牡蠣肽對(duì)帕羅西汀致雄性小鼠性功能障礙的作用效果及潛在機(jī)制

黃倩倩 ，吳海英 ，秦小明

1. 廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088

2. 國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524088

男性性行為是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，包括性喚起、陰莖勃起、陰莖進(jìn)入陰道、射精幾個(gè)環(huán)節(jié)，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙都稱之為性功能障礙；而環(huán)境因素、生活習(xí)慣、心理因素、藥物副作用等均有可能導(dǎo)致男性性功能障礙[1]。而這其中，藥物副作用導(dǎo)致的男性性功能障礙需要引起關(guān)注。近年來(lái)，抑郁癥患者比例逐年增加，而抗抑郁藥，尤其是5-羥色胺再攝取抑制劑 (SSRIs)，如帕羅西汀(PRX) 的臨床使用，已被證實(shí)會(huì)對(duì)男性性功能產(chǎn)生不良影響，包括勃起障礙、射精障礙以及性欲異常等，這無(wú)疑加大了對(duì)抑郁癥患者的傷害[2-3]。雖然磷酸二酯酶-5 抑制劑類藥物如西地那非 (SDF)，已被證明可用于治療勃起功能障礙 (Erectile dysfunction, ED)，但該藥物會(huì)給患者帶來(lái)其他副作用[4]。因此，亟需尋求一些無(wú)毒副作用的天然活性物質(zhì)替代藥物治療男性性功能障礙。

人參 (PanaxginsengC. A. Mey.)、荸薺 (Eleocharisdulcis)、淫羊藿 (EpimediumbrevicornuMaxim.)、洋蔥 (AlliumcepaL.)等的植物提取物因富含皂苷、類黃酮、三萜類化合物等生物活性物質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于治療男性性功能障礙[5-9]。近年來(lái)，海洋環(huán)境中的動(dòng)植物同樣為藥物的發(fā)現(xiàn)提供了天然化合物庫(kù)。鄭環(huán)宇等[10]研究發(fā)現(xiàn)，華貴櫛孔扇貝 (Mimachlamysnobilis)肉及其酶解產(chǎn)物可改善半去勢(shì)大鼠的生殖能力。Qiong 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，海帶 (Laminariajaponica) 多糖對(duì)電離輻射損傷的雄性大鼠生殖系統(tǒng)及性能力均具有良好的恢復(fù)效果。此外，紅海藻 (Rhodophytasp.) 對(duì)動(dòng)物的睪丸功能也有增強(qiáng)作用[12]。海馬 (Hippocampussp.) 活性肽與單環(huán)刺縊 (Urechisunicinctus) 活性肽同樣被證實(shí)可增強(qiáng)男性性功能[13-14]。由此可見(jiàn)，開(kāi)發(fā)海洋動(dòng)植物新產(chǎn)品以改善男性性功能障礙具有較大的應(yīng)用前景與潛力。

牡蠣又稱海蠣子、蠔，肉質(zhì)鮮美，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被冠以“海洋牛奶”的美譽(yù)[15]，是我國(guó)第一批納入藥食同源的食品之一[16]。牡蠣肉及其提取物具有改善學(xué)習(xí)記憶[17]、抗皮膚光老化[18]、抗氧化[19]、改善睡眠[20]等生物活性。此外，牡蠣肽 (Oyster peptide,OP) 還可以促進(jìn)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮與一氧化氮(NO)的產(chǎn)生[21]，增強(qiáng)疲勞游泳后雄性小鼠的性行為[22]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，牡蠣肉及其酶解產(chǎn)物可以提高半去勢(shì)大鼠的性能力[23]，促進(jìn)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌[15]，且牡蠣水解產(chǎn)物對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)的雄性小鼠睪丸損傷具有潛在的保護(hù)作用[24]。由此可見(jiàn)，牡蠣肽在改善男性性功能活性方面具有較大潛力。但其改善男性性功能障礙的作用效果及機(jī)制依然不明確，缺乏足夠的理論支持，且關(guān)于牡蠣肽對(duì)PRX 誘導(dǎo)的性功能障礙的作用效果的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以牡蠣肽為研究對(duì)象，以PRX 口腔灌胃構(gòu)建雄性小鼠性功能障礙模型，探討牡蠣肽對(duì)雄性小鼠性功能障礙的作用效果及其可能機(jī)制；以期為研發(fā)出相關(guān)的牡蠣產(chǎn)品提供理論依據(jù)，并為抗抑郁藥的臨床使用提供新方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)原料：牡蠣肽 (生產(chǎn)許可證號(hào)：SC1061630 2300695；執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：Q/SMN0012S-2021；保質(zhì)期36 個(gè)月；產(chǎn)品批號(hào)：20220712B)，購(gòu)自海南盛美諾生物技術(shù)有限公司澄邁分公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：64 只健康的SPF 級(jí)ICR 小鼠[ (26±2) g]，雌雄各半，購(gòu)自廣州市研成生物科技有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)SCXK (京) 2019-0010，動(dòng)物飼養(yǎng)處于無(wú)菌環(huán)境，溫度為22～26 ℃，濕度為50%～60%，明暗交替12 h，自由進(jìn)食 (C60 輻照實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料) 和飲水。整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照廣東海洋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

