摘要：目的 探究鼠李糖合成途徑基因強化對須糖多孢菌生長及丁烯基多殺菌素合成的影響及調(diào)控機制。方法 在Saccharopolyspora pogona ASAGF58中過表達(dá)鼠李糖合成途徑基因，并且在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度鼠李糖探究其對須糖多孢菌生長和次級代謝的影響。利用qRT-PCR對23個合成途徑基因以及菌株生長相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較，挖掘影響產(chǎn)量的關(guān)鍵基因。結(jié)果 通過過表達(dá)鼠李糖合成途徑基因，得到3株高產(chǎn)菌株Rha1、Rha2和Rha3，丁烯基多殺菌素產(chǎn)量分別提高1.82倍、2.12倍和2.54倍。結(jié)論 優(yōu)化鼠李糖供應(yīng)能促進(jìn)丁烯基多殺菌素的合成，其中葡萄糖核苷轉(zhuǎn)移酶gtt和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶busG可能是影響丁烯基多殺菌素合成的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞：須糖多孢菌；丁烯基多殺菌素；鼠李糖基合成基因；工程菌構(gòu)建；高產(chǎn)機制

中圖分類號：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research on gene regulation of the synthesis of butenyl-spinosyn by enhancing rhamnose synthetic pathways

Li Xinying1，2， Wang Jingnan1，2， Guo Chao1， Pang Jian3， Li Chun2，3， and Wang Chao1

（1 Academy of National Food and Strategic Reserves Administration， Beijing 100037; 2 Key Laboratory of Medical Molecule Science and Pharmaceutics Engineering， Ministry of Industry and Information Technology， Institute of Biochemical Engineering， School of Chemistry and Chemical Engineering， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081; 3 Institute of Biochemistry， Department of chemical engineering， Tsinghua University， Beijing 100084）

Abstract Objective This study explored the influence and mechanism of overexpression of rhamnose synthesis genes on the growth of Saccharopolyspora pogona and the synthesis of butenyl-spinosyn. Methods The influence of the rhamnose synthesis genes on growth and secondary metabolism was explored by overexpressing the rhamnose synthesis genes or culturing with various concentrations of rhamnose in S. pogona ASAGF58， A qRT-PCR analysis of 23 structure genes and the genes associated with cell growth was performed to identify the key genes that played an important role in yield. Results By overexpressing genes involved in the rhamnose synthesis pathway， three high-yielding strains Rha1， Rha2， and Rha3 were obtained， resulting in a 1.82 fold， 2.12 fold， and 2.54 fold increase in butenyl-spinosy production， respectively. Conclusion The titer of butenyl-spinosyn could be improved by optimizing the supply of rhamnose. And gtt and rhamnosyltransferases busG were inferred to be the key genes affecting the production.

Key words Saccharopolyspora pogona; Butenyl-spinosyn; Rhamnose synthesis gene; Construction of engineered strains; High-yield mechanism

丁烯基多殺菌素（butenyl-spinosyn）是由須糖多孢菌所產(chǎn)生的一類大環(huán)內(nèi)酯類化合物，由大環(huán)內(nèi)酯糖苷配基及兩側(cè)的糖基福樂糖胺基團和鼠李糖基團所組成（圖1），其與多殺霉素結(jié)構(gòu)相似，但獨特的攝食和觸殺毒性可滅殺蘋果蠹蛾、煙青蟲、馬鈴薯甲蟲等多殺霉素難以防控的害蟲，是一種具有應(yīng)用前景的綠色生物殺蟲劑[1]。

目前，須糖多孢菌合成丁烯基多殺菌素的能力極低，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，亟需提高其產(chǎn)量。由于其遺傳代謝背景不清晰，當(dāng)前多采用理化誘變及培養(yǎng)條件優(yōu)化提升產(chǎn)量[2-6]，但這些方法工作量大、易回復(fù)突變，精準(zhǔn)的基因工程手段有望改善這一問題[7-15]。丁烯基多殺菌素生物合成基因簇長達(dá)79 kb（鼠李糖合成基因位于簇外），包含23個基因，其中含有5個復(fù)雜的聚酮合酶[16]，酶的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、代謝途徑長、限速步驟不明等因素，阻礙了對須糖多孢菌的基因工程改造。

