郭云鵬,牛 頓,李 爽,姜興昊,張立夏,任桂萍,尹杰超

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030)

犬糖尿病(canine diabetes mellitus,CDM)是一種較為常見的內(nèi)分泌性代謝病,其主要臨床表現(xiàn)包括:多飲、多尿、多食和消瘦[1],據(jù)統(tǒng)計(jì)犬糖尿病的發(fā)病率達(dá)到了0.3%～0.6%,且呈逐年上漲的趨勢(shì)[2]。其主要病因是由胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足而引起的糖代謝障礙,從而繼發(fā)脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、水及電解質(zhì)的代謝紊亂[3-4]。

CDM是一個(gè)復(fù)雜的多因素疾病,根據(jù)臨床上犬對(duì)胰島素治療的表現(xiàn),可以分為胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus, IDD)和胰島素非依賴型糖尿病(insulin resistance diabetes,IRD)[5-6]。

IDD多發(fā)于5～12歲的中老年犬,類似于人類的1型糖尿病(T1DM),二者的病理過程均為胰島細(xì)胞的進(jìn)行性破壞造成胰島素分泌減弱至完全喪失,但二者的致病機(jī)制卻存在一定的差異。犬IDD表現(xiàn)為原因不明的特發(fā)性胰島β細(xì)胞損害,且該過程很少發(fā)生在幼犬及青年犬中[1]。同時(shí)無論是何種原因(生長/類固醇激素拮抗、妊娠、肥胖、藥物、炎癥以及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)障礙)所引起的IRD,因?yàn)殚L期高血糖造成了胰島β細(xì)胞的耗竭,原發(fā)性的IRD最終轉(zhuǎn)歸為繼發(fā)性IDD[7]。由此可見,治療CDM的關(guān)鍵是長期維持安全的血糖水平及胰島β細(xì)胞的數(shù)量與活性。

成纖維細(xì)胞生長因子-21(fibroblast growth factor 21,FGF-21)是一種肽類激素,主要在肝、胰腺和脂肪等組織中表達(dá),可調(diào)節(jié)機(jī)體的能量平衡、減輕體重和改善血糖[8-9]。許多研究表明,FGF-21改善肥胖與2型糖尿病(T2DM)的血糖及代謝狀態(tài)同時(shí)對(duì)其并發(fā)癥也有顯著的預(yù)防與治療作用[10]。據(jù)報(bào)道,FGF-21通過加速糖酵解,改善葡萄糖攝取和抑制糖異生從而降低T1DM患者的血糖,同時(shí)恢復(fù)棕色脂肪的功能,而且還能抑制1型糖尿病患者的并發(fā)癥[11]。此外,Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)犬源化FGF-21(cFGF-21)可通過調(diào)節(jié)stat3信號(hào)通路改善與抑制肝糖異生相關(guān)的高血糖的機(jī)制,另外通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (ERK)1/2和Akt信號(hào)通路保護(hù)β細(xì)胞免于凋亡。因此,FGF-21是一種非常具有應(yīng)用前景的犬糖尿病治療候選藥物。

在嚙齒類動(dòng)物和靈長類動(dòng)物中,FGF-21的體內(nèi)半衰期非常短約為1 h,并且易在體外和體內(nèi)發(fā)生蛋白水解降解[13]。小分子量的FGF-21蛋白(約22 ku)容易通過腎小球過濾而消除[14-15]。因此,增加FGF-21半衰期和穩(wěn)定性是其臨床應(yīng)用的瓶頸問題。