實(shí)驗(yàn)藥品與試劑：鹽酸帕羅西汀片 (H10950043)購(gòu)自中美天津史克制藥有限公司；枸櫞酸西地那非片 (H20020527) 購(gòu)自輝瑞制藥有限公司；苯甲酸雌二醇注射液 (獸藥字163232511)、黃體酮注射液(獸藥字163231439) 均購(gòu)自上海全宇生物科技 (駐馬店) 動(dòng)物藥業(yè)有限公司；小鼠睪酮 (Testosterone,T) ELISA 試劑盒、小鼠促黃體生成素 (Luteinizing hormone, LH) ELISA 試劑盒、小鼠促卵泡生成素(Follicle stimulating hormone, FSH) ELISA 試劑盒、小鼠雌二醇 (Estradiol, E2) ELISA 試劑盒、小鼠環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷 (cGMP) ELISA 試劑盒、小鼠磷酸二酯酶5 (PDE5) ELISA 試劑盒均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司； NO、一氧化氮合酶 (NOS)、酸性磷酸酶 (ACP)、堿性磷酸酶 (ALP)、乳酸脫氫酶 (LDH)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA) 的測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (增強(qiáng)型)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。分子量所用標(biāo)品：細(xì)胞色素C (分子量12384)、抑肽酶 (分子量6500)、桿菌肽 (分子量1422)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸 (分子量451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸 (分子量189)，純度均≥95%，均購(gòu)自Sigma 公司。17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma 公司。

儀器與設(shè)備：Varioskan Flash 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo 公司)；Waters 2695 高效液相色譜儀(配2487 紫外檢測(cè)器和Empower 工作站GPC 軟件，美國(guó)Waters 公司)；CKX41 型倒置顯微鏡 (日本Olympus 公司)；正置光學(xué)顯微鏡，日本尼康；JOYN-SXT-06B 脂肪測(cè)定儀 (上海喬躍電子科技有限公司)；HX204 水分測(cè)定儀 (瑞士METTLER TOLEDO 公司)；KjeltecTM8200kai 凱氏定氮儀 [福斯華 (北京) 科貿(mào)有限公司]；3-550PD 馬弗爐 (美國(guó)Neytech 公司)。

1.2 方法

1.2.1 基本成分測(cè)定

按GB 5009.5—2016 凱氏定氮法測(cè)定樣品粗蛋白含量；按GB 5009.6—2016 索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量；按GB 5009.3—2016 常壓干燥法測(cè)定樣品水分含量；按GB 5009.4—2016 高溫灼燒法測(cè)定灰分含量；按GB/T 9695.31—2008 苯酚-硫酸法測(cè)定樣品總糖含量。

1.2.2 分子量測(cè)定

色譜柱：TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相：乙腈/水/三氟乙酸，40/60/0.1 (體積比)；檢測(cè)：UV 220 nm；流速：0.5 mL·min?1；柱溫：30 ℃。

1.2.3 游離氨基酸測(cè)定

參照GB/T 22729—2008《海洋魚(yú)低聚肽粉》測(cè)定牡蠣肽游離氨基酸含量。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