丁烯基多殺菌素需在大環(huán)糖苷配基的基礎(chǔ)上，連接鼠李糖基團和福樂糖胺基團后具有高效殺蟲活性[17]。因此，充足的NDP-L-鼠李糖和福樂糖胺基團供給對提高丁烯基多殺菌素產(chǎn)量至關(guān)重要。研究顯示，過表達(dá)NDP-L-鼠李糖合成基因能夠提高多殺霉素及丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量。Madduri等[18]過表達(dá)了刺糖多孢菌的gtt和gdh，使得多殺霉素產(chǎn)量提高近3倍；陳代杰等[19]利用ermE*p啟動子在刺糖多孢菌中增加gtt和gdh的拷貝數(shù)，使多殺霉素產(chǎn)量提高3倍；夏立秋等[20]在須糖多孢菌NRRL 30144中過表達(dá)了gtt-gdh-epi-kre，使丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高2.7倍。由此可見，鼠李糖基團的合成基因gtt、gdh、epi和kre對于產(chǎn)物的合成至關(guān)重要。前期研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖合成基團的轉(zhuǎn)錄水平隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。本研究通過對鼠李糖基團合成基因的不同強化組合來探究其對丁烯基多殺菌素合成的影響。

首先在課題組篩選得到的Saccharopolyspora pogona ASAGF58[17]發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加鼠李糖，探究鼠李糖對丁烯基多殺菌素合成的影響，然后在S. pogona ASAGF58中單獨或組合過表達(dá)鼠李糖合成基因（gtt、gdh、kre和epi），通過工程菌株生長代謝特性及基因轉(zhuǎn)錄水平的研究，確定影響丁烯基多殺菌素合成的關(guān)鍵基因，并探究工程菌株的高產(chǎn)機制，為后續(xù)基因工程改造提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究用于構(gòu)建須糖多孢菌基因工程菌株的相關(guān)質(zhì)粒菌株見表1。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

大腸埃希菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基（tryptone 10 g/L，NaCl 10 g/L，yeast extract 5 g/L，瓊脂20 g/L）；須糖多孢菌的培養(yǎng)使用種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基[21]，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)7 d。

外源添加鼠李糖實驗組培養(yǎng)基中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入60 g/L葡萄糖以及不同濃度（0.1、0.5、1、5、10和20 g/L）鼠李糖，115 ℃滅菌25 min。每組設(shè)置3個平行，HPLC測定丁烯基多殺菌素產(chǎn)量，通過Origin、SPSS軟件進(jìn)行擬合、差異顯著性分析。

1.3 主要試劑

各抗生素購自Sigma公司，使用濃度分別為：安普霉素（apramvcin）50 μg/mL；卡那霉素（kanamycin） 50 μg/mL；氯霉素（chloramphenicol）25 μg/mL；萘啶酮酸（nalidixic acid）25 μg/mL。

PrimeSTAR DNA聚合酶購自Takara，質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Gibson mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。本研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 構(gòu)建工程菌株

構(gòu)建單獨或組合過表達(dá)鼠李糖合成基因的質(zhì)粒pSET159-gtt、pSET159-gtt-gdh、pSET159-gtt-gdh-kre-epi（圖2）。以課題組前期構(gòu)建的位點特異性重組質(zhì)粒pSET159-ermE*p為模板，使用159-F/permE-R引物擴增6 kb的片段為載體，以S. pogona ASAGF58基因組為模板擴增分別得到gtt/gdh/kre/epi基因，上述片段擴增引物含25 bp同源臂用于Gibson組裝，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α過夜培養(yǎng)。在強啟動子上游及目的基因下游設(shè)計驗證引物verif-F/attR2，驗證正確的菌落過夜培養(yǎng)提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到ET12567/pUZ8002后作為供體菌株，通過接合轉(zhuǎn)移[22]方式轉(zhuǎn)化到須糖多孢菌基因組的attB上。在須糖多孢菌基因組attB位點上游設(shè)計引物attF5，在質(zhì)粒attP位點下游設(shè)計引物attR-GC，成功整合的菌株可擴增出1.5 kb的片段，對驗證正確的接合子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵檢測丁烯基多殺菌素產(chǎn)量。相關(guān)引物見表2。

