翁雅娟,李 蓓,芒 來,薛嘉寧,特日格樂,宋代玲,王國慶,藺雅楠

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動物科學研究與技術(shù)創(chuàng)新重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學觀測實驗站,內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學馬屬動物研究中心,呼和浩特 010018)

可變剪接(alternative splicing,AS)又稱為選擇性剪接?？勺兗艚邮钦婧松铼氂械囊环N在生命演化漫長過程中產(chǎn)生的調(diào)控方式[1]。前體mRNA通過選擇不同的剪接方式產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的成熟mRNA這一過程稱為可變剪接(選擇性剪接)[2]。這種調(diào)控方式使原本有限的基因序列可以根據(jù)環(huán)境的不同而編碼出多樣、復雜的蛋白質(zhì),從而更好地適應復雜的生活環(huán)境[3]?？勺兗艚訋缀醢l(fā)生在所有動物體的組織中,雄性動物最重要的生殖器官—睪丸也不例外,睪丸組織是可變剪接mRNA異構(gòu)體數(shù)量最豐富的組織之一[4]。精子生成又稱為精子發(fā)生,是以曲精細管為起始部位,精原細胞經(jīng)過有絲分裂和兩次減數(shù)分裂等一系列生理過程變?yōu)榫毎?精細胞再變?yōu)榫拥倪^程[5-8]。在精子發(fā)生的時期往往伴隨著十分復雜的機體調(diào)控機制。例如,蛋白質(zhì)的新舊交替,激素類輔助與調(diào)節(jié),細胞因子的靶向和調(diào)控等[9-10]。Chen 等[11]的研究結(jié)果表明,小鼠在發(fā)生可變剪接的基因數(shù)量變化模式與精子發(fā)生過程中的基因表達模式非常相似,說明可變剪接與雄性動物的精子生成密切相關(guān)。

前體mRNA的剪接主要通過形成剪接復合體的形式行使功能[12]。剪接復合體包含了核小RNA蛋白質(zhì)復合體和其他多種蛋白質(zhì)因子。這包括富含精氨酸和絲氨酸蛋白參與組成的核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)家族,是各種前體mRNA被加工成為核糖或蛋白復合體過程中最主要的一類蛋白質(zhì)[13]。hnRNP 家族C端富含甘氨酸,含有一個 RNA 識別域和一個核定位序列,C末端作用多樣,包括 RNA 結(jié)合、細胞定位及與蛋白之間的相互作用[14]。剪接過程主要包括剪接位點與前體mRNA剪接復合體的形成、內(nèi)含子的切除和外顯子的連接、剪接產(chǎn)物的釋放與復合體的解聚[12]。hnRNP家族通過與剪接沉默子結(jié)合,防止SR蛋白或者剪接體組件與可調(diào)控外顯子的聯(lián)系,從而引起外顯子跳躍[15]。其中hnRNPF通過與剪接位點的G束結(jié)合來控制可變剪接[16]。叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的外顯子2編碼區(qū)域與hnRNPF的第二個準RNA識別基序結(jié)合會抑制hnRNPF與靶前體mRNA結(jié)合,從而抑制可變剪接[17]。hnRNPF包含3種亞型:hnRNPH1、hnRNPH2與hnRNPH3,其中hnRNPH1在減數(shù)分裂細胞中表達并定位于染色體,會破壞減數(shù)分裂過程,損害生殖-支持細胞通信最終導致不育[18]。不止如此,當hnRNPF在細胞中異常表達時往往會伴隨著多種疾病的發(fā)生。

