艾祥,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 云南 昆明 650201;2.云南東恒經(jīng)貿(mào)集團(tuán)有限公司, 云南 曲靖 655000;3.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品工程學(xué)院, 云南 大理 671000)

糖尿病主要通過(guò)口服阿卡波糖、磺脲類(lèi)和雙胍類(lèi)藥物進(jìn)行治療。然而,長(zhǎng)期服用阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑會(huì)使患者出現(xiàn)肝損傷和腸絞痛等副作用[1]。食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽因較高的酶親和力、特異性、低免疫原性和低毒性備受關(guān)注[2]。目前,許多研究已經(jīng)從各種食品中分離和鑒定出α-葡萄糖苷酶抑制肽。例如:Zhao等[3]從牛乳酪蛋白中鑒定出4條α-葡萄糖苷酶抑制肽;Hu等[4]從米糠皮中鑒定到一條穩(wěn)定性較好的α-葡萄糖苷酶抑制肽GLLGY;Yang等[5]利用分子對(duì)接篩選技術(shù),從熱壓榨花生粕蛋白中鑒定出4條α-葡萄糖苷酶抑制肽。同時(shí),也有從干腌肉制品中分離和鑒定α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究。例如Mora等[6]從伊比利亞干腌火腿中鑒定出2條α-葡萄糖苷酶抑制肽,黃晶晶等[7]從皖浙花豬干腌火腿中鑒定出3條α-葡萄糖苷酶抑制肽。這說(shuō)明干腌火腿可能是天然α-葡萄糖苷酶抑制肽的來(lái)源。目前,干腌火腿α-葡萄糖苷酶抑制肽的制備、鑒定和活性機(jī)制表征方面的相關(guān)研究較少,有待進(jìn)一步加強(qiáng);而且,不同的原料、加工環(huán)境及加工工藝都可能導(dǎo)致火腿肽譜及其生物活性的不同。因此,有必要對(duì)干腌火腿中肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行深入研究,以提供更多、更高抑制活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽,擴(kuò)大α-葡萄糖苷酶抑制肽的來(lái)源。

大河烏豬是由云南本地的大河豬與“杜洛克”公豬雜交育成的國(guó)家級(jí)新品種豬,2003年被授予國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志產(chǎn)品(產(chǎn)品編號(hào):AGI01438)[8]。目前,大河烏豬已被用于云南傳統(tǒng)干腌火腿的加工。前期研究,我們通過(guò)代謝組學(xué)明確了大河烏豬火腿的脂肪酸譜和特征風(fēng)味物質(zhì),結(jié)果表明,大河烏豬火腿具有比三元雜交豬火腿更好的風(fēng)味品質(zhì)和滋味口感[9]。然而,大河烏豬火腿中是否存在生物活性肽尚不清楚,進(jìn)一步探究大河烏豬火腿的肽譜,進(jìn)行大河烏豬火腿中α-葡萄糖苷酶抑制肽的挖掘和活性機(jī)制研究,對(duì)于完善大河烏豬火腿品質(zhì)的研究具有重要意義。

