李春曉,安 尉,高博泉,王振龍,韓 冰,陶 慧,王金全,王秀敏

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

過敏是日常生活中很常見的問題之一,嚴(yán)格來說,過敏是機(jī)體產(chǎn)生的一種過激的免疫反應(yīng),機(jī)體將外來的一些物質(zhì)視為異物從而引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)過度,繼而導(dǎo)致人或動物體發(fā)生一系列過敏反應(yīng)。寵物過敏原誘發(fā)的癥狀嚴(yán)重程度差異很大,從與鼻炎和結(jié)膜炎相關(guān)的不適到嚴(yán)重的哮喘;哮喘可能發(fā)展成危及生命的疾病,貓犬過敏原被認(rèn)為是哮喘和過敏性鼻炎發(fā)展的主要危險因素[1]。對貓過敏患者而言,在自然條件下接觸一定的貓過敏原會導(dǎo)致嚴(yán)重的外周氣道阻塞,它可以發(fā)展成危及生命的狀況[2]。根據(jù)一項(xiàng)針對吸入性過敏原的大規(guī)模皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(SPT)研究(全球哮喘和過敏歐洲網(wǎng)絡(luò))顯示,因疑似吸入性過敏原而就診的歐洲成年人中約26%對貓過敏,27%對犬過敏[3-4]。我國對兒童支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎、濕疹、過敏性咳嗽、急慢性蕁麻疹、過敏性紫癜等常見過敏性疾病的過敏原進(jìn)行分析的流行病學(xué)調(diào)查顯示,學(xué)齡前兒童和學(xué)齡期兒童吸入性過敏原過敏者分別占66%和73.1%[5]。家養(yǎng)貓和家養(yǎng)犬中最主要的過敏原分別是Fel d 1和Can f 1[6]。貓犬過敏原提取物含有多種過敏原,目前已有八種貓的過敏原(Fel d 1～Fel d 8)以及八種犬的過敏原(Can f 1～Can f 8)在WHO/IUIS中注冊。

貓犬過敏原在世界范圍內(nèi)作為常見的室內(nèi)吸入性過敏原,參與免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的過敏反應(yīng),IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)屬于Ⅰ型免疫,與其他類型免疫反應(yīng)相比時間進(jìn)程更快,抗原識別后繼發(fā)反應(yīng)的幅度更大,這些后果可能高度危及過敏患者的生命[6]。目前,還缺乏完全有效和安全的方法治療寵物過敏。

1 貓犬主要過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)與功能分析

1.1 貓?jiān)催^敏原蛋白

在貓的皮屑、毛發(fā)、唾液、舌下腺等提取物中發(fā)現(xiàn)有多種過敏原,包括貓過敏原蛋白Fel d 1～Fel d 8。過敏原Fel d 1是分泌珠蛋白家族的成員,是最主要的貓過敏原[7],主要在舌下和皮脂腺中產(chǎn)生,肛腺和淚腺也會產(chǎn)生[8]。Fel d 1主要儲存在唾液和毛發(fā)中,當(dāng)貓咪梳理自己毛發(fā)時,Fel d 1也會轉(zhuǎn)移到貓毛上。另外,含有Fel d 1過敏原的貓皮屑作為小的空氣傳播顆粒傳播到環(huán)境中[9]。Fel d 1是由兩個異源二聚體形成的四聚糖蛋白(圖1),二聚體之間以非共價鍵的方式鏈接,每個異源二聚體由一個70殘基肽和一個85、90或92殘基肽組成。這些鏈在每個異源二聚體中通過二硫鍵共價連接[10]。Fel d 1的結(jié)構(gòu)與兔子宮珠蛋白的結(jié)構(gòu)具有相似性,其鏈Ⅰ與子宮珠蛋白共享氨基酸同源性,而鏈Ⅱ是具有N-端連接寡糖的糖蛋白[11]。在Fel d 1內(nèi)部有一個不對稱空腔,可以結(jié)合內(nèi)源性配體[7];在體內(nèi),Fel d 1的過敏原性由黏膜抗原呈遞細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞)上的甘露糖受體識別決定[12]。

圖1 貓主要過敏原Fel d 1蛋白結(jié)構(gòu)[10]Fig.1 Structure of major cat allergen Fel d 1[10]

