崔國林，閆雪敏，孟晨晨，李佳佳，趙 洋，王雪芬，薛曉陽，周守長

（1.華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北邯鄲 056000；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038）

Sm24/Rif12/Ssq 疫 苗（ 商 品 名AviPro?SalmonellaVac E）株是由腸炎沙門菌PT4 通過化學誘變方式獲得的一種代謝漂移突變株[1]，亦是國內(nèi)外普遍使用的腸炎沙門菌弱毒活疫苗株之一[2]。相較于腸炎沙門菌野毒株，Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株生長代次時間延長，細胞膜通透性升高，對紅霉素敏感，但對利福平和鏈霉素耐藥[1]；它可在動物體內(nèi)存活14～21 d，但不能在自然環(huán)境中存活[3]。Sm24/Rif12/Ssq 疫苗免疫可顯著降低雞蛋載菌量和載菌率[4]，減少泄殖腔排毒率[5-6]。研究[7-8]顯示，SPF 雞感染腸炎沙門菌標準株CVCC3377 后，從感染后7 d 開始持續(xù)性排毒至21 d，并從感染后7 d開始出現(xiàn)可檢測的平板凝集抗體和ELISA 抗體。然而，Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株中部分基因的缺失和突變導致其毒力弱化，同時也導致疫苗株對環(huán)境的適應性發(fā)生變化[1]，其在蛋雞體內(nèi)的定殖規(guī)律不同于腸炎沙門菌野毒株。因此，本研究選取0日齡、6 周齡和16 周齡蛋雞，分別進行Sm24/Rif12/Ssq疫苗首免、二免和三免，并于免疫后不同時間點檢測疫苗株核酸及抗體產(chǎn)生情況，以期明確疫苗株在蛋雞體內(nèi)定殖和抗體產(chǎn)生規(guī)律，從而為科學制定或優(yōu)化免疫程序提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

0日齡（出雛當日，60 只）、6 周齡（40 只）和16 周齡（40 只）海蘭褐蛋雞，飼養(yǎng)于華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司育雛場和產(chǎn)蛋場。

1.2 主要試劑

鏈霉素、利福平，購自北京索萊寶科技有限公司；BPW 培養(yǎng)基和BGA 培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術股份有限公司；腸炎沙門菌疫苗Sm24/Rif12/Ssq（商品名AviPro?SalmonellaVac E），購自禮藍（上海）動物保健有限公司；AceQ qPCR Probe Master Mix，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原，購自北京中海生物科技有限公司；D 群沙門菌ELISA 試劑盒，購自BioChek 公司。

1.3 試驗動物免疫程序

1.3.1 首免 選擇60 只0日齡海蘭褐蛋雞，對其中50 只滴口免疫1 羽份Sm24/Rif12/Ssq 疫苗（1×108CFU/只），剩余10 只滴口免疫等體積滅菌生理鹽水（空白對照組）。

1.3.2 二免 選擇40 只已完成Sm24/Rif12/Ssq疫苗首免的6 周齡海蘭褐蛋雞，對其中30 只滴口免疫1 羽份Sm24/Rif12/Ssq 疫苗（1×108CFU/只），剩余10 只滴口免疫等體積滅菌生理鹽水（空白對照組）。

1.3.3 三免 選擇40 只已完成Sm24/Rif12/Ssq疫苗二免的16 周齡海蘭褐蛋雞，對其中30 只滴口免疫1 羽份Sm24/Rif12/Ssq 疫苗（1×108CFU/只），剩余10 只滴口免疫等體積滅菌生理鹽水（空白對照組）。

1.4 首免后檢測

分別于Sm24/Rif12/Ssq 疫苗首免后1、3、5 和7 d，隨機采集10 只試驗組和2 只空白對照組雛雞的咽拭子、泄殖腔拭子和單根盲腸樣品，并置于含200 μg/mL 鏈霉素和100 μg/mL 利福平的BPW 培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)16～24 h。取1 mL BPW 菌懸液，12 000 r/min 離心5 min后，以50 μL 生理鹽水重懸沉淀并煮沸15 min，即為樣品核酸模板。采用qPCR 檢測上述樣品核酸模板。 反應體系（20.0 μL）[9]：AceQ qPCR Probe Master Mix 10.0 μL，ROX 0.4 μL，invAF（5'-GCTGCTTTCTCTACTTAAC-3'）0.4 μL（10 μmol/L），invAR（5'-GTAATGGAATGACGAACAT-3'）0.4 μL（10 μmol/L），invAP（5'-FAM-CATCACCATTAGTACCAGAATCAGTMGB-3'）0.4 μL（10 μmol/L），核酸模板2.0 μL，無菌水6.4 μL。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40 個循環(huán)。