肽的分離和純化是一個(gè)復(fù)雜而耗時(shí)的過(guò)程。采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、在線數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、分子對(duì)接技術(shù)和構(gòu)效關(guān)系等生物信息學(xué)分析方法,結(jié)合體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),不僅能快速、高效、低成本地篩選出具有潛在生物活性的肽序列,還可以從分子結(jié)構(gòu)層面揭示肽的活性機(jī)制[10-13]。本研究擬采用超濾分離的方法,從大河烏豬火腿中制備不同分子質(zhì)量的火腿肽,測(cè)定其α-葡萄糖苷酶抑制活性,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectro-metry,LC-MS/MS)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法挖掘出大河烏豬火腿中新型的α-葡萄糖苷酶抑制肽,探究其穩(wěn)定性和分子作用機(jī)制,以期為大河烏豬火腿肽的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大河烏豬火腿[(10±1) kg],云南東恒經(jīng)貿(mào)集團(tuán)有限公司提供。甲醇、乙腈、甲酸,德國(guó)默克公司;α-葡萄糖苷酶(700 000 U/mL),上海源葉生物科技有限公司;對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG),上海寶曼生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA),上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;胰酪蛋白胨,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;硼砂,天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;哌啶(6-氫吡啶),西隴科學(xué)股份有限公司;樹(shù)脂,吉爾生化(上海)有限公司;二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、吡啶,上海強(qiáng)盛化工有限公司;氨基酸,南京肽業(yè)生物科技有限公司;N,N-二異丙基乙胺、二異丙基碳二亞胺,蘇州昊帆生物股份有限公司;β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司;鹽酸、氫氧化鈉,天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。以上試劑除甲醇、乙腈、甲酸為色譜純外,其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-18N/A型真空冷凍干燥機(jī),上海比朗儀器制造有限公司;Millipore UFSC40001型超濾裝置,上海羽令過(guò)濾器材有限公司;Synergy H1型酶標(biāo)儀,美國(guó)Biotek公司;Q-Exactive型四極桿質(zhì)譜儀、Easy-nLC 1000型液相色譜儀,賽默飛世爾科技公司;豎行玻璃反應(yīng)器,上海積坤化工科技有限公司;Nano型高效液相色譜儀,上海賽梵科分離技術(shù)有限公司;Inertsil ODS-SP型液相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司;DAISOPAK型C18制備柱(250 mm×30 mm,8 μm),江蘇智潤(rùn)科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大河烏豬火腿的制備

參照Wei等[9]的方法制備大河烏豬火腿。將8月齡豬的新鮮后腿,在溫度為3 ℃,相對(duì)濕度為85%的環(huán)境下預(yù)冷排酸18 h,修割整形。在溫度為3 ℃,相對(duì)濕度為85%的環(huán)境下,按每只鮮腿質(zhì)量的5.5%稱取食鹽,上鹽腌制18 d。在溫度為 8 ℃,相對(duì)濕度為55%的環(huán)境中進(jìn)行60 d的脫水平衡,最后在溫度為23 ℃、相對(duì)濕度為75%的環(huán)境下,進(jìn)行360 d的發(fā)酵產(chǎn)香,得到成熟火腿。將成熟火腿的半膜肌和股二頭肌按1∶1的比例混合進(jìn)行取樣,真空包裝,并保存在-20 ℃以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

1.3.2肽的提取和肽含量測(cè)定

火腿肽的提取參照Mora等[14]的方法略加修改。取制備的火腿,剔除脂肪、剪碎,用液氮充分研磨為火腿粉末。稱取50 g火腿粉末于200 mL 0.01 mol/L HCl中冰浴10 min,均質(zhì)勻漿3次,離心(4 ℃、8 000 r/min,30 min)。在上清液中加入3倍體積的甲醇溶液,4 ℃環(huán)境中冷藏20 h,再次離心除去蛋白質(zhì),收集上清液。將上清液經(jīng)0.45 μm油系膜過(guò)濾、旋蒸去除甲醇溶液,得到粗肽提取液。用3 kDa和10 kDa的超濾膜分離出分子質(zhì)量大于10 kDa、3～10 kDa和小于3 kDa的超濾液。將粗肽提取液和超濾液進(jìn)行冷凍干燥,保存于-80 ℃冰箱中備用。

根據(jù)邢路娟等[15]的方法,采用鄰苯二甲醛分光光度法測(cè)定質(zhì)量濃度為1 mg/mL粗提物和超濾組分樣品的肽含量。采用胰酪蛋白胨(0～1 mg/mL)作為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.771 5x+0.239,R2=0.998 9,y為吸光值,x為胰酪蛋白胨濃度);按式(1)計(jì)算測(cè)定樣品的肽含量。

(1)

式(1)中,A1表示經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的樣品中肽的質(zhì)量濃度,mg/mL;A2表示測(cè)定樣品的質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.3.3α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定

