摘要：目的 明確北重樓與法定基原重樓滇重樓和華重樓的化學(xué)差異性及其抗腫瘤和抗炎活性差異，為北重樓資源的合理利用和開發(fā)提供參考。方法 利用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)對(duì)3種基原重樓的化學(xué)成分進(jìn)行表征，并探索是否含吡咯里西啶生物堿類成分；采用對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用評(píng)價(jià)抗腫瘤活性；采用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO模型評(píng)價(jià)抗炎活性。結(jié)果 從3種基原重樓中鑒定出67個(gè)化合物，其中53個(gè)為甾體皂苷，在北重樓中鑒定到22個(gè)甾體皂苷，未鑒定到吡咯里西啶生物堿。在試驗(yàn)藥物濃度下，北重樓僅對(duì)A549細(xì)胞增殖有抑制作用，IC50為141.0 μg/mL，而3種基原重樓在無毒濃度下對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的抑制作用均不顯著。結(jié)論 與法定基原重樓相比，北重樓含有的甾體皂苷成分種類較少，且組成上以多羥基類甾體皂苷為主；從本實(shí)驗(yàn)北重樓樣本中未發(fā)現(xiàn)已分離得到的吡咯里西啶生物堿。在藥理活性方面，北重樓具有潛在的抗肺癌活性。本研究為進(jìn)一步明確北重樓的藥效物質(zhì)以及其資源的開發(fā)利用提供初步參考。

關(guān)鍵詞：北重樓；甾體皂苷；吡咯里西啶生物堿；化學(xué)組成；抗腫瘤；抗炎

中圖分類號(hào)：R9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

The chemical composition identification based on UPLC-QTOF-MS/MS technology and anti-tumor， anti-inflammatory activity studies of 3 species of Paris

Peng Rui1，2， Ji Liang2， Xie Tianze2， Liu Yufei2， Chen Liangmian2， Liu Tao3， Wang Zhimin2， and Gao Huimin2

（1 School of Pharmacy， Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450046；2 Institute of Chinese Materia Medica， National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， China Academy of Chinese

Medical Sciences， Beijing 100700；3" School of Food and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective To elucidate the bariations in the chemical， anti-tumor， and anti-inflammatory activitity of Paris polyphylla var. yunnanensis （PPY）， Paris polyphylla var. chinensis （PPC） and Paris verticillata，" and to serve as a guide for the rational utilization and advancement of Paris verticillata resources. Methods UPLC-QTOF-MS/MS was utilized to characterize the chemical constituents of 3 species of Paris to explore whether it contained pyrrolizidine alkaloids; the anti-tumor activity was evaluated by inhibiting the proliferation of HepG2 cells and A549 cells; and the anti-inflammatory activity was evaluated by the LPS-induced NO release model in RAW264.7 cells. Results Sixty-seven compounds were identified from the 3 species of Paris， 53 of which were steroidal saponins. A" total of 22 steroidal saponins were identified from Paris verticillate， and pyrrolizidine alkaloids were not identified. At the test drug concentration， Paris verticillate only inhibited the proliferation of A549 cells with an IC50 of 141.0 μg/mL， while the 3 species of Paris had no significant inhibitory effect on the release of NO from LPS-induced RAW264.7 cells at non-toxic concentrations. Conclusion Compared to PPY and PPC， Paris verticillate contained fewer types of steroidal saponins， primarily composed of polyhydroxysteroid saponins; the isolated pyrrolizidine alkaloids were not found in the samples of Paris verticillate in this experiment. In terms of pharmacological activity， Paris verticillate had potential anti-lung cancer activity. This study provided a preliminary reference for further clarifying the effective substances of Paris verticillata and the development and utilization of its resources.