1.5 須糖多孢菌發(fā)酵參數(shù)檢測

1.5.1 丁烯基多殺菌素的提取與檢測

取2 mL混勻的發(fā)酵液至10 mL EP管內(nèi)，加入6 mL甲醇混勻，超聲15 min，取上清液1 mL至新的1.5 mL EP管內(nèi)，于12000 r/min離心10 min后過0.22 μm有機濾膜進(jìn)行HPLC檢測。分析條件為：安捷倫反相C18柱；流動相為乙腈：甲醇：水=45：45：10（V/V/V），水中含0.05%乙酸銨；流速為1.0 mL/min；紫外檢測器檢測波長為244 nm。

1.5.2 pH值

梅特勒托利多儀器有限公司的FE20型pH計測定。

1.5.3 生物量

采用濕重法測定，用10 mL EP管，空管重量M1，裝8 mL種子液后管重為M2，于4000 r/min離心10 min，倒掉上清液后管重為M3。生物量（100%）=（M3-M1）/（M2-M1）×100%。

1.5.4 殘?zhí)?/p>

山東省科學(xué)院生物研究所SBA-40E型生物傳感分析儀測定。

1.6 qRT-PCR

按時間取樣發(fā)酵液，采用TRIZOL提取總RNA（見thermo fisher官網(wǎng)），通過thermo fisher逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA：使用Takara公司SYBR熒光定量試劑盒測定基因相對表達(dá)量。結(jié)果以Log2FoldChange形式顯示，相關(guān)引物見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源添加鼠李糖對丁烯基多殺菌素合成的影響

在須糖多孢菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的鼠李糖，探究鼠李糖內(nèi)源合成是否充足（圖3）。結(jié)果表明，添加低濃度的鼠李糖（0.1 g/L）可以顯著促進(jìn)須糖多孢菌合成丁烯基多殺菌素，其可能起誘導(dǎo)作用；添加中濃度的鼠李糖（5 g/L）同樣可顯著促進(jìn)丁烯基多殺菌素的合成，其可能執(zhí)行前體功能或被作為碳源利用[23]；添加20 g/L鼠李糖時丁烯基多殺菌素合成量明顯下降。以上結(jié)果表明，添加適量的鼠李糖（0.1～5 g/L）可顯著促進(jìn)丁烯基多殺菌素的合成。因此，推測過表達(dá)鼠李糖合成基因，提高內(nèi)源鼠李糖合成量也能提高丁烯基多殺菌素產(chǎn)量。

2.2 過表達(dá)鼠李糖合成基因?qū)Χ∠┗鄽⒕睾铣傻挠绊?/p>

將鼠李糖合成的4個基因進(jìn)行不同組合gtt、gtt-gdh、gtt-gdh-kre-epi過表達(dá)后獲得陽性接合子：Rha1、Rha2和Rha3，對工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖4所示。工程菌株Rha1、Rha2和Rha3搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量分別是出發(fā)菌株S. pogona ASAGF58的1.82倍、2.12倍和2.54倍。以上結(jié)果表明，gtt的單獨過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)丁烯基多殺菌素的合成，gtt-gdh聯(lián)合過表達(dá)可進(jìn)一步提升其產(chǎn)量。最后，通過將鼠李糖基團合成基因模塊化過表達(dá)使丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量達(dá)到最大值。