細(xì)胞穿膜肽 (cell penetrating peptide,CPPs) 是一類具有穿過質(zhì)膜能力的短肽(5～30 aa),被用于以“蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)”的方式有效地幫助“分子貨物”在活細(xì)胞中內(nèi)化,已經(jīng)成為最有前途的蛋白質(zhì)遞送載體[15]。細(xì)胞穿膜肽可根據(jù)理化性質(zhì)分為三類:陽離子肽、兩親性肽和疏水性肽[16]。精氨酸的胍基在富含精氨酸的CPP的細(xì)胞穿透活性中起著重要作用,并且精氨酸的同型寡聚體(7～12個(gè)精氨酸)比天然富含精氨酸的CPP(如TAT 48-60)明顯更有效[17]。據(jù)報(bào)道,Fc融合蛋白藥物是將蛋白藥物與免疫球蛋白G(IgG)的可結(jié)晶片段(Fc)域相結(jié)合從而改善蛋白藥物的血清半衰期[18]。本研究分別將犬源IgG的Fc、11個(gè)精氨酸組成的穿膜肽R11(RRRRRRRRRRR)和HIV的反式激活調(diào)控蛋白(transactivating regulatory protein,TAT)穿膜肽TAT 47-57(YGRKKRRQRRR)與cFGF-21連接,構(gòu)建融合蛋白Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21。通過T1DM小鼠模型,來比較這三種重組蛋白藥物治療T1DM的藥效差異,為研發(fā)治療犬糖尿病長效性降糖藥物提供重要的前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因和細(xì)胞 基因R11-cFGF-21、Fc-cFGF-21、TAT-cFGF-21由上海生工公司合成;pSUMO-cFGF-21質(zhì)粒和HepG2細(xì)胞由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥教研室提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡健康的C57BL/6雄性小鼠(n=70),購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司(合格證號(hào):No.210726220100493528)。所有動(dòng)物都飼養(yǎng)在22～25 ℃的可控溫度和55%～65%的相對(duì)濕度下,每12 h進(jìn)行光照/黑暗循環(huán),自由進(jìn)食和飲水。

1.1.3 主要試劑 T4 DNA連接酶購自New England BioLabs公司;標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker購自Fermentas 公司限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa 公司;IL-1β ELISA試劑盒購自Andygee公司;IL-10 ELISA 試劑盒購自Andygee公司;IL-17A ELISA試劑盒購自Andygee公司;胰島素ELISA試劑盒購自Andygee公司;SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所;ROS試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 cFGF-21的制備及體外活性檢驗(yàn) 將R11-cFGF-21、Fc-cFGF-21和TAT-cFGF-21基因分別與pSUMO載體進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒,然后重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到Rosetta受體細(xì)胞中。選擇鑒定正確的質(zhì)粒接種于含氨芐青霉素(100 μg·mL-1)的液體培養(yǎng)基中,37 ℃,100 r·min-1,培養(yǎng)6 h。以1∶100比例接種于8 L的發(fā)酵罐中,當(dāng)菌液OD600 nm升至7～8時(shí),加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度0.25 mmol·L-1),6 h后收集菌體。而后利用AKTA purifier 100系統(tǒng)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行第一次親和層析,將SUMO蛋白酶按1∶50的比例加入蛋白中進(jìn)行酶切,再通過鎳柱二次親和去除SUMO獲得純度為60%的目標(biāo)蛋白。

將cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21蛋白稀釋至終濃度為10、100和1 000 nmol·L-1并與饑餓12 h HepG2細(xì)胞于37 ℃共同培養(yǎng)24 h。用GOD-POD法檢測(cè)培養(yǎng)基中殘留的葡萄糖含量。培養(yǎng)結(jié)束后取2 μL上清液加到200 μL檢測(cè)液中,設(shè)立3個(gè)復(fù)孔檢測(cè)剩余葡萄糖量,避光處理8 min后,檢測(cè)其OD490 nm值,通過公式計(jì)算出葡萄糖的消耗率,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析蛋白的降糖活性。細(xì)胞中葡萄糖的吸收率公式如下:

葡萄糖濃度(mmol·L-1)=(A樣品/A標(biāo)準(zhǔn))×5.55;細(xì)胞葡萄糖消耗率=[(C空白葡萄糖-C給藥葡萄糖)/C空白葡萄糖]×100%。

1.2.2 動(dòng)物模型與治療方案 建立T1DM模型,首先制備鏈脲佐菌素(STZ)溶液,STZ溶解在無菌檸檬酸鹽緩沖液(0.05 mol·L-1檸檬酸鈉,pH4.5)中;而后將饑餓12 h的小鼠以60 mg·kg-1的劑量進(jìn)行腹腔注射,每天注射1次,3 d后測(cè)定小鼠血糖,小鼠血糖濃度>16.67 mmol·L-1則認(rèn)為造模成功[19]。

分別選取T1DM模型小鼠(40只)和空白對(duì)照小鼠(6只)?？瞻讓?duì)照組(n=6):生理鹽水注射空白組小鼠。模型組(n=8):生理鹽水治療的T1DM模型小鼠。有研究結(jié)果表明50 nmol·kg-1FGF-21的劑量治療糖尿病小鼠是安全有效的[12]。因此,設(shè)立4個(gè)治療組(n=8):分別用上述4種重組蛋白(50 nmol·kg-1)治療的T1DM模型小鼠。本試驗(yàn)分為3個(gè)階段:第一階段,每天治療一次(第1～14天);第二階段,每3 d治療一次(第15～29天);第三階段,每5 d治療一次(第30～44天)。