參照Z(yǔ)hao等[3]的方法略加修改。吸取100 μL樣品溶液、50 μL α-葡萄糖苷酶溶液(700 U/mL)到96孔板中,37 ℃下反應(yīng)20 min;加入50 μL 10 mmol/L對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液,混勻并在37 ℃下反應(yīng)30 min,通過(guò)添加50 μL 0.67 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。以100 μL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)替換樣品作為對(duì)照組,150 μL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液作為空白組,100 μL樣品溶液、50 μL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液作為樣品空白對(duì)照。使用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)量溶液的吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算方法見(jiàn)式(2)。

(2)

式(2)中,Ac表示對(duì)照組的吸光度;Ab表示空白組的吸光度;As表示樣品組的吸光度;An表示樣品空白對(duì)照的吸光度。

1.3.4肽的鑒定

參考劉問(wèn)[16]的方法對(duì)分子質(zhì)量小于3 kDa的火腿粗肽進(jìn)行LC-MS/MS分析。LC條件:將樣品溶解在Nano-HPLC緩沖液A中,進(jìn)行液相系統(tǒng)分離(緩沖液A液為0.1%的甲酸水溶液,B液為0.1%的甲酸-乙腈水溶液,其中乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡,樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到上樣柱[Acclaim PepMap nano-Viper C18型(100 μm×2 cm, 5 μm),賽默飛世爾科技公司],經(jīng)過(guò)分析柱[C18型(75 μm×10 cm,3 μm),賽默飛世爾科技公司]分離,流速為 300 nL/min,洗脫時(shí)間為 30 min。 MS條件:樣品經(jīng)色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)為60 min,檢測(cè)方式為正離子,母離子掃描范圍m/z為300～1 600,一級(jí)質(zhì)譜在m/z為200時(shí)的分辨率為70 000,自動(dòng)增益控制目標(biāo)為 1×106,一級(jí)最大注射時(shí)間為40 ms,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為 30 s。 多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比采集方法:每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜,二級(jí)質(zhì)譜激活類(lèi)型為高能碰撞解離,隔離窗寬度設(shè)置為m/z2,二級(jí)質(zhì)譜在m/z為200時(shí)的分辨率為17 500,微碎片圖譜數(shù)為1,二級(jí)注射時(shí)間為50 ms,規(guī)一化碰撞能量為 27 eV。 用Proteome Discoverer1.4軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)(uniprot-Sus-scrofa-122175-20220218)進(jìn)行肽的查庫(kù)鑒定和比對(duì)。

1.3.5活性肽序列的篩選

通過(guò)PeptideRanker系統(tǒng)(http:∥distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)對(duì)肽序列進(jìn)行評(píng)分,分?jǐn)?shù)越高(0～1),多肽具有生物活性的概率就越高。此外,采用PepDraw系統(tǒng)(https:∥pepdraw.com)評(píng)估了多肽在pH值為7時(shí)的凈電荷。通過(guò)ToxinPred服務(wù)器預(yù)測(cè)每條肽的潛在毒性和關(guān)鍵物理化學(xué)性質(zhì)。采用PEPTIDE 2.0(http:∥www.peptide2.com/N_peptide_hydrophobicity_hydrophilicity.php)評(píng)估肽的疏水性比例?；贐IOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥biochemia.uwm.edu.pl/)檢索已存在的α-葡萄糖苷酶抑制肽。

1.3.6肽的固相合成

采用體外Fmoc固相法,按照C端到N端的順序固相合成FELLKHQK、VATVSLPR、EALELLK、IIAPPERK、IEEALGDK 5條篩選出的肽序列。通過(guò)氨基酸連接反應(yīng)、肽鏈連接反應(yīng)和肽鏈剪切處理,制備出干燥的粗肽。采用高效液相色譜儀與高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用對(duì)化學(xué)合成獲得的粗肽進(jìn)行純化和檢測(cè)分析(純化條件:色譜柱以10%的乙腈水平衡5 min后,進(jìn)行梯度運(yùn)行;流動(dòng)相A為0.1% 三氟乙酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1% 三氟乙酸乙腈溶液,流速為12 mL/min),根據(jù)質(zhì)荷比檢測(cè)目標(biāo)肽的離子大小,判斷目標(biāo)多肽所在的峰域,將分析純度大于95%的樣品凍干,得到最終純品多肽。肽的合成在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.7肽IEEALGDK的穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.7.1 IEEALGDK熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定