Key words Paris verticillate; Steroidal saponins; Pyrrolizidine alkaloids; Chemical compositions; Anti-tumour; Anti-inflammatory

重樓是我國傳統(tǒng)中藥，《中國藥典》2020年版規(guī)定重樓的法定基原植物為云南重樓Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz. （PPY）或七葉一枝花Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.） Hara （PPC）[1]。我國有30種重樓屬植物[2]，除滇重樓和華重樓外，其他基原重樓資源多遭到遺棄，然而多個(gè)物種在民間具有藥用歷史，多用于清熱解毒、消腫，治療毒蛇咬傷、疔、瘡等[3]。為了合理利用重樓屬物種資源，近年來學(xué)者不斷開展重樓屬植物的藥效物質(zhì)和不同基原重樓之間的差異性研究[4-9]，已有研究表明，黑籽重樓、南重樓與云南重樓的成分-活性整體之間相似度較高，有作替代藥源的潛質(zhì)[10]；李龍星等[11]通過液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)和主成分分析，發(fā)現(xiàn)南重樓、金線重樓與華重樓中化學(xué)成分種類無顯著差異。甾體皂苷被證實(shí)為重樓屬植物的主要化學(xué)成分和藥效物質(zhì)，藥理活性研究表明其具有抗腫瘤、抗炎和止血等活性[12]。

北重樓（Paris verticillata M. Bieb.）分布較廣，有較多的野生資源，在黑龍江、吉林、遼寧、陜西、甘肅和河北等地均有分布?！吨腥A本草》記載其根莖或全草入藥，味苦、性寒，有小毒，有祛風(fēng)利濕、清熱定驚、解毒消腫的功效，主治風(fēng)濕痹痛、熱病抽搐、咽喉腫痛、癰腫、凜病、毒蛇咬傷[13-14]，與法定基原重樓的傳統(tǒng)功效基本一致，其在韓國同樣為清熱解毒的傳統(tǒng)藥物[15]。目前，對(duì)北重樓的研究相對(duì)匱乏，多以探討資源栽培、開發(fā)和保護(hù)利用研究為主[16-18]，化學(xué)研究表明從北重樓中分離鑒定出28種甾體皂苷[19-23]和一些膽甾烷[22]、生物堿[15]、植物激素[24]、酚酸[25]等化學(xué)成分，不足以闡明北重樓發(fā)揮傳統(tǒng)功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步研究。值得關(guān)注的是有研究報(bào)道從韓國北重樓分離鑒定到了10個(gè)吡咯里西啶生物堿（PAs）[15]，其雙稠吡咯啶環(huán)的C-1和C-2位有雙鍵，此類結(jié)構(gòu)的PAs具有較強(qiáng)的肝毒性[26]，確證北重樓是否含有PAs對(duì)于其安全使用至關(guān)重要。

本文首先采用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)對(duì)3種基原重樓的化學(xué)成分進(jìn)行表征和比較，明確北重樓甾體皂苷成分輪廓；參考《歐洲藥典》方法鑒定北重樓中是否含有PAs[27]。在此基礎(chǔ)上，采用體外抑制肝癌HepG2細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞評(píng)價(jià)三者醇提物的抗腫瘤活性，采用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO模型評(píng)價(jià)其抗炎活性，為挖掘北重樓資源的藥用價(jià)值和深入的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Vexo G2-S型UPLC-QTOF-MS/MS（美國Waters公司）；UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，" " "1.7 μm）；數(shù)據(jù)采集與處理采用 Masslynx V4. 1 工作站；3111型 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermal Fisher公司）；WT-1ND型超凈工作臺(tái)（北京王堂藍(lán)翼科技有限公司）；CKX-41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Centrifuge-V型低速離心機(jī)（美國Thermal Fisher公司）；L530型低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限公司）。

