錢(qián)婷婷 王 緒 嚴(yán)雪冰 王成海

1 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,江蘇省揚(yáng)州市 225009; 2 江蘇省太倉(cāng)市中醫(yī)醫(yī)院病理科

宮頸癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅女性的健康。引起宮頸癌預(yù)后不良的因素較多,主要因素是腫瘤的廣泛轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[1]。而宮頸鱗狀細(xì)胞癌(Cervical squamous cell carcinoma,CSCC)是宮頸癌中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型。因此,有必要探究CSCC惡化進(jìn)展的潛在機(jī)制,尋找治療CSCC的新靶點(diǎn)。

環(huán)狀RNA(circualar-RNA,circRNA)是一種閉環(huán)型非編碼RNA分子,對(duì)microRNA(miRNA、miR)具有調(diào)節(jié)作用[2]。因其閉環(huán)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)而有明顯的優(yōu)勢(shì),可作為開(kāi)發(fā)CSCC的新臨床診斷標(biāo)志物。miRNA是一類(lèi)由內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸[3]。CircRNA主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA(ceRNA)機(jī)制發(fā)揮作用,即作為miRNA的“分子海綿”,與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,從而減少游離miRNA對(duì)下游靶基因轉(zhuǎn)錄的干擾,達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的目的[4]。研究表明許多癌癥中circRNA的異常表達(dá),與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[5-7]。Huang等[8]通過(guò)人類(lèi)circRNA表達(dá)譜測(cè)序分析了CSCC和配對(duì)癌旁宮頸組織的circRNA表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了hsa_cir_0000745、hsa_ccirc_0084927、hsa_2circ_0002762、hsa_circ_0075341、hsa_circ_0007905 在CSCC中表達(dá)水平升高,但文中并沒(méi)有對(duì)hsa_circ_0007905的作用進(jìn)行相關(guān)研究。因此本文通過(guò)進(jìn)一步研究hsa_circ_0007905在CSCC組織中的表達(dá)情況、臨床意義及對(duì)生長(zhǎng)的影響,為CSCC的臨床診斷和治療提供潛在的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 資料和樣本 選取2020年1月—2022年12月在揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院和太倉(cāng)市中醫(yī)醫(yī)院接受宮頸癌手術(shù)切除的71例患者為研究對(duì)象,年齡38～65歲,中位年齡54歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床資料、病理資料無(wú)缺失者;(2)經(jīng)病理確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者;(3)術(shù)前未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療者;(4)對(duì)本研究知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他部位惡性腫瘤者;(2)合并有腦轉(zhuǎn)移者;(3)心、肝、腎功能不全者;(4)自身免疫性疾病、感染性疾病患者。收集71例配對(duì)的CSCC組織和鄰近正常組織及相關(guān)病理資料。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 質(zhì)粒和細(xì)胞 hsa_circ_0007905 mimic(模擬物)和si-circ_0007905(抑制物)質(zhì)粒合成于湖南豐暉生物科技有限公司。宮頸癌的兩個(gè)細(xì)胞株HeLa細(xì)胞、C33A細(xì)胞和人正常子宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物庫(kù)。上述所有細(xì)胞均在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(HyClone 公司)里孵育,培養(yǎng)基中添加1%的青霉素—鏈霉素(Invitrogen公司)。通過(guò)Lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒將hsa_circ_0007905 mimic和si-circ_0007905質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至宮頸癌細(xì)胞株,并將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 首先通過(guò) Trizol法提取CSCC組織總RNA,檢測(cè)RNA濃度;然后進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成,反應(yīng)體系:總RNA 1μg+mRQ Buffer(2×) 5μl+mRQ Enzyme 1.25μl+無(wú)酶水補(bǔ)至10μl,PCR儀擴(kuò)增獲得cDNA產(chǎn)物。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)通過(guò)Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行操作,反應(yīng)體系:SYBR預(yù)混料Ex Taq Ⅱ 10μl+ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4μl+上游引物(10mmol/L) 0.4μl+下游引物(10mmol/L) 0.4μl+ CDNA模板1.6μl+DEPC水7.2μl,合計(jì)20μl。在Applied Biosystems 7500 R-T PCR system進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn):(1)預(yù)變性:94℃ 5min。(2)PCR反應(yīng):重復(fù):94℃ 30s至55℃ 30s至70℃ 30s,共40個(gè)循環(huán),94℃ 1min 至 55℃ 30s至95℃ 30s。引物序列如下所示:hsa_circ_0007905上游:5’-GGTGCTGAAGAACATGTCCC-3’,hsa_circ_0007905下游:GCTAATGCCTGCACAGATGA;GAPDH上游:5’-ACCTGGACCTGGACCTGGACT-3’, GAPDH下游:5’-ACCTGGACCTGGACCTGGGAT-3’。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 將宮頸癌細(xì)胞懸浮于96孔板的孔洞里,每個(gè)孔洞加入5×103個(gè)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將宮頸癌細(xì)胞置入5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱里中培養(yǎng),直至細(xì)胞鋪滿(mǎn)整個(gè)孔底。每個(gè)孔中加入CCK-8溶液10μl并與細(xì)胞混勻,然后放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h。使用酶標(biāo)儀于450nm處檢測(cè)光密度(OD)值,分析過(guò)表達(dá)或敲低hsa_circ_0007905表達(dá)對(duì)宮頸細(xì)胞增殖活性的影響。

