陳 田, 周 佳, 汪依萍, 耿寧雨, 屈建航, 趙 帥, 谷 燮

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院, 鄭州 450000)

氯霉素是一種具有旋光活性的酰胺醇類廣譜抗生素,可以有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌[1],因其抗菌能力高效和價(jià)格低廉等特點(diǎn)而被廣泛用于家禽和牲畜的疾病預(yù)防和治療等[2]。但是,殘留的氯霉素會(huì)隨著畜禽糞便的排放進(jìn)入環(huán)境中,對(duì)人體的造血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)造成嚴(yán)重的毒性反應(yīng)[3],具有潛在的致癌性和遺傳毒性[4],威脅人類健康。抗生素廢水的無(wú)效處理導(dǎo)致抗生素抗性細(xì)菌的增殖和抗生素抗性基因的傳播,威脅人類健康和生態(tài)安全[5]。因此,如何處理環(huán)境中殘留的氯霉素,已成為當(dāng)下亟待解決的環(huán)境問(wèn)題之一[6]。目前,國(guó)內(nèi)外主要采用物理法和化學(xué)法,如萃取法、氧化法、還原法等去除水體中的氯霉素[7-9],但采用單一的物理或化學(xué)法難以將性質(zhì)穩(wěn)定的氯霉素完全去除。生物法對(duì)環(huán)境的干擾較少,具有高效、運(yùn)行成本低、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì),是一種具有廣闊應(yīng)用前景的氯霉素降解方法[10]。

生物法主要利用微生物的代謝活動(dòng)降解氯霉素,因此,高效氯霉素降解菌的獲得成了關(guān)鍵[11]。趙夢(mèng)君[12]從安徽某制藥廠排水口污泥中分離篩選到一株氯霉素高效降解菌株LMS-CY,能以氯霉素為唯一碳源生長(zhǎng),且其降解氯霉素的速率與菌體接種量呈正相關(guān)。史可等[13]從長(zhǎng)期受抗生素毒性選擇的活性污泥中分離培養(yǎng)了一株氯霉素高效降解細(xì)菌CAP-2,24 h后對(duì)50 mg/L氯霉素降解率為36.3%。這些菌株為生物降解氯霉素提供了必要的前提條件,但是目前關(guān)于氯霉素降解的菌株資源仍十分稀缺[14]。因此,本研究從處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應(yīng)器內(nèi)活性污泥中篩選到1株氯霉素降解菌CC18,對(duì)該菌株的生理生化特征、系統(tǒng)發(fā)育類型、生長(zhǎng)與降解特性進(jìn)行研究,以期為生物降解氯霉素提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應(yīng)器內(nèi)的活性污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L,蛋白胨5 g/L,NaCl 2.5 g/L,瓊脂7.5 g/L,H2O 1 L,pH值為7.0,121 ℃滅菌20 min。

氯霉素培養(yǎng)基:氯霉素10 mg/L(根據(jù)具體試驗(yàn)調(diào)整),無(wú)水乙酸鈉1.154 g/L,葡萄糖0.281 g/L,NH4Cl 0.229 g/L,K2HPO40.067 g/L,MgSO4·7H2O 0.049 g/L,CaCl20.023 g/L,1 mL/L微量元素(0.03 g/L CuSO4·5H2O,1.5 g/L FeCl3·6H2O,0.03 g/L KI,0.15 g/L H3BO3,0.12 g/L MnCl4·H2O,0.12 g/L ZnSO4·7H2O,0.06 g/L NaMoO4·2H2O,0.15 g/L CoCl2·6H2O),H2O 1 L,pH值為7.5,115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器

島津LC-2030C-1260型高效液相色譜儀;INSPECT S50型掃描電鏡(美國(guó)FEI)。

1.2 方法

1.2.1 CC18的分離與篩選

稱取1 g活性污泥于9 mL的無(wú)菌水中,依次梯度稀釋成10-1～10-9的菌懸液。分別吸取不同濃度的菌懸液0.2 mL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上(每組3個(gè)平行),在28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。觀察菌落的生長(zhǎng)情況,菌落大小合適時(shí)利用三區(qū)劃線法進(jìn)行純化,直至出現(xiàn)單菌落,命名為CC18。

