基于環(huán)境DNA 技術(shù)的珠江中下游魚類多樣性初步研究

朱書禮，陳蔚濤，武 智，夏雨果，楊計平，李躍飛，李 捷

中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部珠江中下游漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站/國家漁業(yè)資源環(huán)境廣州觀測實驗站，廣東 廣州 510380

魚類是水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，不僅為人類提供了豐富的食物蛋白，也維護著水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[1-2]。然而，受棲息地退化、過度捕撈、水污染、氣候變化和外來物種入侵等因素的影響[1,3]，魚類生物多樣性和漁業(yè)資源銳減，進而威脅水生態(tài)系統(tǒng)功能、漁業(yè)經(jīng)濟和人類生存[4-5]。對魚類物種分布和種群動態(tài)的準確、及時地監(jiān)測與評估顯得尤為迫切，同時也可為漁業(yè)資源相關(guān)保護和管理決策的制定提供科學指導。利用傳統(tǒng)魚類監(jiān)測方法，如電捕、網(wǎng)捕、陷阱誘捕等[6]，雖可獲得魚類種類和種群的關(guān)鍵信息，但存在成本高、費時費力、調(diào)查范圍有限[7]、破壞性大、稀有物種捕獲率低[7-8]、形態(tài)鑒別困難[9]等問題。傳統(tǒng)調(diào)查方法已無法滿足及時、全面和準確的魚類監(jiān)測和評估要求。因此，迫切需要更準確、有效和經(jīng)濟的調(diào)查方法，以彌補漁業(yè)資源監(jiān)測和管理方面的不足。

近年來，環(huán)境DNA (Environmental DNA,eDNA) 技術(shù)作為一種新興的檢測評估方法，被認為是生物多樣性研究中發(fā)展和普及最快的方法之一[10-11]。eDNA 是指存在于任何環(huán)境樣品 (如水、冰、土壤、沉積物、生物膜和空氣) 中的DNA 的總和[7]。對于魚類來說，eDNA 通常是魚類體細胞釋放到水體中的胞內(nèi)遺傳物質(zhì)和細胞結(jié)構(gòu)裂解或死亡后釋放到水體中的胞外DNA[12-13]。eDNA 技術(shù)通過直接提取環(huán)境樣品中的DNA，利用特異性引物進行PCR 擴增和高通量測序，對環(huán)境樣本中存在的多個目標物種進行識別[14]?；趀DNA 技術(shù)的調(diào)查方法具有靈敏度高、分辨率高、效率高、成本低和無損傷等優(yōu)點，是解決漁業(yè)資源調(diào)查和管理難題的有效方法[15-16]。eDNA 技術(shù)首次在魚類研究中的應(yīng)用是關(guān)于特定物種的監(jiān)測[17]和魚類多樣性研究[18]。目前，eDNA 技術(shù)在漁業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于漁業(yè)管理、魚類種類及多樣性監(jiān)測、資源量評估和種群分布等[8,19-21]。

珠江是中國南方第一大河，全長2 214 km，流域面積45.37 萬km2，年徑流量約3 300 億m3[22]。珠江地處熱帶、亞熱帶季風氣候區(qū)，氣候溫和多雨，地形地貌復雜多樣[23]。獨特的生境孕育了珠江豐富的魚類資源，魚類物種多樣性在全球大河流域中排名第四，特有種類數(shù)位居第二[24]。據(jù)統(tǒng)計，珠江水系記錄魚類達682 種，其中特有種242 種(亞種)，種類數(shù)和特有種數(shù)均居中國各流域之首。近幾十年來，由于人類活動影響加劇，導致珠江生態(tài)環(huán)境退化、魚類適宜棲息地喪失和水生生物入侵等，造成魚類種群衰減、物種喪失和魚類群落結(jié)構(gòu)與功能改變[25-27]。為此，政府和管理部門實施了多項漁業(yè)資源養(yǎng)護措施，包括建立禁漁期制度、開展增殖放流活動和劃定水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)等，以期改善珠江流域魚類生物多樣性和漁業(yè)資源現(xiàn)狀[1,28-29]。