1)IEEALGDK的熱穩(wěn)定性測(cè)定。配制質(zhì)量濃度為3 mg/mL的肽溶液,分別置于室溫(25 ℃)、40、60、80、100 ℃環(huán)境中保溫2 h,急速冷卻至室溫,評(píng)價(jià)其α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化。

2)IEEALGDK的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定。分別用pH值為3、5、7、9、11的水溶液將IEEALGDK稀釋至3 mg/mL;室溫振蕩反應(yīng)2 h,結(jié)束后調(diào)節(jié)樣品的pH值為7.0,評(píng)價(jià)其α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化。

1.3.7.2 IEEALGDK體外消化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照姚軼俊等[17]的方法略加修改。模擬胃消化:取適量肽溶解在NaHCO3(200 mmol/L,pH值為7.0)中,用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的胃蛋白酶,37 ℃條件下震蕩消化2 h,95 ℃水浴15 min滅酶。模擬腸消化:取滅酶后的胃消化液,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5,添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的胰蛋白酶,37 ℃下震蕩消化2 h,95 ℃水浴滅酶。將胃消化液和腸消化液分別冷凍干燥,配制質(zhì)量濃度為3 mg/mL的肽溶液,評(píng)價(jià)其α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化。

1.3.8分子對(duì)接模擬

使用AutoDock Vina 1.1.2軟件評(píng)估合成肽與α-葡萄糖苷酶的對(duì)接模式。α-葡萄糖苷酶(4J5T)的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)(https:∥www.rcsb.org/)。使用ChemBio2D Ultra 3.14軟件包預(yù)測(cè)肽的二維結(jié)構(gòu),經(jīng)ChemBio3D Ultra 3.14軟件轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)。α-葡萄糖苷酶的X射線結(jié)構(gòu)從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。肽被選為配體,酶被選為受體;在分子對(duì)接分析中,利用α-葡萄糖苷酶的X射線結(jié)構(gòu)確定的天然配體的位置被用作結(jié)合點(diǎn)。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行對(duì)接模擬。α-葡萄糖苷酶活性口袋的坐標(biāo)設(shè)置為center x:21.383,center y:14.226和center z:16.565;搜索空間坐標(biāo)設(shè)置為sizes x:15,size y:15和size z:15。將搜索精度設(shè)置為20。對(duì)接后,結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸側(cè)鏈可以根據(jù)配體的構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。根據(jù)評(píng)分選擇最佳結(jié)合模式進(jìn)行分析,用PyMol 1.7.6軟件(http:∥www.pymol.org/)繪圖和分析。

1.3.9火腿肽對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值測(cè)定

將樣品稀釋成不同的5個(gè)濃度梯度,采用1.3.3中式(2)的方法測(cè)定其α-葡萄糖苷酶抑制率,進(jìn)行非線性擬合,得出回歸方程,計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用IBM SPSS 25.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),用Duncan’s多重比較方法進(jìn)行平均值之間的差異顯著性分析;P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。采用Microsoft Excel 2010和Origin 2019b進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 火腿粗肽的肽含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

2.1.1肽含量分析

超濾可以截留大分子物質(zhì),有效地分離和富集出具有較高生物活性的低分子質(zhì)量肽段[3-5]。本研究通過(guò)超濾分離,制備不同分子質(zhì)量的火腿肽,采用鄰苯二甲醛法測(cè)定火腿提取物的肽含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,大河烏豬火腿粗提物中肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72.28%±1.65%,低于金華火腿(74.87%±15.44%)[15],這可能是因?yàn)榻鹑A火腿(30 d)比大河烏豬火腿(18 d)腌制時(shí)間長(zhǎng),導(dǎo)致金華火腿中蛋白質(zhì)水解得到的多肽含量更高[18]。經(jīng)超濾分離后,分子質(zhì)量小于3 kDa組分的肽含量顯著高于其他兩個(gè)組分(P<0.05),這說(shuō)明大河烏豬火腿中的肽主要以分子質(zhì)量小于3 kDa的短肽為主。Wang等[19]測(cè)定了成熟期10個(gè)月,分子質(zhì)量小于3 kDa的羊肉火腿和宣威火腿中肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.68%和4.34%,低于本研究中分子質(zhì)量小于3 kDa組分的肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(38.37%)。羊肉火腿和宣威火腿成熟期為10個(gè)月,大河烏豬火腿的成熟期為12個(gè)月。在本研究中,分子質(zhì)量小于3 kDa的大河烏豬火腿肽含量高于羊肉火腿和宣威火腿,這可能是因?yàn)榇蠛訛踟i火腿較長(zhǎng)的成熟期,導(dǎo)致火腿中的蛋白質(zhì)被內(nèi)源酶和肽酶更加充分地水解為小肽和游離氨基酸[20]。