1.2 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)10-0C-13V）購自美國CORNING公司；胎牛血清（批號(hào)04-001-1ACS）購自以色列Biological Industries公司；青鏈霉素混合液（批號(hào)15140-122）購自美國Gibco公司；0.25% EDTA-胰蛋白酶（批號(hào)25200-072）購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（批號(hào)D2650-100 ML）購自美國Sigma-Aldrich公司；磷酸緩沖鹽PBS（批號(hào)21-040-CV）購自美國Corning公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（批號(hào)KH741）購自日本Dojindo公司；一氧化氮試劑盒（批號(hào)S0021S）購自中國上海碧云天公司；LPS脂多糖（批號(hào)0000110081）購自美國Sigma-Aldrich公司；陽性藥L-NAME hydrochloride（批號(hào)112292）購自美國MCE公司；色譜純乙腈和甲醇購自美國Fisher公司；95%乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ（批號(hào)111591-201604、111593-201604 ）購自中國食品藥品檢定研究院；印美定N-氧化物、石松胺N-氧化物對(duì)照品（產(chǎn)品編號(hào)：CFN00459、CFN00463）購自武漢中標(biāo)科技有限公司；parisyunnanoside H、皂苷Th從華重樓根莖中分離得到[28]；progracillin從華重樓地上部分分離得到[29]。

華重樓根莖樣本采自福建承天藥業(yè)有限公司光澤基地（樣本編號(hào)：CL-72）；滇重樓根莖樣本采自云南文山（樣本編號(hào)：CL20-10）；北重樓根莖樣本采自河北張家口太子城（樣本編號(hào)：BCL-HB）；北重樓（70%乙醇）提取物以及未吸附部位、水部位、30%乙醇部位、50%乙醇部位、70%乙醇部位和95%乙醇部位由北重樓根莖（3.5 kg）的70%乙醇提取物經(jīng)HPD400大孔吸附樹脂分離得到，所用北重樓于2023年5月采自吉林省通化市集安市臺(tái)上鎮(zhèn)中興村（樣本編號(hào)：BCL-JL）。分析用樣本經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所高慧敏研究員鑒定其分別為重樓屬植物北重樓Paris verticillata、滇重樓Paris polyphylla" var. yunnanensis 、華重樓Paris polyphylla var. chinensis 的根莖，憑證樣本保存在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。

2 方法和結(jié)果

2.1 北重樓、滇重樓、華重樓的UPLC-QTOF/MS定性分析

2.1.1 供試品溶液的制備

取北重樓、滇重樓、華重樓樣本各0.5 g，分別置于錐形瓶中，加入25 mL 70%分析甲醇，超聲提取30 min，吸取適量提取液置離心管中12000 r/min離心10 min，上清液即為供試品溶液。

2.1.2 UPLC-QTOF/MS條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC C18（2.1 mm ×

100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相：0.1%的甲酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫：0～15 min，20%～60%B；15～17 min，60%～80%B；17～19 min，80%～95%B；19～21 min，95%～95%B；21～24 min，20%～20%B；流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，柱溫 35 ℃。

質(zhì)譜條件：ESI 離子源，正負(fù)離子模式掃描，毛細(xì)管電壓2.0 kV，錐孔電壓40 V，離子源120 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，脫溶劑氣流量600 L/h，錐孔反吹氣流50 L/h，檢測電壓400 V。MS E模式：碰撞電壓25～50 eV， 掃描范圍m/z 50～2000。

2.1.3 化學(xué)成分鑒定結(jié)果

課題組前期利用離線2D LC-MS技術(shù)對(duì)滇重樓、華重樓根莖進(jìn)行分析，并對(duì)華重樓中鑒定的部分甾體皂苷進(jìn)行導(dǎo)向分離[28-31]，鑒定的不同種類甾體皂苷平面結(jié)構(gòu)與質(zhì)譜推測結(jié)果基本一致，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)推測甾體皂苷結(jié)構(gòu)具有一定可靠性。結(jié)合文獻(xiàn)和對(duì)照品（化合物15、22、34、53和62）的碎片離子信息[32]，對(duì)甾體皂苷的裂解規(guī)律進(jìn)行總結(jié)：在負(fù)離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜顯示甾體皂苷的加合離子峰[M+HCOO]-和準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，可以獲得分子量和分子式的信息；在正離子模式二級(jí)質(zhì)譜中，可以觀察到甾體皂苷丟失糖基和苷元丟失羥基產(chǎn)生的碎片離子，以此確定糖基的種類、數(shù)量以及甾體皂苷的類別；多羥基甾體皂苷在糖基丟失完全后會(huì)有苷元連續(xù)丟失16 Da產(chǎn)生的碎片離子；呋甾皂苷類成分的22位連接羥基，易丟失形成較強(qiáng)的碎片離子峰[M+H-H2O]+，同時(shí)F開環(huán)狀態(tài)使不飽和度減少；偏諾皂苷和薯蕷皂苷有明顯的特征碎片離子，分別為m/z 413、395和m/z 415、397；m/z 271、253 和m/z 269、251的離子對(duì)可以判斷出母核A～D環(huán)上有1個(gè)和2個(gè)羥基取代。