1.2.3 糖尿病小鼠的血糖、OGTT及HbA1c的檢測(cè) 治療過程中,每隔3 d對(duì)空腹過夜的小鼠進(jìn)行尾部采血檢測(cè)血糖。保證每次測(cè)量的小鼠都空腹12 h,為小鼠盡量建立統(tǒng)一的條件。在每個(gè)試驗(yàn)階段結(jié)束當(dāng)天檢測(cè)小鼠12 h內(nèi)血糖波動(dòng)水平(自由飲食),早上8:00開始第一次檢測(cè),此后每隔4 h檢測(cè)一次小鼠血糖。試驗(yàn)結(jié)束前對(duì)所有小鼠空腹12 h后進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test, OGTT)。給每只小鼠喂食新鮮葡萄糖溶液(2 g·kg-1),分別在攝入后0、30、60、90、120 min測(cè)量血糖。采集各組小鼠血清測(cè)定其HbA1c(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院測(cè)定)的含量和胰島素水平(胰島素ELISA試劑盒,北京安迪基因生物技術(shù)有限公司)。

1.2.4 氧化應(yīng)激和炎癥因子檢測(cè) 在保存的胰腺組織加入放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmune precipitation assay,RIPA)溶液和蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),充分研磨組織,收集上清液。胰腺的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)通過SOD測(cè)定試劑盒和ROS測(cè)定試劑盒。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素17(IL-17A)和白細(xì)胞介素10(IL-10)采用IL-1β ELISA試劑盒、IL-17A ELISA試劑盒和IL-10 ELISA試劑盒測(cè)定。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分別取各組小鼠肝、腎、腸和脂肪等組織,用TRIzol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝中靶基因葡萄糖6磷酸酶(G6pase)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT 1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT 4)的轉(zhuǎn)錄水平;腸和腎中靶基因葡萄糖鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(SGLT 1)和鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT 2)的轉(zhuǎn)錄水平;脂肪組織中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的轉(zhuǎn)錄水平。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物

1.2.6 肝功能及脂代謝檢測(cè) 血樣以3 000 r·min-1離心 10 min分離血清。隨后,將各組血清樣本送至東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院進(jìn)行天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的檢測(cè)。

1.2.7 HE染色 將小鼠的胰腺組織在4%多聚甲醛中固定48 h。然后將部分組織包埋在石蠟中并用超薄半自動(dòng)切片機(jī)(上海Leica Microsystems公司)切片。用蘇木精和伊紅染色后,用光學(xué)顯微鏡觀察每張載玻片并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 重組cFGF-21蛋白制備

SDS-PAGE 分析結(jié)果表明,帶有SUMO標(biāo)簽的重組蛋白SUMO-cFGF-21、SUMO-R11-cFGF-21、SUMO-TAT-cFGF-21、SUMO-Fc-cFGF-21相對(duì)分子質(zhì)量分別是39、41、41和69 ku;去標(biāo)簽后的cFGF-21、R11-cFGF-21、TAT-cFGF-21、Fc-cFGF-21蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別為21、23、23和50 ku(圖1a～h)。體外細(xì)胞葡萄糖吸收的結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,3個(gè)濃度的cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21以劑量依賴性方式顯著增加HepG2細(xì)胞中的葡萄糖攝取(P<0.01)(圖1i)。但是,在相同濃度下,cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21在促進(jìn)葡萄糖攝取方面無顯著差異。

a～d. SUMO-cFGF-21、SUMO-R11-cFGF-21、SUMO-TAT-cFGF-21和SUMO-Fc-cFGF-21的表達(dá);e～h. cFGF-21、R11-cFGF-21、TAT-cFGF-21和Fc-cFGF-21的純化;i. 四種重組cFGF-21對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響,與空白組相比,**. 差異極顯著(P<0.01)a-d. Expression of SUMO-cFGF-21, SUMO-R11-cFGF-21, SUMO-TAT-cFGF-21 and SUMO-Fc-cFGF-21;e-h. Purification of cFGF-21, R11-cFGF-21, TAT-cFGF-21 and Fc-cFGF-21; i. Effects of four kinds of recombinant cFGF-21 on glucose uptake in HepG2 cells. Compared with the control group,**. Extremely significant difference (P<0.01)

2.2 糖尿病鼠血糖、血糖波動(dòng)情況和HbA1c檢測(cè)