1.5 裸鼠皮下移植瘤模型 實(shí)驗(yàn)組(30只)和對(duì)照組(30只)的BALB/C-nu/nu裸鼠來(lái)源于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。裸鼠為8周齡,重量23～27g,飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物培養(yǎng)箱里。在第4天后于裸鼠右側(cè)腋腹壁的皮下接種宮頸癌細(xì)胞5×106個(gè)細(xì)胞左右。接種后每天監(jiān)測(cè)裸鼠生活狀態(tài)及其皮下瘤組織的生長(zhǎng)情況。50d后迅速拉頸處死裸鼠,完整剝離瘤體,對(duì)腫瘤體積大小和重量進(jìn)行測(cè)量,并給予拍照。移植瘤做相關(guān)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌中hsa_circ_0007905的表達(dá) 在71對(duì)CSCC和癌旁正常組織以及宮頸癌細(xì)胞(HeLa、C33A)和人正常子宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic 通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了hsa_circ_0007905的表達(dá)情況,結(jié)果如圖1所示,hsa_circ_0007905在71例CSCC組織的表達(dá)水平(3.437±0.173)較癌旁正常組織(1.502±0.065)明顯更高(t=10.48,P=0.000 1<0.05);hsa_circ_0007905在宮頸癌細(xì)胞HeLa(4.533±0.546)、C33A(6.333±0.291)的表達(dá)水平較人正常子宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic(1.600±0.173)明顯更高(t=5.124、13.99,P<0.05)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)宮頸癌中hsa_circ_0007905的表達(dá)水平

2.2 CSCC中hsa_circ_0007905的表達(dá)及其臨床病理意義 首先將病例按hsa_circ_0007905表達(dá)水平高低分為兩組:高表達(dá)組(表達(dá)水平高于對(duì)照組)和低表達(dá)組(表達(dá)水平≤對(duì)照組)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,高表達(dá)組例數(shù)為56例,低表達(dá)組例數(shù)為15例。通過(guò)統(tǒng)計(jì)得出hsa_circ_0007905的表達(dá)與CSCC的腫瘤大小和分化程度密切相關(guān) (P均<0.05),即表達(dá)水平越高,腫瘤越大而且分化程度越低,惡性程度越高;而與患者年齡、HPV感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期之間無(wú)相關(guān)性(P均>0.05)。這一結(jié)果提示高表達(dá)的hsa_circ_0007905參與了CSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程。