從北重樓、滇重樓、華重樓中共鑒定出67個(gè)化合物，包含2個(gè)蛻皮激素，7個(gè)膽甾烷，53個(gè)甾體皂苷，化合物保留時(shí)間集中在0～16 min，其BPI圖指認(rèn)結(jié)果和化合物信息見圖1和表1。甾體皂苷中有28個(gè)多羥基類甾體皂苷，4個(gè)原偏諾類甾體皂苷，5個(gè)原薯蕷類甾體皂苷，7個(gè)偏諾類甾體皂苷，7個(gè)薯蕷類甾體皂苷。從北重樓中鑒定出22個(gè)甾體皂苷成分。部分化合物解析過程如下：

化合物2（tR=1.34 min）在負(fù)離子模式下，一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分別顯示準(zhǔn)分子離子峰1223.5366[M-H]-和加合離子峰1269.5432[M+HCOO]-，推斷其分子式為C56H88O29。正離子模式下，二級(jí)質(zhì)譜給出化合物丟失水和糖基的碎片離子，m/z 947、785、767、621和459提示由準(zhǔn)分子離子[M+H]+先失去1分子五碳糖（132）和1分子甲基五碳糖（146），之后逐漸脫去1分子六碳糖（162），1分子H2O，1分子甲基五碳糖，1分子六碳糖，m/z 477、459、441和不飽和度13提示苷元上除了3位有羥基取代，其他位置還有4個(gè)羥基取代，在F環(huán)上還存在一個(gè)雙鍵，m/z 269.19和251.17的離子對(duì)表明在A～D環(huán)上存在2個(gè)羥基取代，結(jié)合已分離的化合物推測該化合物為parisyunnanoside G或其異構(gòu)體。

化合物3（tR=1.47 min）在負(fù)離子模式下，一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分別顯示準(zhǔn)分子離子峰1355.5797[M-H]-和加合離子峰1401.5852[M+HCOO]-，推斷其分子式為C56H88O29。正離子模式下二級(jí)質(zhì)譜給出化合物丟失水和糖基的碎片離子，m/z 1225、1079、947、787、767、621和459提示由準(zhǔn)分子離子[M+H]+先失去1分子甲基五碳糖（146），之后逐漸脫去2分子五碳糖（132），1分子六碳糖（162），1分子H2O，1分子甲基五碳糖，1分子六碳糖，m/z 477、459、441以及不飽和度14提示苷元除了3位有羥基取代，其他位置還有4個(gè)羥基取代，F(xiàn)環(huán)上還存在一個(gè)雙鍵，m/z 269.19和251.17的離子對(duì)提示在A～D環(huán)上存在2個(gè)羥基取代，推測該化合物為didehydro-tetrol-diosgenin-132-132-146-146-132-162，為潛在的新化合物，該化合物為目前發(fā)現(xiàn)的重樓屬植物中存在的分子量最大的甾體皂苷。

化合物22（tR=3.30 min）負(fù)離子模式下，一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分別顯示準(zhǔn)分子離子1209.5929[M-H]-和加合離子峰1255.5992[M+HCOO]-，確定其分子式為C55H88O28。正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜顯示較強(qiáng)的m/z 1193[M+H-H2O]+峰，二級(jí)質(zhì)譜中m/z 1013、867、721、575和413提示碎片離子[M+H-H2O]+先丟失1分子H2O和六碳糖（162），之后逐漸脫去3分子甲基五碳糖（146），1分子六碳糖，m/z 431、413、269和251為原偏諾甾體皂苷苷元丟失羥基的碎片離子，經(jīng)與已分離化合物比對(duì)，鑒定為皂苷Th。