1.2.2 CC18的鑒定

使用堿裂解法提取CC18的DNA,采用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL:模版 DNA 1.5 μL,通用引物 27F 和 1429R各 0.5 μL,2×TaqMaster Mix 12.5 μL,ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃變性45 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,并在NCBI與已有序列進(jìn)行 Blast 比對(duì),選取相似度高的序列,利用MEGA 11軟件構(gòu)建CC18系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 CC18的生理生化特性

分別采用革蘭氏染色試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、熒光色素試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)分析菌株CC18主要的生理生化特征[12],并進(jìn)行掃描電鏡[15]觀察。

1.2.4 CC18的生長(zhǎng)曲線

將新鮮的CC18接種至100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置于28 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng),每隔4 h測(cè)量一次OD600值。

1.2.5 CC18的生長(zhǎng)與降解特性

挑取適量新鮮CC18菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置于28 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h,使用無(wú)菌水將其OD600值調(diào)整至1,接入到氯霉素培養(yǎng)基中,置于28 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)。分別以氯霉素質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50 mg/L)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%)、氯霉素培養(yǎng)基的pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)溫度(22、28、32、37 ℃)為研究對(duì)象,考察其對(duì)CC18降解氯霉素的影響。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)樣,并設(shè)空白對(duì)照。培養(yǎng)24 h后取樣,以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后,用0.22 μm的濾膜抽濾兩次,利用高效液相色譜法測(cè)定上清液中的氯霉素濃度。

1.2.6 高效液相色譜法測(cè)定氯霉素含量

用高效液相色譜儀測(cè)定氯霉素濃度,色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇∶水=65∶35,流速1 mL/min,采用等梯度洗脫,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm。

1.2.7 響應(yīng)面法驗(yàn)證多因素作用下降解菌CC18的最佳降解條件

根據(jù)上述試驗(yàn)的結(jié)果,利用SPSS軟件對(duì)上述4個(gè)因素進(jìn)行顯著性分析,選取對(duì)CC18降解氯霉素影響最顯著的3個(gè)因素,以氯霉素降解率為響應(yīng)值,應(yīng)用Design-Expert 12軟件進(jìn)行分析,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn),如表1。

表1 因素與水平表Table 1 Factor and level table

2 結(jié)果與分析

2.1 CC18的形態(tài)特征和生理生化特性

從處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應(yīng)器內(nèi)活性污泥中分離篩選到的降解菌CC18的菌落呈圓形,淺黃色,邊緣整齊,中部凸起,較濕潤(rùn),半透明,易挑取,其菌體呈桿狀(圖1)。CC18為革蘭氏陰性菌,氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性,甲基紅試驗(yàn)陰性,淀粉水解試驗(yàn)陰性,熒光色素試驗(yàn)陰性,可耐受5%的NaCl,硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性。

圖1 CC18菌體形態(tài)電鏡圖Figure 1 Electronmicrograph of strain CC18

2.2 CC18的系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增后,CC18的序列長(zhǎng)度為1 445 bp,在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì),菌株CC18與墨西哥假黃單胞菌Pseudoxanthomonasmexicana(AF273082)的同源性最高,為99.79%(圖2)。結(jié)合其形態(tài)觀察和生理生化鑒定結(jié)果,參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,初步鑒定菌株CC18為墨西哥假黃單胞菌。

2.3 CC18的生長(zhǎng)和降解特性

CC18的生長(zhǎng)曲線如圖3所示,該菌在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)約12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,約52 h后到達(dá)穩(wěn)定期,約72 h后進(jìn)入衰退期。

圖3 CC18生長(zhǎng)曲線Figure 3 Growth curve of CC18

2.3.1 氯霉素質(zhì)量濃度對(duì)氯霉素降解率的影響

圖4為CC18在不同氯霉素質(zhì)量濃度下的降解率和生長(zhǎng)情況,當(dāng)氯霉素質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí),其降解效果最佳,為9.2%。當(dāng)氯霉素質(zhì)量濃度在10～20 mg/L時(shí),該菌生長(zhǎng)情況較好。因此,CC18生長(zhǎng)和降解氯霉素的最佳質(zhì)量濃度為20 mg/L。