可變剪接事件的發(fā)生受剪接調(diào)節(jié)因子等的調(diào)控,剪接因子可通過對可變剪接調(diào)控,從而影響精子的生成。例如,牛睪丸中的某種結(jié)構(gòu)蛋白與其精子的生成息息相關(guān),可變剪接參與調(diào)控該基因的表達就會影響其精子的質(zhì)量,進而影響種群的繁殖效率[19]。剪接調(diào)節(jié)因子,如多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1(PTBP1)、多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白2(PTBP2)、RNA結(jié)合蛋白(RBMXL2和Sam68)等,可通過調(diào)控精子發(fā)生中的可變剪接事件保證精子的生成[20]。PTBP1和PTBP2是分別調(diào)節(jié)雄性哺乳動物睪丸中精原細胞有絲分裂和精母細胞減數(shù)分裂可變剪接的調(diào)節(jié)因子,能保證精子的正常生成;支架蛋白SYMPK是一種減數(shù)分裂所必需的相關(guān)蛋白,同時也與精原細胞的存活密切相關(guān),在睪丸內(nèi)表達量很高,該蛋白可以調(diào)控生殖細胞的可變剪接進而影響小鼠的精子生成過程[21-22]。孫武[23]發(fā)現(xiàn),大部分睪丸表達基因都發(fā)生了可變剪接,而且發(fā)生在成熟期的比例明顯高于其他時期,表明可變剪接事件在睪丸發(fā)育及精子生成中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。既然正常的基因可變剪接能促進精子的生成,那么異常的可變剪接也會對精子生成產(chǎn)生抑制作用,而這種情況便會導致雄性的生殖性能受到影響,嚴重時甚至會導致不育,例如:無頭精子綜合征[24-25]。Li等[26]對未性成熟與性成熟蒙古馬睪丸進行了轉(zhuǎn)錄組測序可變剪接分析,發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生過程中存在許多不同的可變剪接事件,發(fā)生可變剪接產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)大多發(fā)生外顯子跳躍。國外尚未有文章報道有關(guān)馬屬動物可變剪接對精子生成的影響。

本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)剪接因子hnRNPF在蒙古馬性成熟后的睪丸組織中表達量較高,可能對蒙古馬精子生成具有一定的影響。為研究可變剪接因子對蒙古馬精子生成的作用,本試驗以蒙古馬為研究對象,構(gòu)建hnRNPF過表達慢病毒載體,轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的蒙古馬睪丸支持細胞(sertoli cell,SC),檢測細胞的增殖情況及精子生成相關(guān)基因在不同細胞中的差異表達情況,揭示hnRNPF調(diào)控精子生成的作用機制,為提高蒙古馬精子數(shù)量與精液品質(zhì)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗對象 本研究采用蒙古馬睪丸支持細胞作為試驗材料。在試驗后續(xù)過程中所進行的細胞分離與體外培養(yǎng)的操作均嚴格按照本試驗室的流程進行[27]。

1.1.2 主要儀器、試劑 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)、數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(YiTong)、細胞計數(shù)板(Watson)、純水儀(OLABO)、-80 ℃冰箱(Haier)、臺式離心機(Sigma)、高速冷凍離心機(Sigma)、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(ESCO)、CFX實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)、普通PCR反應擴增儀(Bio-Rad)。

細胞培養(yǎng)液(50 mL):DMEM/F-12培養(yǎng)基+1%丙酮酸鈉+10%胎牛血清(FBS)+2%雙抗+0.001 5 g 碳酸氫鈉(NaHCO3)+2% 谷氨酰胺;清洗液(50 mL):杜氏硝酸緩沖鹽溶液(DPBS)+1%雙抗;細胞凍存液:FBS+二甲基亞砜(DMSO);胰蛋白酶溶液(Gibco);細胞活力檢測試劑盒(biosharp);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa);定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)試劑盒(TaKaRa)。

1.2 試驗方法

1.2.1 hnRNPF過表達慢病毒載體的構(gòu)建 通過NCBI官網(wǎng)https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/下載hnRNPF馬屬動物基因序列,由蘇州安升達生物科技有限公司進行過表達慢病毒載體的合成。

1.2.2 hnRNPF過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染蒙古馬睪丸支持細胞 選擇使用1×107濃度的過表達慢病毒載體進行轉(zhuǎn)染,將保存在-80 ℃冰箱中的過表達慢病毒載體取出,冰上溶解。實驗室前期研究顯示,蒙古馬睪丸支持細胞在第3代時細胞活性最高。取出培養(yǎng)好的第3代蒙古馬睪丸支持細胞,棄廢液,DPBS清洗兩次。根據(jù)病毒∶培養(yǎng)基為1∶9的比例抽取適量慢病毒載體和培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中,混勻后放入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后吸去皿中液體,加入培養(yǎng)基。以24 h為間隔,不同時間段拍照觀察,確定最佳轉(zhuǎn)染時間。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖活性 在96孔板中培養(yǎng)蒙古馬睪丸支持細胞,待細胞生長至約70%后,一組加入hnRNPF過表達慢病毒載體,一組不加,形成對照,每組設(shè)置4個重復。24 h后換液,并在分別轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h時更換90 μL培養(yǎng)液和10 μL CCK-8試劑,細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h,酶標儀檢測450 nm處吸光值,對比兩組細胞的增殖情況。