圖1 首免后Sm24/Rif12/Ssq 疫苗在蛋雞體內(nèi)載量變化情況（柱形圖上標表示陽性率/%）

同時，在每個采樣時間點采集上述雛雞肝臟樣品，稱重后置于1 mL 含2 顆鋼珠的生理鹽水中，50 Hz 勻漿1 min，取100 μL 勻漿液涂布于含有200 μg/mL 鏈霉素和100 μg/mL 利福平的BGA 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～24 h 后進行細菌計數(shù)。

于免疫后30 d，采集10 只雞血清，利用雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原測定平板凝集抗體；同時，利用D 群沙門菌ELISA 試劑盒測定ELISA 抗體。ELISA 試劑盒結果判定標準：S/P≥0.5，腸炎沙門菌抗體陽性；S/P＜0.5，腸炎沙門菌抗體陰性。S/P＝ 0.5 時，抗體滴度為654.39。

1.5 二免和三免后檢測

于Sm24/Rif12/Ssq 疫苗二免或三免后4 d，采集30 只試驗組和10 只空白對照組雞泄殖腔拭子置于含200 μg/mL 鏈霉素和100 μg/mL 利福平的BPW 培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)16～24 h 后，采用1.4 方法進行qPCR 檢測。

于二免后30 d，三免后30、60、100 d，分別采集30 只試驗組和10 只空白對照組雞血清，測定平板凝集抗體和ELISA 抗體。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 9 軟件進行圖表繪制，利用IBM SPSS Statistics 25 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。首免后臟器細菌載量采用one-way ANOVA 進行數(shù)據(jù)顯著性分析，二免和三免后泄殖腔疫苗株載量采用T-test 進行數(shù)據(jù)顯著性分析，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗首免后定殖檢測

盲腸、肝是腸炎沙門菌在機體內(nèi)的主要定殖器官[3，10]，因此將二者作為本研究疫苗株定殖檢測的靶位。由于樣品雜菌較多，直接進行細菌計數(shù)誤差過大，故采用qPCR 方法測定細菌核酸，核酸量與細菌載量呈正比。結果顯示：咽拭子和盲腸樣品中疫苗株細菌載量呈先上升后下降趨勢，單個時間點咽拭子細菌載量變異系數(shù)為0.13～0.44，盲腸樣品細菌載量變異系數(shù)為0.19～0.34，細菌陽性率呈逐步下降趨勢，至免疫后7 d，細菌陽性率已降至60%～70%（圖1-A）；泄殖腔拭子細菌載量相對穩(wěn)定，單個時間點細菌載量波動更小，變異系數(shù)為0.07～0.13，細菌陽性率均在90%以上（圖1-A）；肝臟樣品細菌載量逐步下降至103CFU/g，細菌陽性率逐步下降至50%（圖1-B）?？瞻讓φ战M均無細菌檢出。

2.2 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗二免和三免后定殖檢測

Sm24/Rif12/Ssq 疫苗首免后保護時間有限[5]，往往需要進行加強免疫。如圖2所示，二免或三免后，泄殖腔拭子陽性率為17%～20%，三免后細菌載量顯著低于二免（P＜0.05），且均顯著低于首免后3～5 d（圖1-A）?？瞻讓φ战M均無細菌檢出。

圖2 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗二免和三免后4 d泄殖腔拭子qPCR 檢測結果（柱形圖上標表示陽性率/%）

2.3 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗免疫后抗體檢測

對免疫后血清采用平板凝集試驗初檢，發(fā)現(xiàn)均未出現(xiàn)明顯的凝集現(xiàn)象，即平板凝集抗體均為陰性。采用D 群沙門菌ELSIA 試劑盒檢測血清的結果（圖3）顯示，平均抗體滴度隨日齡上升而逐步升高，至三免后60 d 達到峰值，且同時間點平均抗體滴度超過抗體陽性閾值（圖3-A），單個樣品最高抗體滴度為4 562；首免后30 d 抗體陽性率為0，二免后30 d 抗體陽性率為10.7%，三免后30、60、100 d 的抗體陽性率分別為30.0%、57.0%、61.0%（圖3-B）?？瞻讓φ战M均無細菌抗體檢出。