化合物32（tR=4.72 min）負(fù)離子模式下，一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分別顯示準(zhǔn)分子離子1193.6001[M-H]-和加合離子峰1239.6071[M+HCOO]-，推斷其分子式為C57H94O26。正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜顯示很強(qiáng)的m/z 1177[M+H-H2O]+峰，提示可能為呋甾皂苷，m/z 1013、867、721、593和415提示碎片離子[M+H-H2O]+先失去1分子六碳糖（162），之后脫去3分子甲基五碳糖（146），1分子六碳糖。m/z 415、271和253提示該化合物為原薯蕷類甾體皂苷，結(jié)合已分離鑒定的化合物，推測其為dichotomin。

化合物53（tR=5.27 min）負(fù)離子模式下，一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分別顯示準(zhǔn)分子離子峰1029.5309[M-H]-和加合離子峰1075.5366[M+HCOO]-，確定其分子式為C51H82O21。正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜中m/z 1013顯示丟失羥基的碎片離子峰m/z 1013[M+H-H2O]+，二級(jí)質(zhì)譜中m/z 867、721、575和413提示碎片離子[M+H-H2O]+連續(xù)丟失3分子甲基五碳糖（146），1分子六碳糖（162），m/z 431、413、269和251為偏諾皂苷苷元丟失羥基的碎片離子，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，鑒定為重樓皂苷Ⅶ。

化合物61（tR=13.66 min）負(fù)離子模式下，一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分別顯示準(zhǔn)分子離子1013.5352[M-H]-和加合離子峰1059.5425[M+HCOO]-，確定其分子式為C51H82O20。正離子模式下，二級(jí)質(zhì)譜中m/z 869、723、577和415提示該化合物丟失3分子甲基五碳糖（146）和1分子六碳糖（162），m/z 415、397、271和253 為薯蕷皂苷苷元丟失羥基的碎片離子，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，鑒定為重樓皂苷Ⅱ。

2.2 北重樓是否存在PAs的檢測

2.2.1 對(duì)照品和供試品溶液的制備

精密稱定印美定N-氧化物、石松胺N-氧化物各對(duì)照品1 mg，以10%甲醇為溶劑，配置成濃度為1 mmol/L的對(duì)照品母液，各精密吸取1 μL稀釋至濃度為1 μmol/L的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣前采用0.22 μm微孔濾膜過濾。

稱取北重樓未吸附部位、水部位、30%乙醇部位、50%乙醇部位、70%乙醇部和95%乙醇部位各1 mg，以10%甲醇為溶劑，配置成濃度為2 mg/mL的供試品溶液，進(jìn)樣前采用0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.2.2 UPLC-QTOF/MS條件。

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC C18 （2.1 mm ×" "100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相：0.1%的甲酸水溶液（A）和甲醇（C），梯度洗脫：0～7.0 min，5%～50%C；7.0～7.5 min，50%～80%C；7.5～7.6 min，80%～100%C；7.6～10.0 min，100%～100%C；10.1～16.0 min，5%～5%C；流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫 35 ℃。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，正離子模式掃描，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓40 V，離子源120 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，脫溶劑氣流量400 L/h，錐孔反吹氣流50 L/h， 檢測電壓400 V。MSE模式：碰撞電壓25～55 eV，掃描范圍m/z 100～600。