在整個(gè)研究過程中,cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21在試驗(yàn)的第一階段能夠?qū)⒀撬骄S持在接近正常水平,將血糖從最初的(20.03±1.98)、(19.45±1.57)和(19.63±1.62)mmol·L-1分別降低到為(8.82±0.47)、(9.85±0.61)和(9.24±0.95)mmol·L-1。TAT-cFGF-21在試驗(yàn)的第一階段將血糖從最初的(20.03±1.65)mmol·L-1降低到(12.2±0.95)mmol·L-1(圖2a),與其他治療組相比效果略差。末次給藥24 h后,cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組血糖在12 h內(nèi)波動(dòng)趨勢(shì)相近(10～14 mmol·L-1),與cFGF-21組相比,TAT-cFGF-21組在12 h內(nèi)血糖水平較高(P<0.01),波動(dòng)較大(14～21 mmol·L-1)(圖3a)。

a. 第一階段小鼠血糖檢測(cè);b. 第二階段小鼠血糖檢測(cè);c. 第三階段小鼠血糖檢測(cè)。與cFGF-21組相比,*. 差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01)a. The first stage of blood glucose detection in mice; b. The second stage of blood glucose detection in mice; c. The third stage of blood glucose detection in mice. Compared with the cFGF-21 group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference (P<0.01)

a～c分別為第一階段、第二階段和第三階段結(jié)束后12 h內(nèi)血糖波動(dòng)檢測(cè);d. OGTT;e. HbA1c水平。與cFGF-21組相比,*. 差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01)a-c are the blood glucose fluctuation tests within 12 hours after the end of phase 1, phase 2 and phase 3, respectively; d. OGTT; e. HbA1c levels. Compared with the cFGF-21 group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01)

在試驗(yàn)的第二階段,每3 d給藥一次,用藥時(shí)間間隔變大,cFGF-21、TAT-cFGF-21治療組的血糖較Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21有明顯上升。cFGF-21、TAT-cFGF-21組的血糖分別上升到(15.1±0.53)和(17.86±0.92)mmol·L-1,而Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21組的血糖無顯著增長,仍能保持在(10.82±0.57)和(11.2±0.67)mmol·L-1(圖2b)。末次給藥72 h后,cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組血糖在12 h內(nèi)波動(dòng)趨勢(shì)相近(11～15 mmol·L-1),與cFGF-21組相比,TAT-cFGF-21組在12 h內(nèi)血糖顯著升高(P<0.01),保持高水平波動(dòng)(19～24 mmol·L-1)(圖3b)。

在試驗(yàn)的第三階段,每5 d治療一次,cFGF-21、TAT-cFGF-21組血糖從第30天(即第一次連續(xù)5 d沒有給藥)開始升高,兩組血糖顯著高于Fc-FGF-21、R11-FGF-21組(P<0.01)(圖2c)。末次給藥120 h后,與cFGF-21組相比,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21血糖仍維持在較低水平(P<0.01),且波動(dòng)趨勢(shì)相近(12～16 mmol·L-1),而TAT-cFGF-21組血糖仍保持在較高水平(P<0.01),血糖保持高水平波動(dòng)(20～24 mmol·L-1)(圖3c)。

與模型組相比,cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的HbA1c水平分別顯著降低了35.15%、46.67%和46.96%(P<0.01)。與cFGF-21組相比,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的HbA1c水平分別顯著降低了11.68%和11.81%(P<0.01)(圖3e)。以上結(jié)果表明,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21長效降糖效果顯著優(yōu)于cFGF-21和TAT-cFGF-21。

2.3 cFGF-21改善糖尿病鼠的口服葡萄糖耐量

與模型組相比,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21組的OGTT顯著改善,接近空白組。而cFGF-21和TAT-cFGF-21組與模型組相比雖然有所改善,但與R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21組結(jié)果有顯著差異(P<0.01)。在整個(gè)試驗(yàn)過程中,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21組的改善效果明顯優(yōu)于cFGF-21和TAT-cFGF-21組(圖3d)。因此,經(jīng)過Fc和R11修飾的cFGF-21治療的糖尿病小鼠對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力優(yōu)于cFGF-21和TAT-cFGF-21組。

