彭月梅,葉 狀,汪飛燕,王禮躍,馮永翠,王樂樂,候照峰,許金俊,陶建平,劉丹丹*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,揚(yáng)州 225009;2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,揚(yáng)州 225009)

雞球蟲病(coccidiosis)是由艾美耳科球蟲(Eimeriaspp.)引起的一種寄生性原蟲病[1]。毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)是致病性較強(qiáng)的雞小腸球蟲,主要危害8～18周齡的雞,可引起急性小腸球蟲病,嚴(yán)重降低家禽的生長(zhǎng)性能,且在環(huán)境中長(zhǎng)期存活難以消除,給家禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。目前,雞球蟲病的防治主要是預(yù)防性使用抗球蟲藥物和疫苗免疫兩種方法,然而耐藥蟲株的出現(xiàn),藥物殘留肉蛋,以及活疫苗免疫存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn),使球蟲病的防治受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。重組亞單位疫苗相比活疫苗易于儲(chǔ)存,通過外源抗原激發(fā)宿主的免疫反應(yīng),不會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng),較為安全,目前重組亞單位疫苗的研究重點(diǎn)是篩選有效的保護(hù)性抗原,已有報(bào)道如EtMIC1[5]、EtMIC2、3-1E[6]、EmTFP250[7]、Emgam56、Emgam82[8]和Engam59[9]等重組蛋白免疫雞群可在一定程度上提高血清抗體水平,降低卵囊產(chǎn)量。因此,篩選有效的保護(hù)性抗原開發(fā)高效重組亞單位疫苗可為球蟲病的防控提供新策略[10-11]。

球蟲的卵囊壁非常堅(jiān)實(shí),是保護(hù)球蟲在外界環(huán)境中長(zhǎng)期存活并保有感染性的重要屏障,蛋白質(zhì)是其主要組成成分[12]。卵囊壁蛋白是由位于配子體內(nèi)成壁體(wall forming body,WFB)的前體蛋白經(jīng)多種酶加工而成,已發(fā)現(xiàn)兩類前體蛋白,一類富含半胱氨酸,證實(shí)其在二硫鍵交聯(lián)的形成方面發(fā)揮重要作用[13];另一類富含酪氨酸,被酶解加工成富含酪氨酸的小分子多肽,再經(jīng)氧化還原反應(yīng),通過二硫鍵的交聯(lián)形成多酪氨酸聚合物,進(jìn)而參與卵囊壁的形成[14-16]。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)是一種重要的過氧化物酶,預(yù)測(cè)其具有谷胱甘肽過氧化物酶活性,通過催化谷胱甘肽(glutathione,GSH)還原H2O2的氧化還原反應(yīng)形成二硫鍵或酪氨酸交聯(lián)[17],從而在卵囊壁形成中發(fā)揮重要作用[16,18-20]。對(duì)巨型艾美耳球蟲和弓形蟲的卵囊壁蛋白的研究結(jié)果證實(shí),過氧化物酶可催化酪氨酸交聯(lián),同時(shí)促使半胱氨酸形成二硫鍵,完成囊壁蛋白間的催化交聯(lián)進(jìn)而參與形成卵囊壁[18-22]。綜上,通過抑制此類蛋白酶的活性,降低二硫鍵或酪氨酸交聯(lián)的形成等氧化還原反應(yīng)可為研制免疫阻斷型抗球蟲亞單位疫苗提供新策略。課題組前期對(duì)毒害艾美耳球蟲成壁體蛋白和卵囊壁蛋白進(jìn)行了比較蛋白組學(xué)分析,篩選出差異表達(dá)蛋白EnGPX[23],通過體外原核表達(dá),制備多克隆抗體,結(jié)合Western blot和激光共聚焦免疫熒光定位等技術(shù),以及氨基酸結(jié)構(gòu)域分析,證實(shí)該蛋白在卵囊壁形成過程中發(fā)揮了重要作用,以期為研制免疫阻斷型球蟲亞單位疫苗提供新抗原[23]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 毒害艾美耳球蟲揚(yáng)州株由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室保存;BALB/c小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試驗(yàn)過程中參照揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查表[202103058(小鼠)]對(duì)小鼠實(shí)施安樂死,動(dòng)物尸體全部經(jīng)高壓滅菌并密封交至揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物尸體處理中心集中處理。