表1 CSCC組織中hsa_circ_0007905的表達(dá)及其意義

2.3 hsa_circ_0007905增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖活性 上述實(shí)驗(yàn)提示hsa_circ_0007905與CSCC的腫瘤大小密切相關(guān),因此我們進(jìn)一步通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)研究hsa_circ_0007905對(duì)宮頸癌細(xì)胞C33A增殖活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2、圖2所示,過(guò)表達(dá)hsa_circ_0007905促進(jìn)了宮頸癌C33A細(xì)胞的增殖活性,而降低hsa_circ_0007905表達(dá)則抑制了C33A細(xì)胞的增殖活性,兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表2 hsa_circ_0007905對(duì)C33A增殖活性的影響

圖2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè) hsa_circ_0007905對(duì)C33A增殖活性的影響

2.4 hsa_circ_0007905對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 為了進(jìn)一步研究hsa_circ_0007905在宮頸癌生長(zhǎng)增殖中的作用,筆者建立了裸鼠皮下移植瘤模型。因hsa_circ_0007905在CSCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)水平,故本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低hsa_circ_0007905表達(dá)對(duì)荷瘤的影響。通過(guò)裸鼠皮下注射降低hsa_circ_0007905表達(dá)的C33A細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,敲低組的腫瘤體積和重量明顯小于對(duì)照組,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。該結(jié)果進(jìn)一步表明hsa_circ_0007905可明顯促進(jìn)宮頸癌的增殖和生長(zhǎng)。

圖3 降低hsa_circ_0007905表達(dá)對(duì)皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響

3 討論

子宮頸癌是來(lái)源于宮頸鱗柱交界處的鱗狀細(xì)胞及柱狀細(xì)胞的惡性腫瘤。宮頸癌好發(fā)于中老年女性患者,近年來(lái)宮頸癌發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)。在中國(guó),宮頸癌的死亡率占女性惡性腫瘤的第二位,也占全部癌癥死亡率的第四位[9-10]。近年來(lái),隨著早癌篩查中宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的開(kāi)展,宮頸的早期病變能被早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療,但CSCC患者預(yù)后仍然不佳,主要原因是CSCC具體發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制還未被徹底闡明,因此尋找CSCC的診治靶點(diǎn)以及研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)理變得尤為重要。

circRNA是一種單鏈共價(jià)封閉的非編碼RNA,由前體信使核糖核酸通過(guò)非經(jīng)典剪接產(chǎn)生,并在生物物種中廣泛表達(dá)[11]。circRNAs可能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑、miRNA海綿或蛋白誘餌在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮作用[12-13]。近年來(lái)諸多的證據(jù)表明circRNAs參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,既有促進(jìn)宮頸癌的circRNAs,又有抑制宮頸癌的circRNAs;例如,circCCDC134在細(xì)胞核中募集p65,并作為miR-503-5p海綿調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中MYB的表達(dá),最終刺激HIF1A轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[14]。circRNA_101996在宮頸癌中過(guò)度表達(dá),上調(diào)的circRNA_101996顯著促進(jìn)宮頸癌的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞遷移,機(jī)制上circRNA_101996通過(guò)與miR-1236-3p結(jié)合并降低其表達(dá),從而通過(guò)miR-1236-3p/TRIM37軸加速了宮頸癌癥的發(fā)展,為宮頸癌的診斷和治療提供了新的見(jiàn)解[15]。circRNA_0000285在宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于鄰近正常組織。此外,敲除circRNA_0000285后宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移能力受到顯著抑制。FUS的表達(dá)水平與circRNA_0000285在宮頸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)circRNA_0000285通過(guò)促進(jìn)FUS的表達(dá)而發(fā)揮促癌作用[16]。circLMO1水平在宮頸癌癥組織中下調(diào),并與FIGO分期相關(guān)。在功能上circLMO3的缺失則促進(jìn)了子宮頸癌癥細(xì)胞的增殖和侵襲。從機(jī)制上,circLMO1通過(guò)吸收miR-4192來(lái)抑制靶基因ACSL4,從而作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA(ceRNA)發(fā)揮作用,有望成為宮頸癌癥臨床治療的生物標(biāo)志物[17]。circRNA_101308在宮頸癌組織中顯著下調(diào)并作為腫瘤抑制因子[18],過(guò)表達(dá)circRNA_101308能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MiR-26a-5p、MiR-196a-5p,MiR-196b-5p、MiR-335-3p和MiR-1307-3p被circRNA_101308吸收,此研究為宮頸癌的臨床治療提供了新的方向。circ_VPRBP在宮頸癌癥組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),且過(guò)度表達(dá)circ_VRRBP抑制Caski和C33A細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。circ_VPRBP通過(guò)調(diào)控miR-93-5p/FRMD6軸抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。