圖4 不同氯霉素質(zhì)量濃度下CC18對(duì)氯霉素的降解效果(a)和生長(zhǎng)情況(b)Figure 4 Effect of different chloramphenicol mass concentrations on the degradation efficiency (a) and growth (b) of CC18

2.3.2 接種量對(duì)氯霉素降解率的影響

圖5為不同接種量下CC18對(duì)氯霉素的去除效果和生長(zhǎng)情況。當(dāng)接種量為4%時(shí),該菌對(duì)20 mg/L氯霉素的降解效果最佳,去除率為15.5%。

圖5 不同接種量下CC18對(duì)氯霉素的降解效果(a)和生長(zhǎng)情況(b)Figure 5 Effect of different inoculations on the degradation efficiency (a) and growth (b) of CC18

2.3.3 pH值對(duì)氯霉素降解率的影響

圖6為CC18的接種量為4%,不同pH值下其對(duì)20 mg/L氯霉素的降解效果和生長(zhǎng)情況。當(dāng)pH值為7時(shí),該菌對(duì)氯霉素的降解效果和生長(zhǎng)情況均最佳。因此,CC18生長(zhǎng)和降解氯霉素的最佳pH值為7。

圖6 不同pH值下CC18對(duì)氯霉素的降解率(a)和生長(zhǎng)情況(b)Figure 6 Effect of different pH values on the degradation efficiency(a) and growth (b) of CC18

2.3.4 溫度對(duì)氯霉素降解率的影響

圖7為CC18的接種量為4%,培養(yǎng)基的pH值為7,不同培養(yǎng)溫度下CC18對(duì)20 mg/L氯霉素的降解率。當(dāng)溫度為28 ℃時(shí),該菌的生長(zhǎng)情況和對(duì)氯霉素的降解效果最佳,去除率為22.9%。因此,CC18生長(zhǎng)和降解氯霉素的最佳溫度為28 ℃。

圖7 不同培養(yǎng)溫度下CC18對(duì)氯霉素的降解率(a)和生長(zhǎng)情況(b)Figure 7 Effect of different temperatures on the degradation efficiency (a) and growth (b) of CC18

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化CC18降解氯霉素的效果

2.4.1 回歸方程擬合及方差分析

采用 Design-Expert 12 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析,回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表2,對(duì)各因素回歸擬合后,得到二次回歸方程如下:

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

Y=26.27-1.75A+3.88B+3.08C-2.75AB-2.42AC+0.394 4BC-7.62A2-6.27B2-1.52C2,R2=0.922 3,由方差分析回歸方程模型高度顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)的P=0.174 6>0.05,失擬項(xiàng)差異不顯著,一次項(xiàng)、平方項(xiàng)均對(duì)響應(yīng)值有顯著性影響,因此,模型選擇正確。根據(jù)F值可以判斷3種影響因素的強(qiáng)弱,依次是B>C>A。其中,一次項(xiàng)B,二次項(xiàng)A2和B2的P<0.01,達(dá)到高度顯著水平;一次項(xiàng)C的P<0.05,達(dá)到顯著水平。

2.4.2 響應(yīng)曲面和等高線

接種量、pH值和溫度這3個(gè)因素交互作用對(duì)CC18降解氯霉素效果的影響見(jiàn)圖8～圖10。結(jié)果表明:在一定溫度條件下,隨著接種量不斷提高,CC18降解氯霉素的效率呈先升高后降低的趨勢(shì);接種量與pH值對(duì)CC18降解氯霉素效率具有較大的影響,呈拋物線式的變化;在溫度一定的情況下,隨著pH值的增加,CC18降解氯霉素的效率呈先升高后降低的趨勢(shì)。

圖8 接種量與溫度對(duì)氯霉素降解率的三維曲面圖(a)與等高線圖(b)Figure 8 Three dimensional curved surface diagram (a) and contour diagram (b) of the effect of inoculation amount and temperature on the degradation rate of chloramphenicol

圖9 接種量與pH值對(duì)氯霉素降解率的三維曲面圖(a)與等高線圖(b)Figure 9 Three dimensional curved surface diagram (a) and contour diagram (b) of inoculation amount and pH value on chloramphenicol degradation rate