1.1.2 主要試劑和儀器 表達(dá)載體pET-28a(+)、兔抗rEnGAM59多克隆抗體,由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備保存;FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;鼠抗6×HIS標(biāo)簽單克隆抗體、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)等均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;Ni-NTA親和層析介質(zhì)購(gòu)自金斯瑞生物科技公司;QuickAntibody-Mouse3W小鼠快速免疫佐劑購(gòu)自Biodragon公司。超高分辨率激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8 STED)購(gòu)自Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 EnGPX基因的克隆及序列分析 根據(jù)毒害艾美耳球蟲(Houghton株)谷胱甘肽過氧化物酶(EnGPX)基因序列(GenBank登錄號(hào):XM_013581216)設(shè)計(jì)特異性引物,上游引物F:5′-ATGCTTCTGACGCGCGCGAC-3′;下游引物R:5′-CTACTGCAGCACACCCTCCTTG-3′,預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的基因大小為753 bp,引物由華大基因科技股份有限公司合成。參照葉狀等[15]的方法提取毒害艾美耳球蟲配子體總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR擴(kuò)增EnGPX基因進(jìn)行測(cè)序。將所獲EnGPX基因序列與GenBank中已收錄的毒害艾美耳球蟲EnGPX和柔嫩艾美耳球蟲EtGPX進(jìn)行同源性比對(duì),并預(yù)測(cè)分析其編碼蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 EnGPX的原核表達(dá)、純化及鑒定 根據(jù)EnGPX基因序列及pET-28a(+)載體上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物,上游引物:5′-TCGGAATTCATGCTTCTGACGCGCGCGAC-3′,含EcoR I酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基;下游引物:5′-TATGCGGCCGCGACTGCAGCACACCCTCCTTG-3′,含NotI酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。將PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體進(jìn)行NotⅠ、EcoRⅠ雙酶切,T4 DNA Ligase連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-EnGPX,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),構(gòu)建重組菌pET28a(+)-EnGPX/BL21,接種至含0.5%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中,0.2 mmol·L-1IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h,收集菌體,冰浴超聲裂解(功率為30%,超聲2 s,間隙3 s),進(jìn)行SDS-PAGE可溶性分析。Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白。

1.2.3 鼠抗rEnGPX多克隆抗體的制備及檢測(cè) 取50 μL重組蛋白(1 μg·μL-1)與等體積Quick Antibody-Mouse3W佐劑快速混合,參照說明書免疫6周齡BALB/c小鼠并分離血清,獲得鼠抗rEnGPX多克隆抗體,間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。同時(shí)取毒害艾美耳球蟲天然配子體蛋白,Western blot檢測(cè)鼠抗rEnGPX多克隆抗體特異性,一抗為制備的鼠抗rEnGPX多克隆抗體(1∶200稀釋),二抗為HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1∶20 000稀釋)。

1.2.4 重組蛋白反應(yīng)原性和交叉反應(yīng)原性檢測(cè) 以鼠抗rEnGPX多克隆抗體、毒害艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清、巨型艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清和柔嫩艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清(1∶200稀釋)為一抗,HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的綿羊抗雞IgG(1∶20 000稀釋)為二抗,Western blot檢測(cè)重組蛋白的反應(yīng)原性及種間交叉反應(yīng)原性。

1.2.5 EnGPX蛋白的免疫熒光定位 參照劉丹丹[12]的方法取毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子、第三代裂殖子、配子體和未孢子化卵囊制成蟲體滴片,以鼠抗rEnGPX多克隆抗體(1∶100稀釋)為一抗,FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶500稀釋)為二抗,進(jìn)行免疫熒光定位分析;同時(shí)與rEnGAM59進(jìn)行共定位,其一抗為兔抗rEnGAM59多克隆抗體(1∶100稀釋),二抗為Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶500稀釋)。

2 結(jié) 果

2.1 EnGPX基因的克隆與序列分析

EnGPX序列為753 bp,編碼250個(gè)氨基酸,為一個(gè)完整的開放閱讀框(ORF),無信號(hào)肽,預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為27.7 ku,GenBank登錄號(hào)為MW588 202.1。與GenBank中已收錄的毒害艾美耳球蟲(Houghton株)EnGPX(XM_013581216)和柔嫩艾美耳球蟲(Houghton株)EtGPX(XM_013376537)序列相似性分別為99.1%、96.1%。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示EnGPX蛋白屬于谷胱甘肽過氧化物酶家族,具有谷胱甘肽過氧化物酶活性,第70-235位氨基酸為一個(gè)硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域,第96-111位氨基酸為GPX的活性位點(diǎn)。