珠江魚類生物多樣性和漁業(yè)資源保護亟需構(gòu)建快速有效且環(huán)境友好的監(jiān)測體系，為漁業(yè)保護和管理決策的制定及實施提供科學依據(jù)。本研究首次利用eDNA 技術(shù)對珠江中下游魚類多樣性進行研究，旨在探討該技術(shù)對檢測珠江中下游魚類生物多樣性的適用性，為珠江魚類生物多樣性的監(jiān)測及保護提供新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本次調(diào)查于2023 年2 月8—12 日進行，在珠江中下游選取了桂平G P (1 1 0°0 7'3 4.4 5''E,23°25'11.92''N)、藤縣TX (110°50'5.06''E,23°26'47.19''N)、封開FK (111°30'41.25''E,23°23'35.73''N)、德慶DQ (111°49'53.35''E,23°08'24.83''N)、肇慶ZQ (112°24'48.24''E,23°07'58.23''N) 和九江JJ (112°56'40.33''E,22°51'22.53''N) 6 個采樣點 (圖1)。每個采樣點采集3 個重復樣品，每個樣品用采水器從表層水體采集2 L 水樣置于聚乙烯瓶中。采樣人員佩戴一次性手套，采水器和采樣瓶在使用前均經(jīng)10% (w)的次氯酸鈉消毒。所有樣品均在24 h 內(nèi)使用0.45 μm 混合纖維素濾膜 (Whatman，英國) 進行真空抽濾。為評估是否存在外源DNA 污染，每次過濾設(shè)置1 個陰性對照。每份樣品過濾后，將濾膜置于4.5 mL無酶凍存管中于液氮中冷凍保存，并對過濾器材進行消毒和沖洗，避免樣品間交叉污染。

圖1 調(diào)查站點示意圖Fig. 1 Sampling stations in this study

1.2 eDNA 提取

使用PowerWater DNA Isolation Kits (Qiagen 公司) 按照試劑盒說明書提取濾膜中的DNA，用1%(w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA 的質(zhì)量。每份樣品獨立提取，并使用空白濾膜設(shè)置為陰性對照。將提取的DNA 樣品快速置于?20 ℃冷凍保存，直至PCR 擴增。

1.3 遺傳標記擴增及高通量測序

本研究使用魚類eDNA 宏條形碼分析常用引物mlCOlintF (5'-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3') 和jgHCO219 (5'-TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA-3') 擴增線粒體COI基因，擴增序列長度約313 bp[30]。20 μL PCR 擴增體系包括：2～5 μL 模板DNA (10 ng·μL?1)、正反向引物各0.8 μL (5 μmol·L?1)、2 μL dNTPs、4 μL 5×FastPfu 緩沖液、0.4 μL FastPfu 聚合酶，最后用ddH2O 將體系補至20 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。每個樣品每次PCR 反應(yīng)均使用ddH2O 為模板作陰性對照。每個樣品進行3 次重復擴增，并將同一樣品的擴增產(chǎn)物混合，使用2% (w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。所有陰性對照均無目的條帶，表明無外源魚類DNA 污染；6 個采樣點的樣品均得到可檢測的PCR 產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物膠回收后送至上海凌恩生物科技有限公司通過Illumina NovaSeq 6000 測序平臺進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

2013—2019 年，在珠江中下游采集78 種共384 尾魚類樣本，利用魚類通用引物擴增603 bp 線粒體COI基因序列[31]。此外，從NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 數(shù)據(jù)庫下載12 種魚類的COI基因序列進行補充，分別是叉尾斗魚 (Macropodusopercularis)、大鱗副泥鰍 (Paramisgurnus dabryanus)、福建紋胸鮡 (Glyptothoraxfukiensis)、虹彩光唇魚 (Acrossocheilusiridescens)、黑鰭鳈 (Sarcocheilichthysnigripinnis)、黃鱔 (Monopterus albus)、橫紋南鰍 (Schisturafasciolata)、金黃舌鰕虎魚 (Glossogobiusaureus)、美麗沙鰍 (Botia pulchra)、攀鱸 (Anabastestudineus)、三線舌鰨(Cynoglossustrigrammus) 和云斑尖塘鱧 (Oxyeleotris marmoratus)。本研究利用這90 種魚類的COI基因序列構(gòu)建珠江中下游魚類DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫。利用MEGA-X 軟件，基于Kimura2-parameter (K2P)模型對種間遺傳距離 (Interspecific distance) 和種內(nèi)遺傳距離 (Intraspecific distance) 進行計算，并分析條形碼間隙 (Barcode gap)，以證實條形碼數(shù)據(jù)庫的可用性。此外，為了更直觀地理解物種聚類模式，在MEGA-X 軟件中，基于K2P 模型，自展值(Bootstrap) 設(shè)置為1 000，構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ) 系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序序列經(jīng)過質(zhì)控過濾、拼接后獲得各樣品的優(yōu)質(zhì)序列。序列按照相似性≥97%進行OTU (Operational taxonomic unit) 聚類分析，然后將OTU代表序列與自建的數(shù)據(jù)庫進行比對、分類注釋，并得到相應(yīng)的OTU 豐度表[32]。本研究以O(shè)TU 聚類與注釋結(jié)果為基礎(chǔ)，進行物種組成和Alpha 多樣性分析。將OTU 序列與數(shù)據(jù)庫比對確定魚類物種信息，閾值條件為Identity 值≥97%，E-value＜10?5。魚類分類學信息參考《珠江魚類志》[33]《中國內(nèi)陸魚類物種與分布》[34]和中國生物物種名錄(2022 版)。Alpha 多樣性分析選取Chao1 指數(shù)(Chao1 index)、香農(nóng)指數(shù) (Shannon index)、辛普森指數(shù) (Simpson index) 及覆蓋度 (Coverage) 指數(shù)進行群落豐富度、多樣性及覆蓋度分析[32]。利用R 軟件vegan 包，基于Bray-Curtis 距離矩陣進行主坐標分析 (Principal coordinates analysis, PCoA)[35]，探討不同采樣點樣本間群落組成空間分布差異。