2.2.3 樣本檢測結(jié)果

韓國學(xué)者從北重樓中分離鑒定得到10個(gè)PAs，其中有8個(gè)PAs平面結(jié)構(gòu)相同，分子量均為315，另外2個(gè)PAs雙稠吡咯啶環(huán)上沒有羥基取代，分子量為299。本實(shí)驗(yàn)使用與8個(gè)PAs相同平面結(jié)構(gòu)的對(duì)照品印美定N-氧化物和石松胺N-氧化物，對(duì)照品結(jié)構(gòu)和部分北重樓中分離鑒定的PAs結(jié)構(gòu)如圖2，以印美定N-氧化物為例，其裂解規(guī)律如圖3。對(duì)《歐洲藥典》中PAs相關(guān)分析的液質(zhì)條件修改后獲得混合對(duì)照品和北重樓提取物供試品溶液的提取離子流圖，結(jié)果如圖4，混合對(duì)照品可提取到m/z 316.1760[M+H]+，而北重樓提取物中未提取到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，在二級(jí)質(zhì)譜中也未提取到特征碎片離子m/z 172.0971、m/z 154.0871、m/z 156.1060、m/z 138.0925、m/z 136.0756和m/z 120.0806，進(jìn)而對(duì)提取物經(jīng)大孔樹脂富集得到的6個(gè)部位進(jìn)行分析，未提取到這些離子，結(jié)果如圖5，對(duì)分子量為299的PAs和一些其他PAs的準(zhǔn)分子離子峰和特征碎片離子進(jìn)行提取離子流，同樣未檢測到該類成分的存在。

2.3 3種基原重樓醇提物體外藥理活性研究

2.3.1 完全培養(yǎng)基的配制

取DMEM培養(yǎng)基，每45 mL加入胎牛血清5 mL和青鏈霉素混合液0.5 mL，混勻，4 ℃保存。

2.3.2 待測樣品制備

稱取3份樣本各1 g，以95 %乙醇為提取溶劑，回流提取30 min，提取液4000 r/min離心10 min，上清液減壓回收溶劑獲得醇提物。取醇提物適量，加入DMSO配制成濃度為60 mg/mL的醇提物母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)取母液進(jìn)行稀釋。

2.3.3 醇提物對(duì)HepG2細(xì)胞、A549細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長期的HepG2、A549細(xì)胞，加入1 mL 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化，離心稀釋后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果加入適量的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋至約1×105個(gè)/mL，混勻后接種于96孔板中，每孔100 μL，設(shè)置空白組、對(duì)照組和不同濃度的給藥組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，其中空白組不接種細(xì)胞。于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，棄去原有培養(yǎng)基，空白組和對(duì)照組更換為完全培養(yǎng)基，給藥組更換為藥物濃度為6.25、12.5、25、50、100和200 mg/mL的含藥完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的吸光度A（吸光度），按照公式（2-1）計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=1-（A給藥組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100% （2-1）

2.3.4 醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，移液槍反復(fù)吸取培養(yǎng)基吹打瓶底，離心稀釋后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果加入適量的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋至約1×105個(gè)/mL，混勻后接種于96孔板中，每孔100 μL，設(shè)置空白組、對(duì)照組和不同濃度的給藥組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，其中空白組不接種細(xì)胞。于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，棄去原有培養(yǎng)基，空白組和對(duì)照組更換為完全培養(yǎng)基，給藥組更換為藥物濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100和200 mg/mL的含藥完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的吸光度A（吸光度），按照公式（2-2）計(jì)算細(xì)胞活力。以細(xì)胞活力＞80%的給藥濃度確定為無毒劑量。

細(xì)胞活力（%）=（A給藥組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100% （2-2）

2.3.5 醇提物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，加入1 mL 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化，離心稀釋后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果加入適量的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋至約1×105 個(gè)/mL，混勻后接種于96孔板中，每孔100 μL，設(shè)置對(duì)照組、模型組、陽性藥組和不同濃度的給藥組， 每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，對(duì)照組加入完全培 養(yǎng)基，模型組加入含1 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基，其他組別在LPS刺激的同時(shí)給藥干預(yù)，其中陽性藥組加入濃度為50 μmol/L L-NAME hydrochloride的完全培養(yǎng)基，給藥組加入無毒劑量的含藥完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后， 每孔吸取上清液50 μL于新的 96孔板中，再依次加入Griess Reagent Ⅰ和 Griess Reagent Ⅱ試劑各50 μL，酶標(biāo)儀測定540 nm波長下的吸光度 A（吸光度），按照公式（2-3）計(jì)算對(duì)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的抑制率。