ICR 雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后隨機(jī)分為4 組(n=8)：空白組 (CN，等體積蒸餾水)；模型組 (帕羅西汀，14 mg·kg?1PRX)；陽(yáng)性組 (14 mg·kg?1PRX+7 mg·kg?1SDF)；牡蠣肽組 (14 mg·kg?1PRX+500 mg·kg?1OP)，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)組小鼠連續(xù)口腔灌胃28 d。帕羅西汀與西地那非的給藥劑量參考Ademosun 等[25]的研究。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)牡蠣酶解產(chǎn)物在250、500 和1 000 mg·kg?13 個(gè)劑量組中，中劑量組 (500 mg·kg?1) 對(duì)雄性小鼠生殖障礙的保護(hù)作用效果最佳[26]。因此，參考上述研究結(jié)果，本研究?jī)H選用500 mg·kg?1劑量組，探討牡蠣肽在PRX 導(dǎo)致的性功能障礙中的作用效果。

交配行為實(shí)驗(yàn)于末次口腔灌胃結(jié)束60 min 后進(jìn)行。正式交配前48 h，對(duì)雌性小鼠肌內(nèi)注射0.2 mg·只?1的苯甲酸雌二醇注射液，于前4 h 注射1 mg·kg?1的黃體酮注射液，使雌性小鼠處于動(dòng)情期[27]。實(shí)驗(yàn)安排在安靜、暗紅燈光下的房間里，于晚上20: 00—24: 00 進(jìn)行，雄性小鼠先置于30 cm×15 cm×15 cm 規(guī)格的籠中適應(yīng)15 min，隨后采用高清攝像頭記錄，從雌性小鼠放進(jìn)籠子起開(kāi)始記錄，觀察并記錄前30 min 的交配行為參數(shù)，包括騎跨潛伏期 (Mount latency，ML，雌鼠進(jìn)入籠子至雄鼠第一次出現(xiàn)騎跨行為的時(shí)間間隔)、騎跨頻率 (Mount frequency，MF，雄鼠發(fā)生騎跨行為的次數(shù))、插入潛伏期 (Intromission latency，IL，雄鼠首次插入雌鼠陰道的時(shí)間)、插入頻率 (Intromission frequency，IF，從雌鼠進(jìn)入到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)雄鼠總的插入次數(shù))、射精潛伏期 (Ejaculation latency，EL，雄性小鼠首次插入至射精的時(shí)間間隔)、射精后間隔期 (Post ejaculation interval，PEL，雄性小鼠射精后至再次插入的時(shí)間間隔)[28]。

實(shí)驗(yàn)小鼠末次口腔灌胃結(jié)束后禁食不禁水12 h，稱量并記錄各組實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量后摘去眼球取血，隨后分別取出小鼠陰莖、精囊腺、睪丸、心臟、胸腔、脾、肝臟、腎臟、肺并用電子天平精確稱量，計(jì)算臟器系數(shù):

血清激素水平測(cè)定：取血后，血液于室溫下自然凝固15 min，4 ℃下3 000 r·min?1離心15 min，取血清；按照ELISA 試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清中睪酮(T)、促黃體生成激素 (LH)、促卵泡生成激素(FSH) 和雌二醇 (E2) 含量。

陰莖組織指標(biāo)測(cè)定：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)制備陰莖組織勻漿液，并測(cè)定勻漿中蛋白質(zhì)含量、NO 含量、NOS 活性、cGMP 含量與PDE5 活性。

睪丸組織指標(biāo)測(cè)定：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)制備右側(cè)睪丸組織勻漿液，并測(cè)定勻漿中蛋白質(zhì)含量，ACP、ALP、LDH、SOD 活性以及MDA 含量。