2.4 cFGF-21調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的分子機(jī)制

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,與模型組相比,cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21治療顯著降低了小鼠肝組織中G6pase和PEPCK的轉(zhuǎn)錄(P<0.01)(圖4a、c),同時(shí)促進(jìn)了GK、GLUT1和GLUT4轉(zhuǎn)錄的升高(P<0.05,P<0.01)(圖4b、e、f)。由于G6pase和PEPCK表達(dá)的降低會(huì)抑制肝糖異生,同時(shí)GK、GLUT1和GLUT4表達(dá)的升高將會(huì)促進(jìn)葡萄糖的吸收,這些變化將導(dǎo)致血糖的降低。與模型組相比,4個(gè)治療組均顯著增加了脂肪組織中PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01),其中Fc-cFGF-21組的PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平最高。這表明各治療組在脂肪組織中的胰島素敏感性顯著提高,葡萄糖吸收能力顯著增強(qiáng)(圖4 d)。此外,cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21治療后,糖尿病小鼠的SGLT1和SGLT2轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.01)。與cFGF-21組相比,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的SGLT1和SGLT2轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(P<0.01),而TAT-cFGF-21組的SGLT1和SGLT2轉(zhuǎn)錄量沒有顯著差異(圖4 g、h)。以上結(jié)果表明,4種融合蛋白能促進(jìn)肝、腸、腎和脂肪組織中的葡萄糖吸收,其中Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21增加葡萄糖吸收的能力明顯優(yōu)于cFGF-21和TAT-cFGF-21。

a～h. G6pase、GK、PEPCK、PPARγ、GLUT1、GLUT4、SGLT1和SGLT2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平;與模型組對(duì)照相比,*. 差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01);與cFGF-21組比較,#. 差異顯著(P<0.05);##. 差異極顯著(P<0.01)a-h. mRNA transcript levels of G6pase, GK, PEPCK, PPARγ, GLUT1, GLUT4, SGLT1 and SGLT2. Compared with the model group,*.Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01). Compared with the cFGF-21 group,#. Significant difference(P<0.05);##. Extremely significant difference(P<0.01)

2.5 cFGF-21改善糖尿病鼠的脂質(zhì)代謝并修復(fù)肝損傷

治療后,cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的TG、TC和LDL顯著低于模型組(P<0.01),而HDL水平顯著高于模型組(P<0.01),與正常水平相當(dāng)。與模型組相比,TAT-cFGF-21組的TG、TC和LDL的水平顯著降低(P<0.05),HDL水平顯著高于模型組(P<0.05)。與cFGF-21組相比,TAT-cFGF-21的TG、TC和LDL水平顯著上升(P<0.05,P<0.01),而HDL水平顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 血脂檢測(cè)

與模型組對(duì)照相比顯著,*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01);與cFGF-21組比較,#.差異顯著(P<0.05);##.差異極顯著(P<0.01)

Compared with the model group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01); Compared with the cFGF-21 group,#. Significant difference(P<0.05);##. Extremely significant difference(P<0.01)

此外,在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)還測(cè)定了肝功能指標(biāo)。4個(gè)治療組的AST、ALT、ALP、GGT水平顯著低于模型組(P<0.05,P<0.01)。與cFGF-21相比,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的AST和ALT水平極顯著降低(P<0.01),ALP、GGT水平顯著降低(P<0.05)。與cFGF-21相比,TAT-cFGF-21組的AST、ALT、ALP水平極顯著上升(P<0.01),GGT水平顯著升高(P<0.05)(表3)。以上結(jié)果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21可以改善糖尿病引起的肝損傷和脂質(zhì)代謝紊亂。

表3 肝功能檢測(cè)

與模型組對(duì)照相比顯著,*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01);與cFGF-21組比較,#.差異顯著(P<0.05);##.差異極顯著(P<0.01)

Compared with the model group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01); Compared with the cFGF-21 group,#. Significant difference(P<0.05);##. Extremely significant difference(P<0.01)

2.6 cFGF-21修復(fù)糖尿病鼠的胰腺損傷

為探討cFGF-21對(duì)糖尿病小鼠氧化應(yīng)激的影響,測(cè)定了胰中氧化應(yīng)激相關(guān)酶的含量。結(jié)果表明cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的活性氧ROS水平(圖5d)顯著低于模型組(P<0.05),而抗氧化酶SOD水平(圖5e)顯著高于模型組(P<0.01)。與cFGF-21組相比Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的ROS表達(dá)水平更低(P<0.05),SOD水平有更為顯著的升高(P<0.01),而TAT-cFGF-21組SOD和ROS的表達(dá)水平都與cFGF-21組較為接近。

a～f分別為IL-1β、IL-10、IL-17A、ROS、SOD表達(dá)水平和血清胰島素水平。與模型組對(duì)照相比,*. 差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01);與cFGF-21組比較,#. 差異顯著(P<0.05);##. 差異極顯著(P<0.01)a-f are IL-1β, IL-10, IL-17A, ROS, SOD expression levels and serum insulin levels, respectively. Compared with the model group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01). Compared with the cFGF-21 group,#. Significant difference(P<0.05);##. Extremely significant difference(P<0.01)