2 結(jié)果

2.1 條形碼數(shù)據(jù)庫

本研究構(gòu)建的條形碼數(shù)據(jù)庫共463 條COI序列，包括90 種魚類，隸屬于17 目32 科75 屬。K2P 遺傳距離模型計算結(jié)果顯示，基于數(shù)據(jù)庫COI序列的種內(nèi)遺傳距離為0%～24.94%，平均值為0.95%；種間遺傳距離為1.27%～34.93%，平均值為2 2.4 7%，種間平均遺傳距離是種內(nèi)的23.65 倍。條形碼間隙分析顯示，除了黃尾鲴，數(shù)據(jù)庫中其他物種的最小種間距離均大于最大種內(nèi)距離，具有條形碼間隙 (圖2)?；贑OI序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖2 數(shù)據(jù)庫魚類最大種內(nèi)遺傳距離與最小種間遺傳距離比較Fig. 2 Maximum intraspecific distance compared with minimum interspecific distance for fishes in barcode library

圖3 基于COI 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on COI sequence

2.2 魚類物種組成

從6 個采樣點共獲得13 025 個OTU，其中九江的OTU 數(shù)量最多 (6 476 個)，肇慶最少 (3 829個)，其他采樣點分別為德慶5 076 個，封開5 012 個，桂平4 244 個，藤縣3 889 個；6 個采樣點共有的OTU 為724 個。對OTU 進行注釋，共獲得已知魚類物種序列2 6 1 3 條，檢出魚類30 種，隸屬于4 目10 科27 屬，其中土著魚類26 種，外來種4 種，各采樣點的物種及序列數(shù)見表1。檢出魚類種類最多的為肇慶 (18 種)，其他分別為桂平13 種、藤縣11 種、封開10 種、德慶8 種和九江14 種。魚類檢測結(jié)果中鯉形目鯉科魚類最多 (17 種)，占魚類物種總數(shù)的56.67%；鱸形目和鲇形目分別為7 和3 種?；诟鞑蓸狱c的序列豐度，物種種類和相對序列豐度組成情況見圖4。由圖4 可知，eDNA 所檢測序列數(shù)最多的7 個物種依次為子陵吻鰕虎魚 (Rhinogobiusgiurinus,27.75%)、瓦氏黃顙魚 (Pelteobagrusvachellii,17.53%)、鰱 (Hypophthalmichthysmolitrix,11.71%)、尼羅羅非魚 (Oceochromisnilotica,8.50%)、齊氏羅非魚 (O.zillii, 7.27%)、南方波魚(Rasborasteineri, 5.82%) 和鯉 (Cyprinuscarpio,3.41%)；且除齊氏羅非魚外，其他幾種魚類在各采樣點均被檢測到并顯示出相對較高的序列豐度。

表1 各采樣點檢測物種序列數(shù)Table 1 Number of reads detected for each species at each sampling station