1.2.4 總RNA抽提試劑(TRIzol)法提取轉(zhuǎn)染細胞與未轉(zhuǎn)染細胞RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA (1)將1 mL TRIzol試劑加入細胞培養(yǎng)基中,樣本充分渦旋混勻15 s。15～30 ℃靜置10 min。(2)TRlzol:氯仿為5∶1。按照比例添加氯仿。小心蓋好樣品管。用手大力搖管15 s。15～30 ℃ 孵育15 min。2～8 ℃,離心機12 000 g離心15 min。(3)離心結(jié)束后管中分3層。紅色為酚-氯仿相層。然后依次為中間相和水相層。水相層無色。水相層轉(zhuǎn)移至新管保存。(4)在室溫下孵育樣品10 min。離心機溫度控制在4 ℃,12 000 g離心10 min。(5)棄上清。用75%的乙醇洗滌 RNA 沉淀一次。渦旋振蕩將沉淀彈起來。4 ℃ ,7 500 g離心5 min。在該過程結(jié)束時,冰上干燥RNA沉淀30 min。無 RNA 酶水70 μL吹打幾次溶解 RNA 。(6)溶解后,用酶標儀測定RNA濃度及純度,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒迅速將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20 ℃保存樣本。

1.2.5 qRT-PCR檢測精子生成相關(guān)基因在兩種細胞中的差異表達 選取精子生成相關(guān)基因(PKMYT1、CDC25C、YWHAZ、BUB1、BTRC、CCNE1、CALM1、PLK1、REC8、MAPK3、ADCY7)設(shè)計引物(表1),由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列信息

將轉(zhuǎn)染后的細胞設(shè)為試驗組,未轉(zhuǎn)染的細胞為對照組,每組設(shè)置3個重復,選取GAPDH作為內(nèi)參基因。反應體系:TB Green 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA模板2 μL,RNase-free ddH2O 8.5 μL。反應條件:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,95 ℃延伸15 s,共40個循環(huán);60 ℃退火30 s;4 ℃保存。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 qRT-PCR結(jié)果以F=2-ΔΔCt為運算公式計算,檢驗方法為獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異顯著,使用Graphpad prism軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 蒙古馬睪丸支持細胞培養(yǎng)

圖1為培養(yǎng)48 h蒙古馬睪丸支持細胞4倍鏡下圖片。由圖可見細胞已貼壁,視野內(nèi)細胞數(shù)量多。蒙古馬睪丸支持細胞呈現(xiàn)細長梭狀,在顯微鏡下略顯透明,但輪廓清晰,細胞核明亮清楚。

圖1 蒙古馬睪丸支持細胞培養(yǎng)Fig.1 Culture of Mongolian horse testicular sertoli cells

2.2 hnRNPF過表達慢病毒載體構(gòu)建

合成基因hnRNPF,連接至載體pGWLV10(GFP),構(gòu)建hnRNPF in pGWLV10(GFP),大抽并去內(nèi)毒素,包裝過表達慢病毒,滴度檢測。瓊脂糖凝膠電泳檢測構(gòu)建結(jié)果如圖2所示,目的條帶與目的基因片段的長度相一致,證明 hnRNPF in pGWLV10(GFP)慢病毒構(gòu)建成功,可以用于后續(xù)試驗。

圖中電泳圖譜泳道從左到右依次為空載體、hnRNPF過表達慢病毒載體(目的條帶)、參照條帶The electrophoresis lanes in the figure from left to right are empty vector, hnRNPF overexpression lentiviral vector (target bands), and reference bands

2.3 hnRNPF過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染蒙古馬睪丸支持細胞

將構(gòu)建的hnRNPF過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染至支持細胞中,分別在24、48、72、96 h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。通過圖3比較發(fā)現(xiàn),在72 和96 h載體轉(zhuǎn)染效率相同,說明載體在72 h后轉(zhuǎn)染效率不再升高,考慮細胞活性,轉(zhuǎn)染效率最適時間為72 h,故選擇載體轉(zhuǎn)染細胞72 h時用于后續(xù)試驗。