Fel d 2是一種血清白蛋白,是皮屑中的重要蛋白質(zhì),它是一種引起輕微過敏癥狀的貓過敏原,可在單重和多重免疫分析中作為天然純化和重組分子獲得。Fel d 3是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑,也是一種次要過敏原,屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CPI)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族,是一種小的酸性蛋白,沒有半胱氨酸殘基或二硫鍵。Fel d 4和Fel d 7為脂質(zhì)激素,Fel d 8是一種獨(dú)特的泡沫蛋白樣蛋白,屬于脂多糖結(jié)合蛋白/殺菌通透性增加家族[13]。

在以上過敏原蛋白中,最重要的過敏原蛋白為Fel d 1,能使93.9%的貓科動物敏感患者敏感[14],過敏患者血清中針對貓過敏原的IgE抗體多數(shù)指向Fel d 1,占總過敏原活性的60%～90%[12]。

貓過敏原及其特性詳見表1[15-16]。

表1 貓過敏原及其特性[15-16]

1.2 犬源過敏原蛋白

犬過敏原Can f 1是一種在犬的唾液腺中產(chǎn)生的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白,與人類淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白同源[17-19],在多達(dá)50%～75%對犬皮屑敏感的受試者中結(jié)合IgE抗體[6],是犬主要的過敏原之一。目前,Can f 1仍然是流行病學(xué)研究中的主要過敏原[20],其蛋白結(jié)構(gòu)見圖2[21]。

該蛋白結(jié)構(gòu)由Min等[21]解析上傳至在線存儲庫http:∥www.wwpdb.org/,8epu 代表 Can f 1,該圖像由網(wǎng)站 (https:∥swissmodel.expasy.org/templates/8epu.1) 生成The protein structure was analyzed by Min et al[21]and uploaded to the online repository http:∥www.wwpdb.org/, and 8epu stands for Can f 1. The image was generated by the website (https:∥swissmodel.expasy.org/templates/8epu.1)

Can f 2、Can f 4、Can f 6組分與Can f 1同屬于載脂蛋白家族[5]。Can f 3來源于犬血清白蛋白,與貓的過敏原Fel d 2屬于同一類蛋白家族,而同一蛋白家族的成員間可能發(fā)生發(fā)叉反應(yīng)[22]。Can f 4是舌上皮組織表達(dá)的一種158個氨基酸的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白,該過敏原主要存在于唾液和皮屑中[23]。

Can f 5是一種前列腺激肽釋放酶(28 ku蛋白),在2009年也被確定為主要的犬過敏原,在70%的過敏患者中結(jié)合IgE,作為一種前列腺蛋白,它僅存在于公犬尿液中,并且與人類前列腺特異性抗原表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性,為犬過敏原暴露引起的精液超敏反應(yīng)提供了潛在的解釋[24]。Can f 7又稱 NPC2蛋白,也稱為CE1蛋白,是MD-16相關(guān)脂質(zhì)識別(ML)家族中的2 ku過敏原[25-26]。此外,也在犬的皮屑中觀察到了Can f 8,并將其歸為胱抑素家族的一員[27]。

犬過敏原及其特性見表2[4,28-29]。

表2 犬過敏原及其特性[4,28-29]

2 貓犬過敏原蛋白的重組表達(dá)

2.1 重組表達(dá)系統(tǒng)

重組蛋白藥物生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要包括真核表達(dá)系統(tǒng)(如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞等)和原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌、乳酸乳球菌等)[30]。目前批準(zhǔn)上市的重組蛋白藥物大多是在這兩個表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)[31]。用于表達(dá)重組蛋白的哺乳動物細(xì)胞主要包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0和NS0、人胚胎腎細(xì)胞HEK293、倉鼠腎細(xì)胞BHK-21等,它們具有類似于人源細(xì)胞的翻譯后修飾、外源基因的穩(wěn)定整合、可以大規(guī)模懸浮培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn),其中大約有70%的重組蛋白藥物是由CHO細(xì)胞生產(chǎn)的[32]。在原核表達(dá)系統(tǒng)中,大腸桿菌遺傳背景清楚,相對于CHO細(xì)胞,其表達(dá)量較高,能在培養(yǎng)基上快速繁殖、成本低, 是最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)[33],但由于缺乏翻譯后修飾(如糖基化),主要用于表達(dá)分子量較小、不需要翻譯后修飾的重組藥物[34]。