圖10 溫度與pH值對(duì)氯霉素降解率的三維曲面圖(a)與等高線圖(b)Figure 10 Three dimensional curved surface diagram (a) and contour diagram (b) of temperature and pH value on chloramphenicol degradation rate

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù) Design-Expert 12 軟件的分析結(jié)果,得到CC18降解20 mg/L氯霉素的最優(yōu)條件:接種量3.6%,pH 7.6,溫度30 ℃,理論降解率28.2%。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證后,其實(shí)際降解率為30.6%。與理論值接近,表明該模型能很好地優(yōu)化CC18降解氯霉素的條件。

3 討論

盡管抗生素的抑菌作用會(huì)增加生物處理的難度,然而生物強(qiáng)化因其經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)逐漸成為治理環(huán)境中抗生素污染的重要手段之一。目前,已有一些能夠降解氯霉素的微生物(表3)。如從魚(yú)塘沉積物中馴化、篩選出氯霉素降解菌PseudomonasmigulaCSFO-3,7 d時(shí)對(duì)100 mg/L氯霉素的降解率為29.0%[16];從被氯霉素污染的南明河水中篩選到 2 株氯霉素降解菌:嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida),14 d時(shí)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)對(duì)50 μg/L氯霉素去除率為89.5%,而嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)對(duì)50 μg/L氯霉素去除率僅為13.8%;從水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘沉積物中分離出的銅綠假單胞菌,7 d時(shí)對(duì)60 mg/L氯霉素的降解率為29.0%[17]。本研究從處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應(yīng)器內(nèi)活性污泥中篩選到的墨西哥假單胞菌PseudoxanthomonasmexicanaCC18,1 d時(shí)對(duì)20 mg/L氯霉素去除率為30.6%。這些氯霉素的降解菌大多歸屬于假單胞菌屬,但是墨西哥假單胞菌在氯霉素降解中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

表3 部分氯霉素降解菌的降解效果Table 3 The degradation effect of some chloramphenicol degrading bacteria

雖然本研究篩選的墨西哥假單胞菌CC18對(duì)氯霉素的降解效果不如已報(bào)道的菌株LMS-CY[12]和CSFO-3[16],這可能與菌屬、篩選條件和實(shí)驗(yàn)方法等因素有關(guān),但是墨西哥假單胞菌CC18對(duì)20 mg/L氯霉素的降解速度較快,24 h能達(dá)到30.6%的降解率,明顯短于嗜水氣單胞菌和惡臭假單胞菌所需的14 d。Lin等[18]從活性污泥中分離出的假單胞菌CE21和CE22,24 h時(shí)CE21對(duì)100 mg/L頭孢氨芐的降解率為46.7%,而假單胞菌CE22的降解率高達(dá)90%,進(jìn)一步表明假單胞菌屬在抗生素的降解方面具有重要作用。綜上所述,這些氯霉素降解菌為解決氯霉素濫用后污染水體的生物處理提供了菌種基礎(chǔ),但氯霉素的降解機(jī)制以及實(shí)際應(yīng)用等方面仍需要大量研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)墨西哥假單胞菌CC18具有降解氯霉素的作用,有望制備成微生物菌劑應(yīng)用于氯霉素污染水體的生物修復(fù)[19],不僅可有效減少環(huán)境中殘留的氯霉素,也為污染水體的環(huán)境生物治理打下基礎(chǔ),具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值[20]。

4 結(jié)論

本研究從處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應(yīng)器內(nèi)活性污泥中分離出一株氯霉素降解菌CC18,結(jié)合其形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,CC18歸屬于墨西哥假單胞菌(Pseudoxanthomonasmexicana)。當(dāng)其接種量為4%,pH值為7,溫度為28 ℃時(shí),24 h該菌株對(duì)20 mg/L氯霉素的降解率為22.9%。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化,當(dāng)接種量3.6%,pH值為7.6,溫度30 ℃時(shí),24 h時(shí)其對(duì)20 mg/L氯霉素的降解率為30.6%。本研究首次發(fā)現(xiàn)墨西哥假單胞菌屬具有降解氯霉素的功能,不僅豐富了氯霉素降解微生物菌種庫(kù),也為微生物治理復(fù)雜環(huán)境的抗生素污染提供更多選擇。