2.2 EnGPX的原核表達(dá)、純化鑒定及其鼠抗效價(jià)檢測(cè)

重組蛋白rEnGPX大小約為30 ku,主要以包涵體形式存在,經(jīng)Ni-NTA純化后能被6×HIS標(biāo)簽單克隆抗體識(shí)別,間接ELISA檢測(cè)其抗體效價(jià)為1∶204 800。鼠抗rEnGPX多克隆抗體能夠識(shí)別天然配子體蛋白(圖1),大小約為40 ku,高于體外重組表達(dá)蛋白大小,推測(cè)其由于體外原核表達(dá)的重組蛋白與天然配子體蛋白的空間構(gòu)象不同導(dǎo)致蛋白遷移率不同。

M. 蛋白相對(duì)分子質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 天然配子體蛋白M. Protein molecular weight marker; 1. Natural proteins of gametocyte

2.3 重組蛋白rEnGPX的反應(yīng)原性和交叉反應(yīng)原性檢測(cè)

重組蛋白rEnGPX能夠被鼠抗rEnGPX多克隆抗體(圖2a)、毒害艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清(圖2b)、巨型艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清(圖2c)以及柔嫩艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清(圖2d)所識(shí)別,pET-28a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白以及未轉(zhuǎn)化的BL21菌體蛋白未發(fā)生反應(yīng),證明該重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性和交叉反應(yīng)原性。

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. pET28a(+)-EnGPX/BL21 IPTG誘導(dǎo);2. pET28a(+)/BL21 IPTG誘導(dǎo);3. BL21 IPTG誘導(dǎo)。a. 鼠抗重組蛋白多克隆抗體;b. 毒害艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清;c. 巨型艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清;d. 柔嫩艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清M. Protein molecular weight marker; 1. pET28a(+)-EnGPX/BL21 induced by IPTG; 2. pET28a(+)/BL21 induced by IPTG; 3. BL21 induced by IPTG. a. Mouse anti-recombinant proteins polyclonal antibody; b. The recovery serum from chickens infected with E. necatrix; c. The recovery serum from chickens infected with E. maxima; d. The recovery serum from chickens infected with E. tenella

2.4 EnGPX蛋白的免疫熒光定位

EnGPX蛋白主要分布于配子體內(nèi)的成壁體及卵囊壁上,在二代裂殖子和三代裂殖子中未定位到該蛋白(圖3)。課題組前期研究結(jié)果顯示rEnGAM59主要定位于Ⅱ型成壁體(WFBⅡ)上,本研究與兔抗rEnGAM59多克隆抗體的共定位結(jié)果顯示,EnGPX蛋白和rEnGAM59一樣,主要分布于配子體內(nèi)的Ⅱ型成壁體上(圖3A～E),并隨著蟲體發(fā)育整合于卵囊壁上(圖3K～O)。陰性鼠血清對(duì)照(圖3F～J和圖3P～T)未檢測(cè)到此蛋白(圖3H、3R)。

A、F、K和P. 明場(chǎng);B、G、L和Q. DAPI染色;C和M. 鼠抗rEnGPX多克隆抗體(FITC標(biāo)記二抗);H和R. 陰性鼠血清(FITC標(biāo)記二抗);D、I、N和S. 兔抗rEnGAM59多克隆抗體(Cy3標(biāo)記二抗);E、J、O和T. DAPI、FITC和Cy3疊加;GAM. 配子體;O. 早期卵囊;標(biāo)尺為5 μm A, F, K and P. Bright field; B, G, L and Q. DAPI stain; C and M. Immunofluorescence localization with FITC-conjuncted mouse anti-rEnGPX polyclonal antibodies; H and R. Immunofluorescence localization with FITC-conjuncted Negative serum; D, I, N and S. Immunofluorescence localization with Cy3-conjuncted rabbit anti-rEngam59 polyclonal antibody; E, J, O and T. Merge of DAPI,FITC and Cy3; GAM. Gametocyte; O. Early stage of oocyst; The scale is 5 μm

3 討 論

基于課題組前期對(duì)毒害艾美耳球蟲成壁體及卵囊壁的比較蛋白組學(xué)研究,獲得了差異表達(dá)蛋白EnGPX,因其在卵囊壁形成過程中被激活,所以在卵囊壁上的表達(dá)量高于配子體,體外重組表達(dá)后,證實(shí)其具有較好的反應(yīng)原性和交叉反應(yīng)原性,且主要存在于配子體內(nèi)的II型成壁體(WFBⅡ)上,隨著蟲體發(fā)育參與了卵囊壁的形成。