ELISA結(jié)果表明,4個(gè)治療組糖尿病小鼠胰腺中的炎性因子,如IL-1β和IL-17A的表達(dá)水平(圖5 a,c)與模型組相比顯著降低(P<0.01),抗炎因子IL-10表達(dá)水平(圖5b)與模型組相比顯著升高(P<0.01)。TAT-cFGF-21組的IL-1β和IL-10表達(dá)水平與cFGF-21組沒有顯著差異,而IL-17A的表達(dá)水平比cFGF-21組有明顯升高。Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組炎癥因子IL-1β和IL-17A的表達(dá)水平明顯低于cFGF-21組,而抗炎因子IL-10表達(dá)水平遠(yuǎn)高于cFGF-21組。以上結(jié)果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21能更大程度地改善因糖尿病而引發(fā)胰腺的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,而TAT-cFGF-21與cFGF-21沒有明顯差異。

HE染色結(jié)果表明,空白組胰島區(qū)域相對(duì)完整,其中包含大量的胰腺β細(xì)胞。相反,模型組胰島由于變形而受損,并且胰腺β細(xì)胞幾乎不可見。在cFGF-21組中,胰島的結(jié)構(gòu)得到部分改善,胰腺β細(xì)胞的數(shù)量增加。TAT-cFGF-21組的胰島有一定程度的恢復(fù),胰島β細(xì)胞數(shù)量仍然減少。而R11-cFGF-21組胰島結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰,胰腺β細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。Fc-cFGF-21組胰島結(jié)構(gòu)更加清晰,胰腺β細(xì)胞分布更均勻,數(shù)量明顯升高(圖6)。因此,經(jīng)過Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療后,糖尿病小鼠的胰腺修復(fù)情況明顯優(yōu)于cFGF-21組,而TAT-cFGF-21組胰腺有一定程度的修復(fù),但與cFGF-21組相比沒有顯著差異。此外,與模型組相比4個(gè)治療組血清胰島素都有顯著的升高(P<0.05,P<0.01),其中Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的胰島素水平明顯高于cFGF-21組(P<0.05,P<0.01),而TAT-cFGF-21組與cFGF-21組沒有顯著的差異(圖5f)。

a. 胰腺組織HE染色(紅色箭頭表示胰島區(qū)域);b. 胰島β細(xì)胞在胰島中的百分比,與cFGF21組相比,*.差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01)a. HE staining of pancreatic tissue (Red arrow indicates islet area); b. Percentage of pancreatic β-cells in islets. Compared with the cFGF21 group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01)

3 討 論

對(duì)于CDM的分類目前獸醫(yī)界尚有分歧,但無論哪一類型的CDM在病程的終末都會(huì)因?yàn)橐葝uβ細(xì)胞的損壞造成對(duì)胰島素的依賴[20]。當(dāng)前治療CDM的胰島素主要為人源及豬源胰島素類似物,其缺陷為血糖下降較快易造成低血糖、造成低鉀血癥以及產(chǎn)生抗胰島素抗體等問題[21]。

犬FGF-21在前期研究中表現(xiàn)出穩(wěn)定安全降糖的特點(diǎn),同時(shí)可調(diào)節(jié)機(jī)體和氧化應(yīng)激水平[12]。與胰島素相比,犬FGF-21治療犬糖尿病的優(yōu)點(diǎn):無免疫原性;調(diào)節(jié)血脂、肝功能;改善炎癥和氧化應(yīng)激,同時(shí)還能保護(hù)重要器官(如:胰腺和肝等)。但將其開發(fā)成為一種更高效、更長效的降糖藥物,仍需要在利用率和半衰期及長期藥效方面進(jìn)行研究。

IgG 型免疫球蛋白的Fc具有許多功能,如延長半衰期、形成二聚體與受體結(jié)合等[22]。細(xì)胞穿透肽(CPPs)已被證明是一種有效的遞送載體,試驗(yàn)表明它能將多種物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多肽和小分子藥物等通過體內(nèi)及體外的方式,在保證活性分子依然發(fā)揮作用的情況下導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi),而且不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)[23]。作者構(gòu)建了3種融合蛋白Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21,通過治療T1DM小鼠模型來比較3種融合蛋白和cFGF-21治療效果,為提高cFGF-21治療CDM的長效性研究提供重要的依據(jù)。