Huang等[8]通過(guò)人類(lèi)circRNA表達(dá)譜測(cè)序分析了CSCC和配對(duì)癌旁宮頸組織的circRNA表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa_cir_0000745、hsa_ccirc_0084927、hsa_2circ_0002762、hsa_circ_0075341、hsa_circ_0007905 在CSCC中表達(dá)水平升高,但本研究并未對(duì)hsa_circ_0007905的作用進(jìn)行相關(guān)研究。本研究通過(guò)在82例CSCC中進(jìn)行了qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了hsa_circ_0007905表達(dá)水平升高,初步說(shuō)明了hsa_circ_0007905作為circRNA的一員,在CSCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。

hsa_circ_0007905定位于1號(hào)染色體180953812-180962561基因區(qū)間,共391個(gè)核苷酸,又名circSTX6。目前除了Huang等[8]的研究,文獻(xiàn)中也發(fā)現(xiàn)一篇關(guān)于hsa_circ_0007905的研究,在胰腺導(dǎo)管上皮癌中circSTX6表達(dá)水平上調(diào),通過(guò)吸收miR-449b-5p來(lái)調(diào)節(jié)非肌肉肌球蛋白重鏈9(MYH9)的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[20]。本文研究同樣發(fā)現(xiàn)在CSCC中表達(dá)水平上調(diào),進(jìn)一步說(shuō)明了hsa_circ_0007905在癌癥中發(fā)揮促癌基因的作用。在分析hsa_circ_0007905表達(dá)與CSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn),hsa_circ_0007905的表達(dá)與CSCC的腫瘤大小和分化程度密切相關(guān),而與患者年齡、HPV感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期之間無(wú)相關(guān)性(P均>0.05)。表明高表達(dá)的hsa_circ_0007905參與了宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程,hsa_circ_0007905表達(dá)水平越高,腫瘤就越大而且分化程度越低,惡性程度越高,最終能影響CSCC的進(jìn)展和預(yù)后。TNM分期中的T代表原發(fā)腫瘤的大小和浸潤(rùn)深度,但本研究結(jié)果顯示hsa_circ_0007905表達(dá)與CSCC的TNM分期無(wú)關(guān),可能是因?yàn)楸狙芯縿澐值哪[瘤直徑大小與TNM分期原發(fā)腫瘤大小不一致且本研究標(biāo)本數(shù)量偏少有關(guān)。

進(jìn)一步功能性研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)hsa_circ_0007905后,細(xì)胞的增殖活性升高;降低hsa_circ_0007905表達(dá)后,細(xì)胞的增殖活性下降,再次提示hsa_circ_0007905促進(jìn)CSCC細(xì)胞的增殖活性,參與了CSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程。在裸鼠體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)中,敲低hsa_circ_0007905表達(dá)后腫瘤生長(zhǎng)緩慢,體積較小,瘤體重量也較輕。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣驗(yàn)證了hsa_circ_0007905能促進(jìn)CSCC細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。

綜上所述,hsa_circ_0007905在CSCC組織中表達(dá)水平上調(diào),與腫瘤的分化程度和大小密切相關(guān);hsa_circ_0007905是一個(gè)新的促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖的癌基因,本研究為未來(lái)靶向治療CSCC提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。