艾美耳球蟲配子體蛋白及卵囊壁蛋白主要是通過形成二酪氨酸鍵及二硫鍵在卵囊壁形成過程中發(fā)揮重要作用,而這一過程主要是在酶介導(dǎo)反應(yīng)中完成[24]。氨基酸功能預(yù)測(cè)分析顯示,本研究獲得的EnGPX為一種谷胱甘肽過氧化物酶編碼基因,具有谷胱甘肽過氧化物酶活性。谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)以谷胱甘肽(glutathione,GSH)為反應(yīng)底物和電子供體,催化還原型GSH轉(zhuǎn)化為氧化型GSH[25],并將過氧化氫或氫過氧化物還原為水或相應(yīng)醇類,其中,第96-111位氨基酸為GPX的催化位點(diǎn),其內(nèi)部活性位點(diǎn)由UGC編碼的半胱氨酸殘基Cys108替代了UGA編碼的Sec(硒半胱氨酸),為半胱氨酸谷胱甘肽過氧化物酶(CysGPX)[26-27]。硒具有提高酶活性的功能,CysGPX的催化活性低于硒半胱氨酸谷胱甘肽過氧化物酶(SecGPX),因此CysGPX可利用H2O2參與新合成蛋白質(zhì)的折疊過程[28-29],在發(fā)生反應(yīng)時(shí)過氧化物將Cys108-SH氧化為Cys108-SOH,然后與另一亞基的Cys殘基發(fā)生縮合反應(yīng),形成穩(wěn)定的分子間二硫鍵[16,30],并經(jīng)硫氧還蛋白還原,完成催化循環(huán)[30],參與卵囊壁的形成過程。而在EnGPX內(nèi)部含有一個(gè)硫氧還蛋白(TRX)結(jié)構(gòu)域(第70—235位),該結(jié)構(gòu)域的活性中心含有FAD結(jié)構(gòu)域,可通過NADPH催化兩個(gè)Cys-SH可逆氧化為二硫鍵,催化二硫鍵的形成和重排[31-33],此外,硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有順式脯氨酸,可與活性位點(diǎn)半胱氨酸結(jié)合,維持蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[31,34]。

早在1976年,Lawrence和Burk[35]研究出不包含Sec的GPX,參與以有機(jī)過氧化物為基質(zhì)催化NADPH的氧化反應(yīng)。洪雅真等[36]克隆分析了扇形游仆蟲GPX編碼序列,其活性中心Cys(UGU編碼)替代了Sec,為非硒依賴型蛋白,可通過硫氧還蛋白系統(tǒng),高效還原過氧化物,這種情況在植物和嚙齒類動(dòng)物中也有發(fā)現(xiàn)[37-38]。Sztajer等[39]發(fā)現(xiàn)在惡性瘧原蟲中存在假定的的GPX基因,可作用于廣譜氫過氧化物的過氧化物酶,內(nèi)部含有Cys殘基參與形成分子內(nèi)二硫鍵,動(dòng)力學(xué)分析顯示,其可通過硫氧還蛋白系統(tǒng)高效還原過氧化物[40]。線蟲的表皮過氧化物酶可在角質(zhì)層膠原蛋白中催化形成二酪氨酸、三酪氨酸和異酪氨酸交聯(lián)殘基,是形成角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)外層的蛋白質(zhì)復(fù)合物,其中,淋巴絲蟲GPX分泌同系物gp29(表皮糖蛋白)的表達(dá)水平與生長(zhǎng)發(fā)育階段保持一致,同時(shí)角質(zhì)層膠原蛋白交聯(lián)水平增加以維持角質(zhì)層的強(qiáng)度,且該功能與抗氧化活性高度相關(guān)[41]。以上研究結(jié)果可進(jìn)一步論證本研究獲得的EnGPX作為一種谷胱甘肽過氧化物酶,在球蟲卵囊壁蛋白的二硫鍵形成中發(fā)揮重要作用。

綜上可知,EnGPX蛋白存在于毒害艾美耳球蟲配子體內(nèi)的II型成壁體上,隨著蟲體發(fā)育整合到了卵囊壁上。結(jié)合氨基酸序列分析,推測(cè)其作為一種過氧化物酶在催化卵囊壁蛋白二硫鍵的形成發(fā)揮了重要作用。

4 結(jié) 論

成功克隆了毒害艾美耳球蟲谷胱甘肽過氧化物酶EnGPXORF編碼序列,預(yù)測(cè)其通過催化GSH介導(dǎo)的活性位點(diǎn)Cys殘基之間的二硫鍵交聯(lián)等一系列氧化還原反應(yīng),參與了配子體蛋白形成卵囊壁的過程。體外重組表達(dá)蛋白制備的多抗,將EnGPX成功定位于配子體內(nèi)的II型成壁體和卵囊壁上。本研究結(jié)果將為研制免疫阻斷型抗球蟲亞單位疫苗提供重要靶點(diǎn)。