2.2 重組過敏原蛋白

在目前的研究報道中,貓過敏原Fel d 1重組蛋白一般采用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。裴業(yè)春[35]將Fel d 1鏈Ⅰ、Ⅱ拼接后插入到乙肝病毒核心抗原(HBcAg)中,構(gòu)建了pET28a-HBcAg-rFel d 1表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中;通過誘導(dǎo)表達(dá)后獲得了HBcAg-rFel d 1融合蛋白,大小約為37 ku。Schmitz等[36]將噬菌體Qβ的外殼蛋白的病毒樣顆粒(Qβ-VLP)作為Fel d 1表達(dá)載體,并在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá),獲得了Qβ-Fel d 1融合蛋白。Curin等[37]設(shè)計(jì)了一系列Fel d 1的衍生肽(包括Fel d 1 M1、M、MA、MB、MC、ME和MF),該系列肽均無典型的α-螺旋結(jié)構(gòu),不具有IgE反應(yīng)性;這些低過敏性衍生肽均含有誘導(dǎo)過敏原特異性阻斷IgG抗體和T細(xì)胞表位的序列元件,插入表達(dá)載體pET-28b后,在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),獲得了重組的Fel d 1低過敏性衍生物,其表達(dá)量為2～6 mg·L-1、純度高達(dá)90%以上,可用于過敏疫苗接種和耐受誘導(dǎo)。周婕[38]在構(gòu)建好的Fel d 1-IL-10(FIL)重組嵌合蛋白(含F(xiàn)el d 1、IL-10)的基礎(chǔ)上,通過基因工程定點(diǎn)突變技術(shù)對重組貓過敏原Fel d 1序列中抗原值高的位點(diǎn)進(jìn)行改造(23V→P,34V→P),插入載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得貓過敏原突變體蛋白,但未驗(yàn)證其抗原性。

許卓謙和劉志剛[39]利用pET-24(+)構(gòu)建表達(dá)載體,獲得了帶有his標(biāo)簽的Fel d 1 Ⅰ、Ⅱ鏈,但該重組Fel d 1蛋白發(fā)生了突變(如42 Met→Lys、55 Ile→Leu、74 Met→Thr)。此外,Gr?nlund等[40]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌表達(dá)后的Fel d 1鏈Ⅰ、Ⅱ混合后與IgE抗體結(jié)合能力比天然Fel d 1下降了25倍,可能與鏈Ⅰ、Ⅱ之間的連接及Fel d 1的三對二硫鍵(Cys3～Cys73、Cys44～Cys48、Cys7～Cys70)的正確配對有關(guān)。由此可見,重組過敏原Fel d 1蛋白有時不能正確折疊,或表達(dá)量不高、位點(diǎn)突變及二硫鍵錯配等問題可能會影響其免疫原性。

3 降低貓犬過敏原蛋白的治療方法

3.1 過敏原特異性免疫療法

過敏原特異性免疫療法,又稱脫敏治療,是目前唯一一種治療過敏性疾病的有效療法,其通過長期注射過敏原誘導(dǎo)患者耐受該過敏原從而不再產(chǎn)生過敏反應(yīng),即使停藥也有長期的療效[41]。國際上從20世紀(jì)70年代開始已經(jīng)開展對貓犬過敏原特異性免疫治療的研究。過敏原特異性免疫療法有多種給藥途徑,例如皮下、舌下或淋巴注射,并在小鼠和人類受試者中測試了該治療方法的安全性和有效性,已經(jīng)觀察到一些非常有希望的結(jié)果[42]。多項(xiàng)研究表明,這種方法對過敏性患者具有安全性和多重益處,能夠緩解呼吸道的主要癥狀,可以減少炎性反應(yīng)[43-44]。Alvarez-Cuesta[45]等使用標(biāo)準(zhǔn)化貓過敏原提取物對貓毛皮屑過敏患者進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)13.2 μg的Fel d 1抗原劑量具有一定的療效,且呈劑量依賴性,高劑量Fel d 1提取物(15 μg)達(dá)到有效的治療效果。據(jù)報道,患者獲益與誘導(dǎo)針對貓主要過敏原Fel d 1的IgG抗體以及減少皮膚和呼吸道癥狀有關(guān)。另一項(xiàng)研究顯示,與安慰劑組相比,接受貓科動物過敏原Fel d 1提取物皮下免疫療法的受試者中IgG4水平升高、對過敏原的皮膚反應(yīng)性降低、支氣管反應(yīng)性降低以及癥狀評分改善;臨床療效呈劑量依賴性,3.0和15.0 μg組在安慰劑組中均顯示出顯著變化,但彼此之間無顯著差異,可能需要高劑量的過敏原以實(shí)現(xiàn)更有效的治療[46]。然而,使用天然過敏原提取物或者未經(jīng)改變的重組蛋白進(jìn)行過敏原特異性免疫療法更易產(chǎn)生副作用。Mellerup等[47]研究表明,41%接受貓過敏原提取物特異性免疫治療的患者出現(xiàn)了嚴(yán)重的副作用。另外,用犬過敏原Can f 1提取物對狗毛皮屑過敏患者進(jìn)行特異性免疫治療的效果不佳,有待進(jìn)一步探討。