NO抑制率（%）=（A模型組-A給藥組）/（A模型組-A對(duì)照組）×100% （2-3）

2.3.6 抗腫瘤、抗炎活性結(jié)果

北重樓、滇重樓、華重樓醇提物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞增殖的影響結(jié)果如圖6和表2所示，3種受試物中，滇重樓和華重樓對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有抑制活性，其中滇重樓在100 μg/mL下對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率達(dá)99.2%， 華重樓在200 μg/mL下細(xì)胞抑制率為75.39%，IC50分別為25.87和123.9 μg/mL；3個(gè)樣品對(duì)A549細(xì)胞增殖均有抑制活性，其中北重樓在200 μg/mL濃度下對(duì)A549細(xì)胞的抑制率為79.72%，滇重樓25 μg/mL濃度下對(duì)A549細(xì)胞的抑制率達(dá)到93.88%，華重樓在100 μg/mL濃度下對(duì)A549細(xì)胞的抑制率達(dá)到97.46%，IC50分別為141.0、11.27和50.44 μg/mL。

在抗炎活性實(shí)驗(yàn)時(shí)，先測試了3個(gè)樣本醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，以細(xì)胞活力＞80%的給藥濃度確定為無毒濃度，結(jié)果如表3，滇重樓細(xì)胞毒作用最強(qiáng)，無毒濃度為3.125 μg/mL，華重樓為25 μg/mL，北重樓為100 μg/mL，在最大無毒濃度下評(píng)價(jià)了它們對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響，抑制率分別為10.81%、11.79%和44.59%。

3 討論

重樓屬植物主要研究對(duì)象為法定基原重樓和重樓商品中易混偽品重樓屬近緣種如球藥隔重樓、狹葉重樓、金線重樓、南重樓、長柱重樓和毛重樓等[33]，它們地理分布相近，集中在云南、貴州、四川等地[3]，而北重樓主要分布在東北地區(qū)，且根莖與法定基原重樓差異較大[13]，受關(guān)注較少，缺少化學(xué)成分分析研究。課題組為完善2020年版《中國藥典》中重樓飲片標(biāo)準(zhǔn)[34]以及挖掘華重樓非藥用部位的利用價(jià)值[35]，購買和采挖了不同批次滇重樓和華重樓樣本，并對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析。本試驗(yàn)參考前期研究基礎(chǔ)，從收集的樣本中挑選具有代表性的滇重樓、華重樓樣本，利用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)對(duì)其和采集于河北的北重樓樣本的化學(xué)成分進(jìn)行表征，從3種基原重樓中鑒定出53個(gè)甾體皂苷，其中28個(gè)多羥基類甾體皂苷，4個(gè)原偏諾類甾體皂苷，5個(gè)原薯蕷類甾體皂苷，7個(gè)偏諾類甾體皂苷和7個(gè)薯蕷類甾體皂苷。從北重樓中鑒定出22個(gè)甾體皂苷，推測化合物1、12、18、19和23為潛在新化合物，其苷元為4個(gè)或5個(gè)羥基取代的多羥基類甾體皂苷，其中12、18、19和23在滇重樓、華重樓樣本中未鑒定到。滇重樓中薯蕷類甾體皂苷和原薯蕷類甾體皂苷含量高，華重樓中偏諾類甾體皂苷和原偏諾類甾體皂苷含量高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[28]，

北重樓在這幾類甾體皂苷亞型中僅鑒定到皂苷Th、dichotomin、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ，且具有相對(duì)含量較高。在已報(bào)道的北重樓化學(xué)成分中，部分甾體皂苷在此次未被鑒定到，如重樓皂苷Ⅰ、Ⅴ等[20]，推測本試驗(yàn)中北重樓中存在含量較低的成分未被鑒定。此外，課題組不同時(shí)間采集的吉林、遼寧北重樓樣本液質(zhì)分析結(jié)果與本試驗(yàn)所用樣本結(jié)果一致。從鑒定結(jié)果來看，北重樓含有的甾體皂苷成分較滇重樓和華重樓少，其化學(xué)成分組成主要為多羥基類甾體皂苷，其他類甾體皂苷中，以皂苷Th、dichotomin、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ4個(gè)成分為主。本研究首次對(duì)北重樓化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，明確北重樓與法定基原重樓滇重樓和華重樓的化學(xué)差異，為深入開展北重樓藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