表1 火腿提取物中的肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.1.2火腿粗肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

不同超濾組分,大河烏豬火腿肽對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的分析結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,分子質(zhì)量小于3 kDa組分肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率高于其他分離組分,這表明低分子質(zhì)量的火腿肽具有更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性。質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),分子質(zhì)量小于3 kDa組分肽的α-葡萄糖苷酶抑制率為66.90%,高于同等濃度下,皖浙花豬干腌火腿肽GPAGPQGPRG對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性(65.83%)[7]。本研究結(jié)果表明,分子質(zhì)量小于3 kDa組分的大河烏豬火腿肽具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖1 火腿粗肽組分的α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.1 Inhibitory rate of crude ham peptide on α-glucosidase

2.2 火腿肽的鑒定結(jié)果

采用LC-MS/MS鑒定了大河烏豬火腿中肽的氨基酸序列,分析結(jié)果見(jiàn)圖2。經(jīng)圖2(a)和數(shù)據(jù)庫(kù)(uniprot-Sus-scrofa-122175-20220218)比對(duì)分析,從大河烏豬火腿中鑒定出143條肽序列。由圖2(b)和圖2(c)可知,這些肽主要由6～15個(gè)氨基酸組成,以分子質(zhì)量小于1.5 kDa的短肽為主(76.92%)。通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將鑒定的肽進(jìn)行蛋白質(zhì)來(lái)源比對(duì)分析,大河烏豬火腿中的肽主要來(lái)源于肌球蛋白(32.09%)、肌鈣蛋白(12.69%)和 β-烯醇化酶(11.94%)[圖2(d)]。黃晶晶等[7]從皖浙花豬干腌火腿中鑒定出104條鏈長(zhǎng)為8～24個(gè)氨基酸的肽序列,其主要來(lái)源于平滑肌肌動(dòng)蛋白α2、肌球蛋白-4、I型膠原蛋白α1鏈、肌酸激酶、肌球蛋白輕鏈1。Li等[20]從盤(pán)縣火腿中鑒定出66條含有2～16個(gè)氨基酸殘基,主要來(lái)源于肌球蛋白和β-烯醇化酶的肽序列。干腌火腿中肽的含量和來(lái)源差異與加工時(shí)間和內(nèi)源酶的活性密切相關(guān),較高的酶活性和較長(zhǎng)的后熟時(shí)間有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)水解為氨基酸和小肽[18]。在本研究中,大河烏豬火腿中鑒定到的肽數(shù)量高于皖浙花豬干腌火腿和盤(pán)縣火腿中鑒定到的肽。這可能是較長(zhǎng)的后熟時(shí)間和較高活性的內(nèi)源酶導(dǎo)致大河烏豬火腿中的蛋白質(zhì)充分地降解為更多數(shù)量的小肽。