為了降低使用過敏原進(jìn)行免疫治療對患者的危害,通常需要降低過敏原蛋白的過敏性。聚合是降低過敏原蛋白過敏性最常見的方法[48]。過敏原聚合會導(dǎo)致暴露的IgE結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量減少,使其對過敏性患者外周血中嗜堿性粒細(xì)胞的活化能力低于正常過敏原,從而降低機(jī)體的過敏癥狀[49]。Calzada等[27]將Can f 1和Can f 5的聚合產(chǎn)物作為新型犬皮屑過敏物質(zhì)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)該聚合物具有低結(jié)合IgE和激活犬過敏患者嗜堿性粒細(xì)胞的能力,這種過敏性疫苗可以提供比天然提取物更安全的特性。

3.2 疫苗

另外,基于短肽的過敏原免疫療法是常規(guī)免疫療法的替代方法,由于短肽缺乏使肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面上的IgE交聯(lián)所需的三維結(jié)構(gòu),可以降低IgE介導(dǎo)的嚴(yán)重反應(yīng)風(fēng)險。因此,基于短肽的重組過敏原有望為過敏原免疫治療提供新的思路[50]。通過重組表達(dá)Fel d 1的T細(xì)胞抗原表位、開發(fā)一種Fel d 1低致敏原,使其能對免疫接種、誘導(dǎo)阻斷IgG抗體以及誘導(dǎo)耐受性都有用;這種過敏原特異性免疫療法一方面可以降低嚴(yán)重的副作用,另一方面能夠減少肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞上IgE的結(jié)合,從而減少過敏反應(yīng)。另外,這種短肽疫苗可以靶向過敏原特異性T細(xì)胞,比傳統(tǒng)疫苗更安全、保護(hù)率更高[51]。此外,Kaiser等[7]解析了重組Fel d 1蛋白的結(jié)構(gòu)(圖3),發(fā)現(xiàn)其由兩個鏈組成,N端和6個C端His殘基不受電子密度的限制;折疊后由8個螺旋組成,H1-H4和H5-H8對應(yīng)于天然Fel d 1的鏈Ⅰ和Ⅱ;對重組Fel d 1抗原表位進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)IgE結(jié)合的3個重要的抗原表位是25～38、46～59與15～28位(圖4),第一個抗原表位與人類血清的識別率達(dá)到46%。

A. Fel d 1鏈Ⅰ和Ⅱ; B. 電子密度云; C. Fel d 1單體A. Fel d 1 chains Ⅰ and Ⅱ; B. Electron density clouds; C. Fel d 1 monomer

3個IgE表位的相對定位顯示在Fel d1的分子表面上。a.方向與圖3C(左)相同;b.與a垂直的視圖;c.與b垂直的視圖The relative localization of three IgE epitopes is indicated on the molecular surface of Fel d 1. a.The same orientation as in Fig. 3C, left; b.The perpendicular view to a; c.The perpendicular view to b

通過對貓自身的主要過敏原Fel d 1進(jìn)行免疫來治療人類由Fel d 1引起的過敏[52]。裴業(yè)春[53]按照貓過敏原Fel d 1鏈Ⅰ、鏈Ⅱ連接后進(jìn)行表達(dá),制備了重組Fel d 1蛋白疫苗,免疫虎皮貓后,發(fā)現(xiàn)其毛發(fā)、下顎下腺中的Fel d 1含量下降15%～60%。同時,使用表達(dá)Fel d 1的真核表達(dá)質(zhì)粒proVAX-rFel d 1作為DNA疫苗,與蛋白疫苗按照1∶1比例混合后作為DNA/蛋白共免疫疫苗,并在BALB/c小鼠上進(jìn)行了預(yù)防和治療試驗(yàn)。結(jié)果顯示,注射DNA/蛋白共免疫疫苗的過敏小鼠血清中總IgE水平降低了600～800 ng·mL-1,抑制了肺部呼吸阻力的上升,降低了應(yīng)激過敏反應(yīng)的激烈程度[53]。