A-D圖依次為轉(zhuǎn)染時間24、48、72、96 h時熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染狀態(tài)The A-D plots show the transfection status under fluorescence microscope at 24, 48, 72 and 96 h of transfection

2.4 CCK-8檢測結(jié)果與分析

根據(jù)酶標儀數(shù)據(jù)結(jié)果,利用Graphpad prism軟件作圖顯示(圖4)?？梢园l(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)曲線呈先下降再上升的趨勢。兩組細胞的增殖情況從被轉(zhuǎn)染的24 h內(nèi)出現(xiàn)下降趨勢,但在轉(zhuǎn)染24 h后呈現(xiàn)上升趨勢,并且轉(zhuǎn)染后的細胞增長趨勢始終高于未轉(zhuǎn)染的細胞。由此可得出,hnRNPF剪接因子會促進蒙古馬睪丸支持細胞的增殖。

圖4 hnRNPF過表達慢病毒感染細胞CCK-8活力增殖曲線Fig.4 Activity proliferation curve of cells transfected with hnRNPF overexpression lentivirus by CCK-8

2.5 qRT-PCR檢測結(jié)果與分析

選擇與精子生成相關(guān)基因進行實時熒光定量PCR試驗,以轉(zhuǎn)染hnRNPF過表達慢病毒細胞為試驗組,未轉(zhuǎn)染病毒細胞為對照組。以GAPDH作為內(nèi)參基因,Graphpad prism軟件作圖(圖5)。結(jié)果顯示,上述11種基因在轉(zhuǎn)染病毒細胞中的表達量均遠高于對照組細胞,且差異顯著,說明hnRNPF可能對于蒙古馬精子生成具有促進作用。

*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;****.P<0.000 1

3 討 論

精子生成是一個復雜的生理過程,包括有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成。大多可變剪接所需的反式作用剪接因子都在睪丸中表達。精子生成過程中一些重要的基因在特定的發(fā)育階段有著不同的剪接變異。參與基因可變剪接過程的剪接因子對精子生成具有重要意義。Ptbp2是神經(jīng)系統(tǒng)中的重要可變剪接因子,可調(diào)節(jié)睪丸細胞中生殖細胞的mRNA可變剪接,對男性睪丸細胞的存活以及生殖能力至關(guān)重要。當生殖細胞中的Ptbp2缺失時會導致精母細胞和精細胞的增殖下降,并且伴隨睪丸中mRNA剪接異常,影響生殖細胞存活[20]。RNA結(jié)合蛋白Rbm5同樣也是男性生殖細胞中重要的剪接因子,對于精子生成選擇性剪接具有重要作用[28]。當Rbm5缺失時,大規(guī)模功能性基因的選擇性剪接發(fā)生異常,影響基因表達。Ranbp9是一種RNA結(jié)合蛋白,可以與多種剪接因子(SR蛋白和HNRNPs家族)結(jié)合共同調(diào)節(jié)與精子生成相關(guān)的可變剪接,確保精子生成可變剪接的正確性[29]。將生殖細胞中的Ranbp9特異性敲除會導致精母細胞和精細胞大量缺失,進而導致生殖能力明顯下降。乳腺癌擴增序列2(BCAS2)作為一種剪接因子通過復制蛋白A復合物參與DNA損傷修復,經(jīng)過小鼠試驗發(fā)現(xiàn)BCAS2剪接因子對于小鼠受精卵的內(nèi)源性及外源性DNA損傷具有修復作用,可以通過復制蛋白A復合物維持小鼠胎盤基因組的完整性[30]。BCAS2在小鼠睪丸中高度富集,Vasa-Cre 對生精細胞BCAS2有破壞作用,當BCAS2缺失時就會導致男性不育,對精母細胞具有影響但對精原細胞影響不大,經(jīng)過進一步研究發(fā)現(xiàn),BCAS2參與睪丸精原細胞的可變剪接并對精子發(fā)生過程中有絲分裂向減數(shù)分裂的轉(zhuǎn)變和男性生育能力具有重要作用[30]。有研究發(fā)現(xiàn),改變轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應元件調(diào)節(jié)因子(CREM)的表達會導致男性不育,在對比了CREM發(fā)生可變剪接產(chǎn)生的不同異構(gòu)體對人和種公馬精子生成的影響,發(fā)現(xiàn)缺乏CREM激活子同樣會導致種公馬不育[31]。