圖2 火腿肽的鑒定和分析Fig.2 Identification and analysis of ham peptides

2.3 新型α-葡萄糖苷酶抑制肽的篩選結(jié)果

生物信息學(xué)分析方法是一種快捷、可靠的生物活性預(yù)測(cè)方法,被普遍應(yīng)用于潛在生物活性肽的篩選和分析[21]。肽的生物活性與其氨基酸組成、理化特性以及分子質(zhì)量大小密切相關(guān)[20]。以往對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究表明:1)大多數(shù)具有較高生物活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽為氨基酸殘基數(shù)小于10的寡肽[22],肽鏈C端的精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)是保證活性肽發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制活性的必要氨基酸殘基[23]。2)疏水性氨基酸含量較高的肽對(duì)α-葡萄糖苷酶具有更好的抑制活性[3],亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)和脯氨酸(Pro)等疏水性脂肪族氨基酸能促進(jìn)胰島素分泌,是構(gòu)成α-葡萄糖苷酶抑制肽的重要氨基酸殘基[24-26]。3)絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和蛋氨酸(Met)是活性肽發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制作用的關(guān)鍵殘基[23]。4)甘氨酸(Gly)和亮氨酸(Leu)可以促進(jìn)胰島素的分泌,改善飲食引起的高血糖癥[27-28]。

本研究根據(jù)α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸組成特征,從143條肽序列中篩選出FELLKHQK、VATVSLPR、EALELLK、IIAPPERK、IEEALGDK 5條可能具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽序列,篩選結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,5條肽序列的C端都存在精氨酸(Arg)或賴氨酸(Lys)。肽IEEALGDK帶2個(gè)負(fù)電荷,序列中含Leu、Gly、Ile、Ala等可以促進(jìn)胰島素分泌的氨基酸殘基。肽VATVSLPR和IIAPPERK的疏水性氨基酸占比均高達(dá)62.50%。IIAPPERK的肽鏈得分值較高(0.33),經(jīng)BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,IIAPPERK中的片段IIAPPER具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。經(jīng)ToxiPred服務(wù)器預(yù)測(cè),所篩選的5條肽都無(wú)毒性。對(duì)比BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)(https:∥biochemia.uwm.edu.pl/),5條肽均未被研究報(bào)道,說(shuō)明本研究篩選的肽是新穎的。因此,選擇這5條可能具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的新型肽進(jìn)行下一步研究。

表2 新型肽的理化特性

2.4 合成肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性和穩(wěn)定性分析

2.4.1合成肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

為明確篩選肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性,采用固相法合成了FELLKHQK、VATVSLPR、EALELLK、IIAPPERK和IEEALGDK共5條肽段,通過(guò)α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定合成肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。由圖3(a1)、(b1)、(c1)、(d1)、(e1)和表3可見(jiàn),5條合成肽的純度都大于95%。由圖3(a2)、(b2)、(c2)、(d2)、(e2)可知,各合成肽的分子質(zhì)量測(cè)定值與其理論值相近,這表明肽的合成結(jié)果可靠,具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。5條合成肽中,只有肽段IEEALGDK具有 α-葡萄糖苷酶抑制活性,其IC50值為1.42 mg/mL(回歸方程:y=0.338x+0.021 3,R2=0.910 7)(表3)。本研究中,IEEALGDK對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于伊比利亞干腌火腿[6]中鑒定到的肽AEEEYPDL(IC50值為5.38 mg/mL)、LGVGG(IC50值為2.55 mg/mL)、GGLGP(IC50值為3.48 mg/mL)以及酸乳清水解物[13]中的肽YPVEPF(IC50值為3.52 mg/mL)、VPYPQ(IC50值為4.13 mg/mL)、LPYPY(IC50值為4.17 mg/mL)。本研究結(jié)果表明,IEEALGDK是一條具有較強(qiáng)α-葡萄糖苷酶抑制活性的新型生物活性肽。

圖3 合成肽的色譜及質(zhì)譜Fig.3 Chromatograms and mass spectroscopy analysis of synthetic peptides

表3 合成肽的色譜、質(zhì)譜信息及抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值

目標(biāo)峰峰高由液相色譜輸出的電壓信號(hào)轉(zhuǎn)化而來(lái)(1 AU=1 000 mV)。合成肽純度計(jì)算公式為合成肽純度=(目標(biāo)峰的峰面積/總峰面積)×100%;合成肽的分子質(zhì)量計(jì)算公式為m=(M+n)/n,m代表質(zhì)荷比(m/z),M代表分子質(zhì)量,n代表離子峰所帶電荷數(shù)。No表示目標(biāo)肽無(wú)α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2.4.2肽段IEEALGDK的穩(wěn)定性分析