PAs因強(qiáng)烈的肝毒性、致癌性和肺毒性等，與之相關(guān)的植物藥或制品等在歐洲國家如英國、德國等受到嚴(yán)格控制[26]。本文通過具有與北重樓中被分離鑒定的PAs相同平面結(jié)構(gòu)的對(duì)照品確定分析條件，在北重樓提取物以及化學(xué)成分相對(duì)富集的不同流分部位中均未檢測到相關(guān)PAs成分，試驗(yàn)結(jié)果與在韓國北重樓中分離鑒定到PAs這一報(bào)道不符[15]，是否和所用樣本來源單一或與文獻(xiàn)中報(bào)道的韓國北重樓基原不同有關(guān)以及其他基原重樓中是否含有PAs成分需要進(jìn)一步確認(rèn)。

抗腫瘤活性研究為重樓的研究熱點(diǎn)，滇重樓和華重樓總皂苷提取物以及一些單體化合物已被證實(shí)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[33]，目前，并沒有對(duì)北重樓提取物的抗腫瘤活性進(jìn)行研究，本文首次對(duì)北重樓提取物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選并和滇重樓、華重樓提取物進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示北重樓對(duì)A549細(xì)胞有抑制活性，提示北重樓有潛在抗肺癌活性。課題組前期在七葉一枝花化學(xué)成分和藥理作用研究中證實(shí)薯蕷皂苷和偏諾皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞均有抑制活性，且薯蕷皂苷活性較強(qiáng)[37]，滇重樓中薯蕷皂苷含量高[38]，推測是其對(duì)HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖抑制活性顯著的原因。北重樓含有較少的薯蕷皂苷和偏諾皂苷，導(dǎo)致其抗腫瘤活性弱于滇重樓和華重樓。同時(shí)有研究表明，北重樓中分離得到兩個(gè)對(duì)U87和U251細(xì)胞有抑制活性的多羥基類甾體皂苷[23]，皺葉重樓中分離的多羥基甾體皂苷也表達(dá)了抗腫瘤活性[39]，與北重樓中多羥基甾體皂苷抗腫瘤活性較弱不同，是否因多羥基甾體皂苷結(jié)構(gòu)不同？尚需進(jìn)一步分離純化北重樓中的潛在多羥基甾體皂苷新化合物，進(jìn)行準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)鑒定和活性評(píng)價(jià)。

在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO評(píng)價(jià)抗炎活性的試驗(yàn)中，滇重樓和華重樓對(duì)RAW264.7細(xì)胞表現(xiàn)了較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，可能與其含有較多的薯蕷和偏諾皂苷有關(guān)[33]，可見這兩類皂苷對(duì)非腫瘤細(xì)胞也具有細(xì)胞毒作用。3個(gè)基原重樓對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響均不顯著，其中華重樓對(duì)NO釋放的抑制率相對(duì)較高，提示華重樓有較好的抗炎效果，可能與華重樓中偏諾皂苷含量高有關(guān)，課題組前期通過小鼠耳腫脹模型已證實(shí)偏諾組分抗炎活性較薯蕷組分強(qiáng)[28]。3個(gè)基原重樓均被記載具有抗炎的傳統(tǒng)功效，滇重樓和華重樓在角叉菜膠致大鼠足腫脹模型中被證實(shí)具有抗炎效果[40]，本研究以LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞評(píng)價(jià)重樓抗炎活性結(jié)果均不明顯，后續(xù)尚需更換其他抗炎模型進(jìn)行其抗炎作用評(píng)價(jià)。

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