圖4 各采樣點魚類物種組成Fig. 4 Composition of fish species at each sampling site

2.3 歷史調(diào)查數(shù)據(jù)比較

根據(jù)珠江中下游魚類調(diào)查文獻[23,25,27,36-37]，統(tǒng)計得出近十多年傳統(tǒng)調(diào)查共捕獲魚類132 種 (未統(tǒng)計未鑒定種)，隸屬于13 目30 科 (附錄A，詳見http://dx.doi.org/10.12131/20230111 的資源附件)。本研究較傳統(tǒng)調(diào)查資料新檢出美麗沙鰍和齊氏羅非魚2 種魚類。

2.4 多樣性分析

對珠江中下游魚類群落進行Alpha 多樣性分析，各樣本的Chao1、Shannon 和Simpson 多樣性指數(shù)及覆蓋度Coverage 計算值見表2。各采樣點中，Shannon 指數(shù)最高的為九江 (2.90)，其次為桂平 (2.89)，最低的為藤縣 (2.15)；Simpson 指數(shù)最高的為桂平 (0.84)，其次為九江 (0.82)，最低的為藤縣 (0.63)。各個樣本的Coverage 值范圍為0.993 4～1.000 0，表明檢測結(jié)果基本覆蓋到了全部魚類物種。

表2 各樣本Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of each sample

基于eDNA 檢測的各采樣點的序列豐度，采用Bray-Curtis 距離矩陣進行PCoA 分析 (圖5)，由圖可知，桂平和封開站點距離較近，九江、藤縣和肇慶站點距離較近，德慶站點與其他站點距離較遠。表明桂平和封開站點具有相似的魚類組成，九江、藤縣和肇慶站點具有相似的魚類組成，德慶站點具有與其他站點不同的魚類組成。

圖5 eDNA 所檢測魚類的基于Bray-Curtis 距離矩陣的主坐標分析 (PCoA)Fig. 5 Principal coordinates based on Bray-Curtis distance matrix analysis of fish detected by environmental DNA

3 討論

3.1 條形碼數(shù)據(jù)庫的適用性

目前COI 條形碼已廣泛應(yīng)用于魚類種類鑒定中。Hebert 等[38]提出了“10 倍規(guī)則”的標準用于區(qū)分物種，即滿足種間平均遺傳距離大于種內(nèi)平均遺傳距離的10 倍。蔣佩文等[39]在構(gòu)建珠江河口魚類COI 條形碼數(shù)據(jù)庫時，其種間與種內(nèi)平均遺傳距離比值為127.7，符合“10 倍規(guī)則”的標準，可實現(xiàn)珠江口魚類物種的鑒定。郜星晨和姜偉[40]建立三峽魚類COI 條形碼數(shù)據(jù)庫，其種間平均遺傳距離為種內(nèi)的9.38 倍，表明COI基因可以作為三峽庫區(qū)常見魚類鑒定的有效條形碼基因。本研究中，C O I 序列種間平均遺傳距離是種內(nèi)的23.65 倍，也符合“10 倍規(guī)則”標準。此外，條形碼間隙分析顯示，除黃尾鲴外，其他種類均具有明顯的條形碼間隙。因此，COI 序列在本研究中可滿足魚類物種的鑒別需求。

3.2 基于eDNA 檢測的魚類組成

本研究首次使用eDNA 技術(shù)分析了珠江中下游魚類多樣性，共檢測出魚類30 種，其中鯉形目鯉科魚類最多，占魚類物種總數(shù)的56.67%，相較于傳統(tǒng)調(diào)查方法[23,27]，檢出魚類種類組成結(jié)構(gòu)一致，均以鯉科魚類為主，符合珠江水系魚類區(qū)系組成特點[41]。傳統(tǒng)調(diào)查方法研究顯示，珠江中下游魚類優(yōu)勢種包括廣東魴 (Megalobramaterminalis)、赤眼鱒 (Squaliobarbuscurriculus)、鯪 (Cirrhinus molitorella)、鯉、子陵吻鰕虎魚、鰱、草魚 (Ctenopharyngodonidella)、瓦氏黃顙魚和尼羅羅非魚等[23,27,36]。本研究的魚類優(yōu)勢種為子陵吻鰕虎魚、瓦氏黃顙魚、鰱、尼羅羅非魚、齊氏羅非魚、南方波魚和鯉，優(yōu)勢種類與傳統(tǒng)調(diào)查研究結(jié)果基本一致。但部分傳統(tǒng)調(diào)查中的優(yōu)勢種類在本研究中未檢測到，如廣東魴和鯪。這可能是由于本研究所用COI基因通用引物對廣東魴和鯪的擴增效率低，在低濃度DNA 模板的條件下無法對目標基因序列進行擴增。其次，在設(shè)置調(diào)查站位時，綜合考慮地理環(huán)境和有關(guān)魚類生活習性，能夠提高eDNA 的物種檢測效率[32]。本研究設(shè)置站位數(shù)量有限，未能充分考慮站位環(huán)境和魚類生活習性。廣東魴為江河洄游性魚類，4—8 月為其產(chǎn)卵繁殖期，在西江的青皮塘和羅旁江段形成漁汛，珠江三角洲是其主要育肥和生長場所[42]；珠江中下游魚類優(yōu)勢種組成具有一定的季節(jié)差異，鯪主要是在秋季作為優(yōu)勢種[23]，而本研究采樣時間為春季。