生物活性肽在到達(dá)α-葡萄糖苷酶活性靶點(diǎn)和被人體吸收利用之前,可能會(huì)受到酸堿環(huán)境、加工溫度和人體胃腸消化環(huán)境等的影響[5]。因此,本研究測(cè)定了不同pH值、溫度和模擬胃腸消化條件下IEEALGDK的活性變化,分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

不同小寫(xiě)字母表示各組數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。

由圖4(a)可知,IEEALGDK在強(qiáng)酸(pH值為3)和強(qiáng)堿(pH值為11)條件下的α-葡萄糖苷酶抑制率低于中性環(huán)境(P<0.05)。這可能是強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境下,肽的活性片段發(fā)生外水解或脫酰胺反應(yīng),導(dǎo)致肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變,從而使活性下降[17],因此,活性肽的加工應(yīng)該在中性環(huán)境中進(jìn)行。由圖4(b)可知,IEEALGDK的α-葡萄糖苷酶抑制活性隨溫度的升高逐漸降低,90 ℃時(shí),IEEALGDK對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率降低至91.15%。這可能是溫度升高,破壞了肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和活性氨基酸殘基[5],影響其功能活性。然而,在所有處理溫度下,IEEALGDK對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均保持在90%以上。這表明IEEALGDK具有較高的熱穩(wěn)定性,能夠在加工熱處理中保持較高的活性,是一種良好的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

由圖4(c)可知,模擬胃腸消化前后,IEEALGDK的α-葡萄糖苷酶抑制活性先增強(qiáng)后減小,抑制率能很好地保持在90%以上。胃消化階段α-葡萄糖苷酶抑制率增長(zhǎng)至95.35%,腸消化階段結(jié)束時(shí)α-葡萄糖苷酶抑制率下降至92.04%。這可能是胃消化作用暴露出肽與α-葡萄糖苷酶結(jié)合的疏水性氨基酸位點(diǎn)[5],增強(qiáng)肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性;再經(jīng)過(guò)腸消化后,肽在胰蛋白酶作用下進(jìn)一步酶解為游離氨基酸,破壞了肽的二級(jí)結(jié)構(gòu),肽的功能活性降低。Hu等[4]發(fā)現(xiàn),經(jīng)胃腸道消化后,發(fā)酵米糠皮中的寡肽GLLGY對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性降低至83.37%。Hu等[13]發(fā)現(xiàn),經(jīng)胃腸道消化后,酸乳清中α-葡萄糖苷酶抑制肽YPVEPF的生物活性降低至19.64%。胃腸消化穩(wěn)定性結(jié)果顯示,IEEALGDK的胃腸耐受性高于酸乳清肽段YPVEPF和發(fā)酵米糠皮肽段GLLGY。這表明IEEALGDK在胃液和腸液中均能保持較強(qiáng)的抗消化能力。

本研究結(jié)果顯示,在高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿和模擬胃腸消化條件下,IEEALGDK的α-葡萄糖苷酶抑制活性受到一定的影響,但抑制率仍能保持在90%以上。這表明IEEALGDK具有較強(qiáng)的耐酸堿、耐熱和抗消化能力,可以在食品加工和消化吸收過(guò)程中發(fā)揮有效的生物活性。

2.5 IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶分子對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接技術(shù)是識(shí)別受體蛋白與活性肽的對(duì)接位點(diǎn)和相互作用最有效的方法[12]。本研究采用分子對(duì)接技術(shù)探究了IEEALGDK抑制α-葡萄糖苷酶的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5和表4。圖5(a)為IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶分子最佳結(jié)合模式下的可視化結(jié)果圖,經(jīng)PyMol 1.7.6軟件轉(zhuǎn)化得到最佳構(gòu)象模式下的3D圖[圖5(b)]和2D圖[圖5(c)]。由圖5(b)可見(jiàn),IEEALGDK能夠很好地嵌入α-葡萄糖苷酶分子的內(nèi)部,這表明IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶對(duì)接良好。經(jīng)AutoDock Tools 1.5.6軟件計(jì)算結(jié)合能大小,IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能為-30.96 kJ/mol(表4),低于阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能(-28.03 kJ/mol)和發(fā)酵米糠皮肽段GLLGY與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能(-29.71 kJ/mol)[4-5]。結(jié)合能的大小可用于判定復(fù)合物的穩(wěn)定性,肽與α-葡萄糖苷酶結(jié)合所需能量越低,形成的復(fù)合物越穩(wěn)定[5]。本研究中,IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能低于阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能和發(fā)酵米糠皮肽段GLLGY與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能,這說(shuō)明IEEALGDK可以與α-葡萄糖苷酶形成較高穩(wěn)定性的復(fù)合物。