異質(zhì)核糖核蛋白 (hnRNP)是在哺乳動物細胞中大量表達的典型RNA結(jié)合蛋白的大家族。在hnRNP蛋白中發(fā)現(xiàn)了4種不同類型的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,包括RNA識別基序(RRM)、非經(jīng)典準RRM(q-RRM)、富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域和K同源性(KH)結(jié)構(gòu)域[32]。核不均一核糖核蛋白hnRNPF包含3個非經(jīng)典q-RRM,該蛋白最經(jīng)典的功能是調(diào)節(jié)可變剪接,主要通過調(diào)節(jié)與外顯子相關(guān)的可變剪接事件來調(diào)節(jié)基因的可變剪接[33]。有體外研究表明,hnRNPF 通過其 q-RRM 直接結(jié)合富含 G 的前 mRNA 序列參與可變剪接調(diào)控[34]。雄性生殖細胞最獨特的特征是復雜的可變剪接模式,因此剪接因子在雄性生殖過程中就顯得尤為重要。通過檢測hnRNP家族在小鼠睪丸中的表達含量,發(fā)現(xiàn)hnRNPF在睪丸中高度表達[35]。因此,有理由相信hnRNPF在雄性生殖過程中具有重要的作用。目前,hnRNPF對雄性生殖系統(tǒng)及精子生成方面的具體影響還未可知。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過表達hnRNPF轉(zhuǎn)染后的SC細胞增殖情況要優(yōu)于未轉(zhuǎn)染的SC細胞;說明剪接因子hnRNPF會促進蒙古馬睪丸支持細胞的增殖。為從基因水平上研究hnRNPF對精子生成的影響,本研究選取了11個與精子生成相關(guān)的基因,研究其在兩類細胞中的差異表達,例如:酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5單加氧酶激活蛋白(YWHAZ)通過與細胞周期調(diào)控因子(CDC25)蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能,參與細胞G1/S期和G2/M期轉(zhuǎn)變,在有絲分裂間期發(fā)揮作用[36]。YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎的各個時期均有表達,同時定位于早期胚胎的細胞質(zhì)與細胞核中,提示該蛋白可能在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮一定的作用。CDC25C是一種磷酸酶編碼基因,對細胞周期的調(diào)控有著重要作用[37]。蛋白激酶膜相關(guān)酪氨酸/蘇氨酸1(PKMYT1)是一種周期性的調(diào)節(jié)蛋白激酶,能夠有效地去除磷酸化,生物學功能是防止在細胞增殖時發(fā)生DNA改變[38]。苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1(BUB1)也影響細胞分裂,有研究表明,BUB1作為有絲分裂檢查點的平臺蛋白,可通過形成復合物的形式直接或間接對其他重要周期蛋白進行調(diào)控,從而影響整個細胞周期的進程[39-40]。Polo樣激酶1(PLK1)對于早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要,有研究顯示PLK1會調(diào)節(jié)小鼠精子發(fā)生減數(shù)分裂過程中的DNA雙鏈斷裂(DSBs)修護[41]。敲除精子細胞中的PLK1會導致不育[42]。在本研究中,qRT-PCR試驗顯示精子生成相關(guān)基因的表達量在轉(zhuǎn)染過表達hnRNPF慢病毒載體的蒙古馬睪丸支持細胞中高于未轉(zhuǎn)染的細胞,且差異顯著,表明剪接因子hnRNPF可能通過調(diào)控上述基因的表達量從而調(diào)節(jié)精子生成,具體作用機理還需進一步的探尋。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了hnRNPF后的蒙古馬睪丸支持細胞增殖情況優(yōu)于未轉(zhuǎn)染的細胞,精子生成相關(guān)基因在轉(zhuǎn)染后細胞中的表達量較高,且差異顯著。結(jié)果表明,剪接因子hnRNPF發(fā)生可變剪接可能對蒙古馬精子的生成起促進作用,研究成果為提高蒙古馬精子數(shù)量和精液品質(zhì)提供了新的思路。