已有研究表明，eDNA 方法檢測到的魚類物種豐富度與基于傳統(tǒng)的調(diào)查方法相似或更高[43-44]。例如，利用eDNA 技術(shù)檢測的魚類種類數(shù)與使用刺網(wǎng)和電捕法在靜態(tài)和激流水體中進行長期調(diào)查所檢測的物種數(shù)相當[45]。但本研究檢測到的魚類物種數(shù)少于傳統(tǒng)調(diào)查方法，李捷等[25]2005—2008 年調(diào)查魚類97 種，與本研究檢出相同魚類24 種；李捷等[36]2006—2008 年調(diào)查魚類81 種，與本研究檢出相同魚類24 種；李躍飛等[37]2006—2007 年調(diào)查魚類75 種，與本研究檢出相同魚類18 種；帥方敏等[27]2015 年調(diào)查魚類62 種 (不包括未鑒定種)，與本研究檢出相同魚類20 種；張迎秋等[23]2016—2018 年調(diào)查魚類96 種 (不包括未鑒定種)，與本研究檢出相同魚類26 種。這可能由于本研究使用的COI 通用引物沒有足夠的特異性，在原核生物和非魚類真核生物DNA 存在的情況下，引物對樣品中的魚類DNA 擴增效率不高。已有研究表明，對于水體中低濃度的環(huán)境DNA 模板，COI 引物對魚類DNA 的擴增效率不高[46]。劉軍等[47]研究發(fā)現(xiàn)，COI 引物對魚類樣品和環(huán)境DNA 樣品均有較好的擴增效果，但測序結(jié)果顯示COI 引物從環(huán)境DNA中擴增的基因片段屬于細菌微生物的基因片段，而未擴增出魚類基因片段。此外，物種多樣性調(diào)查結(jié)果與采樣頻次和eDNA 數(shù)據(jù)庫物種信息完整性有關(guān)。在生態(tài)環(huán)境的生物多樣性調(diào)查中，特別是水生生態(tài)系統(tǒng)中，由于檢測概率[48]、物種的稀有性[49]和采集強度[50]的影響，對物種多樣性的評估可能受到限制，通過增加采樣點和采樣次數(shù)可以提高魚類物種的檢測效果[15]?；趀DNA 技術(shù)的生物評價的有效性依賴于序列參考數(shù)據(jù)庫的完整性，數(shù)據(jù)庫缺少目標物種序列時會導致假陰性檢測[51]。

相較于珠江河口水域eDNA 研究，Zou 等[52]在珠江河口水域的南沙濕地利用eDNA 檢測出35 種淡水魚類，與本研究相同的魚類有7 種：草魚、鰱、赤眼鱒、鯉、南方白甲魚 (Onychostomagerlachi)、斑鱧 (Channamaculata)和尼羅羅非魚。這可能與研究的區(qū)域、選用的引物和比對數(shù)據(jù)庫的不同有關(guān)。Zou 等[52]選用12S rRNA 基因區(qū)的通用引物，利用GenBank 數(shù)據(jù)庫進行比對；本研究使用COI基因區(qū)的通用引物，比對自行構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫。已有研究表明不同DNA 區(qū)域 (如COI和12S rRNA基因) 元條形碼引物在魚類多樣性和物種分辨率方面存在差異[53-54]。