圖5 IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接結(jié)果Fig.5 Molecular docking results of IEEALGDK and α-glucosidase

表4 IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶分子對(duì)接分析

生物活性肽主要通過(guò)氫鍵、疏水相互作用和鹽橋與α-葡萄糖苷酶的活性殘基位點(diǎn)結(jié)合,從而阻礙酶-底物復(fù)合物的形成和糖苷鍵的斷裂[24]。圖5(c)和表4顯示了IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接位點(diǎn)和分析結(jié)果。由圖5(c)和表4可知,IEEALGDK中的7個(gè)支鏈殘基(Glu4、Asp3、lle1、Glu1、Leu1、Gly1、Lys1)與α-葡萄糖苷酶的11個(gè)殘基(Gln617、Arg594、Tyr728、 Lys665、Asp724、Tyr720、His805、 His803、Ser466、Gln598、Lys597)之間形成15個(gè)氫鍵,平均鍵長(zhǎng)為3.27 ?。同時(shí),IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的12個(gè)氨基酸殘基(Ile667、Glu616、Glu470、Glu463、Leu666、Lys669、Pro668、Val620、Ser802、Arg727、Arg799、Arg467)之間形成疏水相互作用。這些氫鍵和疏水相互作用增強(qiáng)了IEEALGDK和α-葡萄糖苷酶之間結(jié)合的作用力和穩(wěn)定性。Barker等[29]研究發(fā)現(xiàn),精氨酸(Arg)、色氨酸(Trp)和半胱氨酸(Cys)是α-葡萄糖苷酶主要的活性殘基位點(diǎn)。Zhao等[3]發(fā)現(xiàn),降血糖肽段RNAVPITPTLNR、TKVIPYVRYL、YLGYLEQLLR和FALPQYLK主要通過(guò)氫鍵和疏水相互作用與α-葡萄糖苷酶的潛在活性位點(diǎn)Arg387、Arg428、Arg727、Arg801、Arg799和Trp710結(jié)合,阻斷α-葡萄糖苷酶與底物復(fù)合物間糖基化的形成發(fā)揮降血糖作用。本研究結(jié)果顯示,IEEALGD主要通過(guò)氫鍵和疏水相互作用占據(jù)α-葡萄糖苷酶的潛在活性位點(diǎn)Arg594、Arg727、Arg799和Arg467,進(jìn)而抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

3 結(jié) 論

采用LC-MS/MS技術(shù),在大河烏豬火腿中鑒定出143條主要來(lái)源于肌鈣蛋白、肌球蛋白和β-烯醇化酶的肽序列?；谏镄畔W(xué)分析方法和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析,在143條肽段中篩選出一條新型的α-葡萄糖苷酶抑制肽IEEALGDK(IC50值為1.42 mg/mL)。肽的穩(wěn)定性研究結(jié)果表明,IEEALGDK具有良好的熱穩(wěn)定性、耐酸堿穩(wěn)定性及胃腸道消化穩(wěn)定性。分子對(duì)接結(jié)果分析表明,IEEALGDK主要通過(guò)氫鍵和疏水相互作用占據(jù)Arg594、Arg727、Arg799和Arg467等α-葡萄糖苷酶的活性殘基位點(diǎn)發(fā)揮酶的抑制作用。本研究表明,大河烏豬火腿肽IEEALGDK是一條穩(wěn)定性較好的α-葡萄糖苷酶抑制肽,下一步可通過(guò)細(xì)胞或動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證肽的毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性,以便將其用于功能性食品的開(kāi)發(fā)。