睪丸組織病理切片：將小鼠左側(cè)睪丸分別用甲醛固定液固定、包埋、切片、HE 染色及采集圖像。

精子質(zhì)量：取小鼠左右附睪于裝有生理鹽水的EP 管中剪碎，搖勻，37 ℃水浴孵育15 min；取一滴稀釋液于血球計(jì)數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5 個(gè)方格中的精子數(shù)量，每毫升精子數(shù)量等于N×稀釋倍數(shù)×5×104。另取1 滴稀釋液涂片，觀察200 個(gè)精子，并計(jì)數(shù)其中有活動(dòng)能力的精子數(shù)以計(jì)算精子活率。此外，根據(jù)精子快速染色試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)精子進(jìn)行染色，并使用倒置顯微鏡觀察與捕獲染色后的精子圖像，并對(duì)精子形態(tài)進(jìn)行分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 27、Excel 2021、GraphPad 9.3 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖，通過(guò)單因素方差分析 (One-way ANOVA) 分析數(shù)據(jù)，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異非常顯著，P＜0.001 表示差異極顯著，三者均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 牡蠣肽基本成分分析

按照國(guó)標(biāo)方法對(duì)牡蠣肽基本成分含量進(jìn)行測(cè)定(n=3)，以干基計(jì)，牡蠣肽中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(70.61%)，其次是總糖 (25.75%)，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為6.17%，灰分和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.06%和6.65%，說(shuō)明牡蠣肽是一種高蛋白低脂肪的物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.2 相對(duì)分子質(zhì)量分布與游離氨基酸分析

牡蠣肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布情況如圖1 所示，主要集中在＜1 000 D，含量高達(dá)95.66%，其中＜500 D 占83.41%，表明該牡蠣肽主要為小分子肽段，具有吸收效率高、能量消耗低的特點(diǎn)[29]；因此，可以推斷該小分子牡蠣肽具有較好的生物利用率。此外，牡蠣肽游離氨基酸中含人體所需的7 種必需氨基酸 (表1)，且必需氨基酸在游離氨基酸總量中占比為49.29%，支鏈氨基酸占比為21.35%，疏水性氨基酸占比為40.71%。適量補(bǔ)充必需氨基酸可在一定程度上促進(jìn)機(jī)體新陳代謝并增強(qiáng)生育能力[30]，補(bǔ)充支鏈氨基酸可以提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力、減緩疲勞[31]。而疏水性氨基酸則具有較強(qiáng)的抗氧化能力[32]。牡蠣肽游離氨基酸含量及構(gòu)成說(shuō)明其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表1 牡蠣肽游離氨基酸含量分析Table 1 Analysis of free amino acid content of oyster peptid

圖1 牡蠣肽相對(duì)分子質(zhì)量分布色譜圖Fig. 1 Chromatogram of relative molecular mass distribution of oyster peptides

2.3 牡蠣肽對(duì)小鼠交配行為的影響

雄性小鼠交配行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。與CN 組相比，PRX 組小鼠顯著延長(zhǎng)了ML、IL、EL 與PEL (P＜0.001,P＜0.001,P＜0.05,P＜0.01)；而經(jīng)牡蠣肽與SDF 干預(yù)后，與PRX 組相比，雄性小鼠ML、IL 與PEL 得到了有效縮短 (P＜0.001,P＜0.01,P＜0.05)，但EL 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。此外，與CN 組相比，PRX 組小鼠MF 和IF 分別顯著減少了43.68%和41.54% (P＜0.01)；而與PRX 組相比，PRX+OP 組分別使小鼠MF 和IF 顯著提高了57.14%和50.00% (P＜0.01,P＜0.05)，SDF 作為陽(yáng)性藥物，同樣顯著提高了MF 和 IF (P＜0.05)。

圖2 牡蠣肽對(duì)小鼠交配行為的影響Fig. 2 Effect of oyster peptid on sexual behavior in mice

2.4 牡蠣肽對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

由表2 可知，與CN 組相比，PRX、PRX+SDF 與PRX+OP 組的內(nèi)臟系數(shù)及陰莖系數(shù)均無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)，而PRX+SDF 與PRX+OP 組的睪丸系數(shù)與精囊腺系數(shù)，相比PRX 組均顯著增大(P＜0.01,P＜0.05)。附性腺器官的質(zhì)量往往與雄性動(dòng)物的雄激素活性及性能力相關(guān)，雄激素對(duì)附性腺器官細(xì)胞具有增殖增大的作用，即附性腺器官系數(shù)的增大可初步判斷樣品具有雄激素效應(yīng)[33]。本研究發(fā)現(xiàn)牡蠣肽在一定程度上增大了睪丸系數(shù)與精囊腺系數(shù)，表明牡蠣肽具有雄激素作用，可通過(guò)作用附性腺器官細(xì)胞的增殖增大而達(dá)到提高雄性小鼠性能力的效果。