2.3 外源添加鼠李糖對工程菌株發(fā)酵性能的影響

“2.1”結(jié)果表明，外源添加0.1～5 g/L鼠李糖均能夠提升丁烯基多殺菌素合成量，為了驗證工程菌株中鼠李糖的合成是否充足，在Rha1、Rha2和Rha3搖瓶發(fā)酵中分別添加0、0.1、1和5 g/L的鼠李糖（圖5）。

結(jié)果表明，在3個工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1 g/L的鼠李糖均優(yōu)于兩個更高濃度的添加，使工程菌株Rha1、Rha2和Rha3中丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量分別提高了1.95、1.94和2.78倍。這些結(jié)果表明，工程菌株中的鼠李糖內(nèi)源合成量升高有利于丁烯基多殺菌素的合成，添加高濃度鼠李糖導(dǎo)致細(xì)胞對其耐受能力降低。此外，外源添加鼠李糖不能顯著的提升工程菌株丁烯基多殺菌素合成量，表明鼠李糖內(nèi)源供給充足。

2.4 工程菌株生長代謝特性

為了探究Rha1、Rha2和Rha3的高產(chǎn)機制，在發(fā)酵第0天、第3天、第5天和第7天取樣檢測其pH、生物量、殘?zhí)呛彤a(chǎn)量的變化（圖6）。相比于出發(fā)菌株S. pogona ASAGF58，工程菌株Rha1、Rha2和Rha3的pH在發(fā)酵期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。Rha1和Rha3的生物量在發(fā)酵初期快速上升，Rha2菌株生物量在發(fā)酵初期及中期緩慢增加，后期快速增加，較高的細(xì)胞積累促進(jìn)丁烯基多殺菌素持續(xù)合成。3個菌株的葡萄糖總消耗量均高于出發(fā)菌株，葡萄糖快速利用促進(jìn)了產(chǎn)物合成。其中，Rha3菌株在發(fā)酵前期消耗緩慢，發(fā)酵中后期加快。此外，Rha2和Rha3菌株相比于Rha1和野生型，在0～3 d開始積累丁烯基多殺菌素；在隨后的4～7 d，3株工程菌株合成丁烯基多殺菌素的速度快速上升。Rha3菌株中NDP-L-鼠李糖的合成途徑強化，促進(jìn)了菌株生長和丁烯基多殺菌素的合成（圖6）。

2.5 工程菌株丁烯基多殺菌素合成途徑基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步探究工程菌株的高產(chǎn)機制，對菌株ASAGF58、Rha1、Rha2和Rha3中丁烯基多殺菌素合成途徑23個基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較（圖7）[24]。結(jié)果顯示，在Rha1菌株中，丁烯基多殺菌素合成途徑基因在發(fā)酵初期均上調(diào)，其中，福樂糖胺基團合成基因在發(fā)酵初期高表達(dá)，PKS基因在發(fā)酵中期高表達(dá)，busG和gtt在第三天的表達(dá)量分別是野生菌株的22.17倍和14.59倍。在Rha2菌株中，除busG和gtt外，丁烯基多殺菌素合成途徑其他基因在發(fā)酵第三天無顯著上調(diào)，而在第五天除busI外其他基因均上調(diào)到最高水平。在Rha3菌株中，第三天除busE、busG、kre及gtt外，其他基因未發(fā)生上調(diào)；而在第五天全部基因均上調(diào)，其中，busG和gtt的表達(dá)量較野生菌株提高了47.02倍和12.67倍。這些結(jié)果顯示，gtt和busG可能是丁烯基多殺菌素合成途徑的關(guān)鍵限速步驟。

2.6 工程菌株細(xì)胞生長基因表達(dá)水平分析

工程菌株丁烯基多殺菌素合成量提升與菌體大量積累密切相關(guān)，因此本研究對菌體生長相關(guān)基因（amfC基因參與氣生菌絲體的形成，bldD、whiA、ssgA和sigF等基因參與孢子形成[25]）的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了測定（圖8）。