3.3 魚類多樣性分析

本研究中Chao1 指數(shù)范圍為8.00～18.33，其中肇慶站點的值最高，表明該站點的群落豐富度最高。Shannon 和Simpson 指數(shù)可反映魚類的多樣性水平[55]，本研究中Shannon 和Simpson 指數(shù)表明九江和桂平站點魚類多樣性最高。桂平站點位于郁江和黔江的交匯處，該江段為桂平東塔產(chǎn)卵場，是珠江流域最大的產(chǎn)卵場[56]，水域環(huán)境復雜，是珠江眾多珍稀特有魚類的重要棲息地，因此具有較高的魚類多樣性。九江站點靠近珠江河口，受徑流和潮汐相互作用，該水域咸淡水混合、物質(zhì)交匯頻繁、生產(chǎn)力豐富，是魚類棲息、覓食和繁育的重要區(qū)域[57]，因此魚類生物多樣性也較高。

魚類群落結(jié)構(gòu)的空間差異對于維持水生生態(tài)系統(tǒng)功能具有重要作用。在本研究中，基于環(huán)境DNA 檢測的魚類物種序列豐度，通過PCoA 分析顯示桂平和封開站點具有相似的魚類組成，藤縣和九江站點具有相似的魚類組成，但在地理位置上桂平和封開、藤縣和九江站點相距較遠。相反，地理位置較近的肇慶和德慶站點具有不同的魚類組成。當然，僅基于本研究6 個站點的數(shù)據(jù)不能充分展示珠江中下游魚類群落空間分布格局，如需充分展示該區(qū)域的魚類空間分布，需要設(shè)置更加密集的站位和更高頻次的調(diào)查研究。

3.4 入侵物種和特有魚類

防止有害物種入侵、保護稀有瀕危物種是物種和生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)管的重要內(nèi)容；eDNA 技術(shù)由于其敏感性、快速性和特異性，因而在外來物種防控和珍稀瀕危物種保護方面具有巨大的優(yōu)勢[20]。本研究中檢測到4 種外來入侵魚類，分別為麥瑞加拉鯪(Cirrhinusmrigala)、條紋鯪脂鯉 (Prochiloduslineatus)、齊氏羅非魚和尼羅羅非魚，且尼羅羅非魚和齊氏羅非魚已成為優(yōu)勢種類。羅非魚主要是從養(yǎng)殖水體逃逸后，在珠江水系擴散并建群，目前已遍布整個流域并建立了自然群體[27,58-59]。珠江流域外來水生生物安全面臨嚴重威脅，控制形勢十分嚴峻。外來物種入侵是生物多樣性喪失和全球同質(zhì)化的主要原因之一[60]，入侵物種會與土著種通過競爭成為優(yōu)勢種，從而對本地物種的種類和數(shù)量產(chǎn)生影響[61]。一旦外來物種入侵成功，不但控制成本高且根除的可能性很小[62]。eDNA 技術(shù)增加了對入侵物種早期監(jiān)測的可能性，降低了物種入侵的控制成本和生態(tài)影響。

eDNA 技術(shù)檢測靈敏度高，相較于傳統(tǒng)調(diào)查方法顯示出更高的檢測效率和成本效益[63-64]。南方波魚是珠江水系特有魚類[36]，屬于山溪小型魚類[65]，喜棲息于溪流和水溝。由于調(diào)查所用網(wǎng)具和調(diào)查范圍的限制，在近些年的傳統(tǒng)調(diào)查研究中均未采集到該種魚類；而在本研究的6 個采樣點中均可檢出該種魚類，說明珠江中下游存在一定種群數(shù)量的南方波魚，也表明eDNA 技術(shù)在特有魚類的監(jiān)測中具有一定優(yōu)勢。

4 小結(jié)

eDNA 技術(shù)具有成本低、檢測靈敏度高、檢測效率高和非破壞性采樣等特點，為魚類多樣性監(jiān)測和保護工作提供了新的選擇。本研究首次利用eDNA 技術(shù)檢測了珠江中下游魚類多樣性，證明其對檢測珠江中下游魚類生物多樣性及分布情況的可行性。理論上eDNA 技術(shù)對魚類多樣性檢測的高效性取決于一系列的生物和技術(shù)因素[13]，無法完全替代傳統(tǒng)魚類調(diào)查方法。eDNA 和傳統(tǒng)魚類調(diào)查方法各有其優(yōu)勢，可以提供重疊和互補信息，因此兩者應(yīng)該共同使用，以提供對魚類生物多樣性更全面的了解[66-67]，也為制定旨在保護和增強水生態(tài)系統(tǒng)功能和恢復力的保護策略提供數(shù)據(jù)支撐。