3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)

FGF-21通過結(jié)合和激活由共受體β-Klotho和成纖維細(xì)胞生長因子受體1c(FGFR1c)組成的受體復(fù)合物而發(fā)揮其生物效應(yīng)[24]。由于結(jié)構(gòu)上的差異FGF-21分子的C端相對(duì)于N端的蛋白水解速度高達(dá)10倍,可能會(huì)改變藥代動(dòng)力學(xué)及其藥效。與FGF-21的C端相連產(chǎn)生的復(fù)合物會(huì)降低對(duì)β-Klotho的親和力,使其作為FGF-21受體的激動(dòng)劑的效力降低;而與FGF-21的N-端相連產(chǎn)生的復(fù)合物不存在這方面的弊端[25]。因此,為了盡最大程度保證cFGF-21的生物學(xué)功能,選擇將這3種標(biāo)簽分別與cFGF-21的N端連接,構(gòu)建3種融合蛋白,即:Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21。

由于犬FGF-21序列與小鼠FGF-21序列表現(xiàn)出約80%的相似性,并且兩個(gè)序列之間的功能區(qū)幾乎相同,因此推測(cè)cFGF-21可以在小鼠細(xì)胞或模型鼠中表現(xiàn)出其生物學(xué)活性。

3.2 Fc和R11提高了cFGF-21的長效降糖作用

在試驗(yàn)的不同階段,重組蛋白表現(xiàn)出不同的能力,隨著給藥間隔時(shí)間的延長,cFGF-21長效降血糖能力逐漸下降,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21長效降血糖能力逐漸突顯。同樣12 h血糖波動(dòng)試驗(yàn)結(jié)果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21可將小鼠血糖維持在較低水平且波動(dòng)平穩(wěn)。HbA1c能反映患者2～3個(gè)月的血糖平均水平,檢測(cè)結(jié)果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21可使小鼠血糖保持長期平穩(wěn)。

綜上所述,Fc和R11的修飾提高了cFGF-21的長效降糖作用,可使糖尿病小鼠的血糖長期保持接近正常的穩(wěn)定水平。

3.3 cFGF-21調(diào)控糖代謝的分子機(jī)制

許多研究表明,肝的糖代謝在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[26]。葡萄糖生成的速度由關(guān)鍵步驟的葡萄糖生成酶(如PEPCK和G6Pase)的表達(dá)/激活決定[27]。FGF-21通過誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)的表達(dá)來增強(qiáng)葡萄糖攝取,而胰島素通過增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位,增加糖的攝取[28]。鈉依賴性葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLT1和SGLT2)在腎和腸道的葡萄糖吸收中起關(guān)鍵作用,已被提出作為糖尿病和心肌病的新型治療策略[29]。在本研究中,Real-time PCR分析結(jié)果顯示,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21顯著降低了糖尿病小鼠肝中G6pase、PEPCK、腎SGLT1和腸道中SGLT2的轉(zhuǎn)錄水平,提高了肝中GLUT1。這些結(jié)果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21更有效抑制肝糖異生、促進(jìn)肝組織的糖吸收以及抑制腎和腸道中葡萄糖重吸收來維持長期降糖作用。

3.4 Fc和R11提高了cFGF-21改善血脂代謝及肝功能的能力

據(jù)報(bào)道,糖尿病患者血脂異常會(huì)產(chǎn)生冠心病等并發(fā)癥[30]。模型組小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的血脂異常,而經(jīng)Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療的小鼠LDL、TC和TG水平顯著降低(表2),且HDL水平與空白對(duì)照組接近,這表明Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21改善了糖尿病鼠的血脂代謝紊亂。此外,在糖尿病患者中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)伴隨的肝疾病[31]。在本研究中,作者還發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠在不進(jìn)行任何治療的情況下出現(xiàn)了肝損傷(與空白組小鼠相比,ALP、ALT、AST、GGT水平更高),而Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。這些結(jié)果表明,在各治療組中Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21顯著改善了高血糖引起的血脂異常和肝功能。