結(jié)果顯示，Rha2菌株中sigF在發(fā)酵第三天上調(diào)，ssgA和sigF在發(fā)酵第五天顯著上調(diào)，其余基因在各時期未上調(diào)，表明菌體生長狀況略差；Rha1菌株中whiA、ssgA和sigF在發(fā)酵第三天顯著上調(diào)，bldD和whiG在發(fā)酵第五天顯著上調(diào)；Rha3菌株中，whiA、ssgA和sigF在發(fā)酵第三天也顯著上調(diào)，孢子分化相關(guān)基因均在發(fā)酵第五天上調(diào)；Rha1和Rha3生長分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的增加促進(jìn)了菌體積累，從而大量合成丁烯基多殺菌素。

3 討論

本研究通過外源添加鼠李糖探究其對丁烯基多殺菌素的影響，結(jié)果顯示野生型須糖多孢菌的鼠李糖內(nèi)源供給不足，阻礙了丁烯基多殺菌素的合成。因此，構(gòu)建了3株過表達(dá)鼠李糖合成基因的工程菌株，其中，gtt和gtt-gdh過表達(dá)顯著提升了丁烯基多殺菌素合成量，gtt-gdh-kre-epi的聯(lián)合過表達(dá)能進(jìn)一步提高丁烯基多殺菌素的合成量，這表明gtt是非常重要的調(diào)控靶點。

進(jìn)一步探究了工程菌的高產(chǎn)機制，Rha3發(fā)酵前期葡萄糖消耗緩慢而中后期耗糖速度明顯加快，在獲得高生物量的同時，丁烯基多殺菌素的合成量為3株菌中最高。Rha1和Rha2發(fā)酵前期葡萄糖消耗較快而中后期耗糖速度變緩，丁烯基多殺菌素的合成量較出發(fā)菌株明顯提升。

從基因表達(dá)水平上來看，當(dāng)鼠李糖合成途徑基因過表達(dá)后，為避免前體積累造成的代謝壓力，需改變細(xì)胞內(nèi)的代謝流以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，即提高丁烯基多殺菌素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平，增加對前體的消耗，進(jìn)而促進(jìn)了終產(chǎn)物的合成。Rha2菌株丁烯基多殺菌素合成基因在發(fā)酵第五天上調(diào)到較高水平，而Rha1菌株在發(fā)酵第三天上調(diào)到高水平，Rha3菌株除個別基因外，在發(fā)酵初期均下調(diào)，中期上調(diào)，3個菌株的高產(chǎn)機理各不相同。但是丁烯基多殺菌素合成基因表達(dá)水平結(jié)果均顯示gtt和busG發(fā)生了顯著的上調(diào)，說明其對于丁烯基多殺菌素的合成可能至關(guān)重要。

相關(guān)研究結(jié)果顯示，蛋白組和代謝組分析表明鼠李糖糖基供應(yīng)不足，gtt-gdh-epi-kre和gtt-gdh的聯(lián)合過表達(dá)能提高刺糖多孢菌合成多殺菌素[19，20]，本研究采用外源添加鼠李糖的方式確定其供應(yīng)不足，通過gtt單獨過表達(dá)可將丁烯基多殺菌素合成量提升至出發(fā)菌株的1.82倍，模塊化過表達(dá)gtt-gdh-kre-epi基因可進(jìn)一步提升至2.54倍，表明gtt基因的調(diào)控起到?jīng)Q定性作用。此外，在多殺菌素的高產(chǎn)菌株中，鼠李糖轉(zhuǎn)移酶spnG基因表達(dá)量會在發(fā)酵后期表達(dá)減弱[26]。本研究表明，其同源蛋白busG也可能是重要的調(diào)控靶點。丁烯基多殺菌素合成途徑基因的調(diào)控對于產(chǎn)物產(chǎn)量提高至關(guān)重要，在探究限速步驟后可進(jìn)行精細(xì)調(diào)控策略研究，協(xié)調(diào)各基因的表達(dá)水平并與細(xì)胞生長關(guān)聯(lián)，實現(xiàn)丁烯基多殺菌素的高效合成。

參 考 文 獻(xiàn)

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