圖3 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗免疫后ELISA 抗體變化規(guī)律

3 討論

研究[3]顯示，Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株可在1日齡免疫的SPF 雛雞泄殖腔排毒12 d。與之相似，另有研究[5]顯示，Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株在1日齡免疫的羅曼褐雛雞泄殖腔排毒10 d，在7 或16周齡免疫的雞泄殖腔排毒5 d。但是，以上研究均基于泄殖腔拭子細菌培養(yǎng)方法，而沙門菌判定可能受泄殖腔雜菌干擾，且不能定量。本實驗室分別采用BGA 瓊脂平板培養(yǎng)法和qPCR 法檢測免疫后8 d雛雞泄殖腔的疫苗株載量，結果顯示疫苗株陽性率分別為30%和80%（數(shù)據(jù)未發(fā)表），說明平板分離法檢測污染樣品的敏感性較低。因此本研究選用qPCR 方法判定非臟器樣本疫苗株載量。

Sm24/Rif12/Ssq 疫苗經(jīng)口免疫，途經(jīng)口腔、盲腸和泄殖腔，并在其中增殖和擴散。與之對應，首免后1～7 d，咽拭子、泄殖腔拭子和盲腸樣品中均有細菌檢出，說明疫苗株可在口腔、泄殖腔和盲腸存活7 d 以上；在每個檢測時間點，泄殖腔拭子細菌載量和穩(wěn)定性均高于咽拭子和盲腸樣品，細菌陽性率均在90%以上，加之泄殖腔拭子易于采集且對動物刺激較小，因此泄殖腔適于作為疫苗定殖或排毒檢測的靶位。首次免疫后1 d，疫苗株即可進入雛雞肝臟，隨后疫苗株載量持續(xù)下降，檢出陽性率僅為50%～90%，而腸炎沙門菌標準株在雛雞體內(nèi)載量于攻毒后5 d 達到峰值，隨后下降，且檢出陽性率為100%[10]。這些差異可能是Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株有別于野毒株的重要表現(xiàn)：①疫苗株在雛雞體內(nèi)增殖能力有限，可快速被機體免疫系統(tǒng)清除，導致其在雛雞臟器載量持續(xù)性下降；②疫苗株經(jīng)口免疫，侵襲進入肝的細菌數(shù)量有限，導致部分雛雞肝臟無可檢測數(shù)量的細菌。

與首免后疫苗排毒規(guī)律不同，二免和三免后疫苗排毒量（細菌載量）和排毒率均顯著低于首免。與之類似，雛雞在0日齡首免后3 d 的疫苗排毒量和排毒率均高于7日齡首免（數(shù)據(jù)未發(fā)表），這可能與以下原因相關：①0日齡首免時，雛雞消化道尚未形成多樣性菌群結構，梭菌科或腸桿菌科細菌占主導優(yōu)勢[11]，可能利于腸炎沙門菌疫苗株定殖和增殖，而高日齡免疫時，雞消化道已形成多樣性菌群結構，乳桿菌和腸球菌成為優(yōu)勢菌群，拮抗疫苗株定殖。②經(jīng)過首免后，雛雞消化道形成了針對腸炎沙門菌的黏膜免疫，可以抑制疫苗株的二免和三免后定殖。

雞白痢平板凝集試驗以全菌體作為診斷抗原，易受抗原試劑批次質(zhì)量、血清質(zhì)量和雞群其他細菌感染等因素干擾，特異性和敏感性欠佳，且其結果判定主要依靠肉眼，受主觀影響較大；但其成本低，適于大群普篩。ELISA 方法以純化的蛋白作為包被抗原，依靠酶標儀判別結果，其特異性和敏感性良好，但成本較高，較適于重點樣品確診。本研究選擇以上兩種方法同時檢測免疫后血清，發(fā)現(xiàn)凝集抗體均呈陰性，推測原因一方面可能由于腸炎沙門菌抗體與雞白痢沙門菌診斷抗原并不完全配型，降低了平板凝集試驗的敏感性；另一方面可能由于疫苗在體內(nèi)存在時間較短，未能誘導產(chǎn)生高水平抗體。但是加強免疫之后，血清中可檢測到低水平抗體，并隨免疫次數(shù)增加而升高，說明疫苗可以誘導機體產(chǎn)生抗體，抗體陽性率可作為疫苗免疫效果的評判指標。