3.5 Fc和R11提高了cFGF-21修復(fù)胰的能力

有研究發(fā)現(xiàn)FGF-21通過抗氧化反應(yīng)和抑制NF-κB炎癥途徑下調(diào)TNF-α、IL-1β和IL-17A,上調(diào)IL-10的表達(dá)水平來減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肥胖和急性炎癥等的嚴(yán)重程度[32-33]。此外,活性氧ROS增多影響胰島β細(xì)胞生理活性,并降低靶細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性[32]。本研究中,糖尿病小鼠肝在未接受任何治療的情況下處于高氧化應(yīng)激狀態(tài),經(jīng)Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療的小鼠ROS表達(dá)水平顯著降低,抗氧化酶SOD表達(dá)水平顯著增加,抑制了胰腺的氧化應(yīng)激反應(yīng)。胰腺炎癥會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的損傷,進(jìn)而加重糖尿病患者的病情[33]。此外,脂肪中PPARγ的水平上升導(dǎo)致脂聯(lián)素分泌增加,間接增加了胰島素敏感性和抗炎作用[34]。本研究中,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療的模型鼠的炎癥因子IL-1β和IL-17A表達(dá)水平顯著降低,而PPARγ和抗炎因子IL-10表達(dá)水平明顯增加。這些結(jié)果表明,Fc和R11修飾后的cFGF-21抑制了胰腺炎癥的發(fā)生,改善了氧化應(yīng)激反應(yīng),最終導(dǎo)致胰腺損傷被修復(fù),這可能是Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21長效降糖的主要原因。

HE染色結(jié)果顯示,模型組胰島嚴(yán)重變形,胰島β細(xì)胞幾乎全部消失,各治療組不同程度地修復(fù)了胰腺損傷。其中Fc-cFGF-21組修復(fù)效果最為理想,R11-cFGF-21組胰島結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰,胰島β細(xì)胞明顯增加,TAT-cFGF-21和cFGF-21組的胰島有一定程度的恢復(fù),胰島β細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少。病理結(jié)果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21顯著修復(fù)了胰腺損傷,TAT-cFGF-21修復(fù)胰腺能力較差。

胰腺的β細(xì)胞被損壞導(dǎo)致胰島素分泌不足,這是CDM的主要病因之一。本研究中,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21提高了糖尿病鼠血清胰島素水平并改善了糖耐受,且治療效果顯著優(yōu)于cFGF-21。這些結(jié)果表明,Fc和R11修飾的cFGF-21有效地修復(fù)胰腺損傷,促進(jìn)了胰島素分泌進(jìn)而改善機(jī)體調(diào)節(jié)血糖的能力。

3.6 不同穿膜肽對(duì)cFGF-21治療效果的影響

穿透肽(CPP)進(jìn)入細(xì)胞的具體分子機(jī)制目前還未揭示,不過任何一種CPP都不是以單一方式發(fā)揮穿膜作用。推測(cè)包括以下兩種方式:1、通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞;2、通過靜電作用與細(xì)胞膜相結(jié)合,而后誘導(dǎo)膜脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生短暫的孔隙進(jìn)而直接滲透進(jìn)入靶細(xì)胞。

TAT和R11是陽離子CPP,賴氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R)對(duì)CPP攜帶正電荷起主要作用。Arg在側(cè)鏈有一個(gè)胍基,而Lys有一個(gè)銨基,胍基與脂質(zhì)雙層的相互作用力明顯強(qiáng)于Lys的胺基,這通常導(dǎo)致富含Arg的CPP比富含Lys的CPP顯示出更高的細(xì)胞膜親和性[35]。富含精氨酸的CPP毒性小,并且Arg的CPP在低微摩爾濃度下不會(huì)引起膜滲漏[36]。

因?yàn)镕GF-21需要與細(xì)胞膜受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[37],R11的化學(xué)組成決定其比TAT對(duì)細(xì)胞膜更具親和力,因此這可能是R11-cFGF-21表現(xiàn)出比TAT-cFGF-21具有更好治療效果的主要原因。但TAT-cFGF-21的總體降糖效果差于cFGF-21,筆者推測(cè)可能是TAT更傾向于通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞的滲透作用強(qiáng)于R11,致使有很大一部分TAT-cFGF-21進(jìn)入細(xì)胞中無法發(fā)揮其生物學(xué)功能,故TAT的融合反而降低了細(xì)胞膜外TAT-cFGF-21的濃度。

4 結(jié) 論

R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21可以顯著改善血脂代謝和肝功能,同時(shí)通過改善胰腺氧化應(yīng)激和炎癥,從而修復(fù)胰島β細(xì)胞,增加胰島素的分泌,且治療效果優(yōu)于cFGF-21和TAT-cFGF-21。經(jīng)R11和Fc分子修飾的cFGF-21提高了其體內(nèi)的生物有效性,且增強(qiáng)了長效降糖作用。