Nakatsuji等[54]基于序列比對和三級結(jié)構(gòu),預(yù)測了犬過敏原Can f 1蛋白中IgE表位的五個關(guān)鍵殘基(His86、Glu98、Arg111、Glu138和Arg152)(圖5);結(jié)果表明,殘基His86和Arg152為IgE構(gòu)象表位的候選者。Immonen等[55]發(fā)現(xiàn)了七個Can f 1的T細(xì)胞表位區(qū)域,由這七個表位區(qū)域組成的肽可用于犬過敏的免疫治療,這些肽表現(xiàn)出廣泛的T細(xì)胞反應(yīng)性,并且它們能夠有效地與白人群體中最常見的HLA-DRB1分子結(jié)合。Juntunen等[56]合成了過敏原Can f 1 T細(xì)胞表位的肽片段,發(fā)現(xiàn)這些合成肽比天然肽高10～30倍的致敏性,進(jìn)一步說明重組犬過敏原短肽疫苗有望成為治療過敏的有效途徑。

圖5 預(yù)測的Can f 1的 IgE 表位殘基[54]Fig.5 Predicted IgE epitope residues of Can f 1[54]

3.3 抗體

有研究表明,過敏原特異性中和抗體可以阻斷IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)[53]。卵黃抗體(immunoglobulin of yolk, IgY)是鳥類、爬行以及兩棲動物體內(nèi)產(chǎn)生的主要抗體,與哺乳動物的IgG相似,由蛋雞產(chǎn)生的IgY經(jīng)轉(zhuǎn)移聚集在卵黃當(dāng)中,提取后能夠作為預(yù)防和治療相應(yīng)疾病的多克隆抗體。一只蛋雞每年可以產(chǎn)生20 g以上的IgY[57],Akbari等[58]制備的抗LPS IgY提取物的產(chǎn)量為40 mg·蛋黃-1;周繼萍等[59]IgY抗體制備研究表明,蛋雞在經(jīng)四次免疫后IgY抗體效價達(dá)到1:51 200;段海龍等[60]制備的抗白唇竹葉青蛇毒IgY可在常溫下進(jìn)行制備、保存,且具有較強(qiáng)的耐酸性,在pH值為2的環(huán)境下仍可保持74%的活性;經(jīng)胰蛋白酶處理1 h時其活性下降不明顯;表明IgY具有制備簡單、產(chǎn)量大、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來已經(jīng)有許多IgY針對毒素、細(xì)菌、病毒、寄生蟲等方面的治療報道,例如蛇毒[60]、諾如病毒[61]、豬帶絳蟲[62]、大腸桿菌[63]、鴿毛滴蟲與白色念珠菌[64]等。

Satyaraj等[65]研究發(fā)現(xiàn)抗Fel d 1的兔多克隆抗體、過敏原特異性雞卵黃抗體IgY能夠與貓唾液中的Fel d 1結(jié)合,并有效地降低過敏患者血漿中Fel d 1的濃度,阻斷Fel d 1與IgE的結(jié)合以及IgE介導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒,從而降低過敏反應(yīng)。另外,他們將Fel d 1特異性卵黃抗體IgY添加到貓糧中(添加量為8 mg·kg-1),飼喂3周后,發(fā)現(xiàn)卵黃抗體IgY顯著降低了貓毛發(fā)中Fel d 1的含量;飼喂10周后,毛發(fā)中Fel d 1的平均含量下降了47%[66]。由此可見,重組Fel d 1蛋白卵黃抗體能夠中和過敏原蛋白,降低貓過敏原蛋白的分泌量,特異性抗體為對貓犬過敏癥的防治提供了一種新的方法。

4 存在的問題及解決策略

近幾十年來,人們?yōu)樨埲^敏原進(jìn)行免疫治療也作出了巨大努力。目前,對貓過敏患者的治療主要通過脫敏治療法實(shí)現(xiàn),通過反復(fù)注射貓皮屑的粗提取物或源自Fel d 1的多肽,治療后的患者仍然存在過敏癥狀或者產(chǎn)生了副作用[67-68]。過敏原阻斷抗體為中和貓犬過敏原提供了一種新的思路,包括貓犬過敏原的重組、過敏原阻斷抗體的制備及其在靶動物體內(nèi)阻斷的實(shí)際應(yīng)用效果等研究。但是,重組過敏原全長蛋白的策略往往不能正確折疊,其表達(dá)量不高、位點(diǎn)突變及二硫鍵錯配等問題可能會影響其免疫原性,有待進(jìn)一步從抗原表位序列上進(jìn)行優(yōu)化。今后,基于抗原多表位融合的策略研發(fā)高效特異性生物制劑(如特異性IgY抗體),不僅可以中和貓犬體內(nèi)的過敏原蛋白,從源頭上降低其含量,而且比疫苗更容易被機(jī)體吸收,有望解決寵物毛發(fā)過敏癥的源頭問題。