表2 牡蠣肽對(duì)臟器系數(shù)的影響Table 2 Effect of oyster peptid on organ coefficient%

2.5 牡蠣肽對(duì)小鼠血清性激素的影響

血清性激素水平是評(píng)價(jià)性能力強(qiáng)弱的關(guān)鍵指標(biāo)，如圖3 所示。與CN 組相比，PRX 組T、LH、FSH、E2 濃度顯著降低 (P＜0.001,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.001)，顯然，PRX 的給藥干擾了雄性小鼠的性激素水平。而與PRX 組相比，牡蠣肽與SDF 的給藥使雄性小鼠的T、LH 與FSH 濃度恢復(fù)至接近CN 組水平 (P＜0.001,P＜0.01,P＜0.05)。此外，與PRX 組相比，PRX+OP 組可使小鼠E2 濃度顯著升高 (P＜0.01)，而PRX+SDF 組E2 濃度則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，可能是牡蠣肽使雄性動(dòng)物體內(nèi)芳香化酶活性增強(qiáng)，從而使T 芳香化為E2，而SDF 則無(wú)此作用[34]。

圖3 牡蠣肽對(duì)血清性激素的影響Fig. 3 Effect of oyster peptid on serum sex hormones

2.6 牡蠣肽對(duì)小鼠陰莖組織勃起參數(shù)的影響

陰莖組織中的NO 與cGMP 含量，及NOS 與PDE-5 活性是雄性陰莖勃起生理過(guò)程中的關(guān)鍵因素。由圖4 可知，與CN 組相比，PRX 組NO 含量、cGMP 含量與NOS 活性顯著降低 (P＜0.001)，PDE5活性顯著升高 (P＜0.001)；由此可見(jiàn)，PRX 的給藥導(dǎo)致雄性小鼠陰莖勃起障礙。而與PRX 組相比，PRX+SDF 與PRX+OP 組可提高小鼠陰莖組織NO(P＜0.01) 與cGMP 含量 (P＜0.05)，恢復(fù)NOS 活性(P＜0.05)，降低PDE-5 活性 (P＜0.01)。說(shuō)明牡蠣肽可以在NO/cGMP 信號(hào)通路上發(fā)揮作用，從而改善PRX 導(dǎo)致的勃起功能障礙。

圖4 牡蠣肽對(duì)陰莖組織一氧化氮、一氧化氮合酶、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷、磷酸二酯酶-5 含量或活性的影響Fig. 4 Effect of OP on content or activity of NO, NOS, cGMP and PDE5 in penile tissue

2.7 牡蠣肽對(duì)小鼠睪丸組織酶活性及MDA 含量的影響

ACP、ALP 與LDH 是睪丸標(biāo)志酶，被認(rèn)為是精子發(fā)生及睪丸發(fā)育的功能性指標(biāo)[24]。當(dāng)睪丸標(biāo)志性酶活性發(fā)生變化時(shí)，睪丸功能及精子發(fā)生功能會(huì)受到相應(yīng)影響。由圖5 可知，與CN 組相比，PRX 組ACP、ALP 與LDH 活性顯著降低 (P＜0.01)，可見(jiàn)PRX 可導(dǎo)致小鼠睪丸標(biāo)志性酶活性下降。而與PRX 組相比，牡蠣肽與SDF 處理可顯著提高ACP 與LDH 的活性 (P＜0.01,P＜0.05)，但牡蠣肽對(duì)ALP 活性的影響則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。

圖5 牡蠣肽對(duì)睪丸組織標(biāo)志性酶的影響Fig. 5 Effect of oyster peptid on marker enzymes of testis tissue

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致睪丸損傷及雄性動(dòng)物性能力低下的重要原因，在PRX 誘導(dǎo)的雄性小鼠性功能障礙模型中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。由圖6 可知，PRX引起脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA 含量顯著高于CN 組(P＜0.01)，SOD 活性顯著低于CN 組 (P＜0.01)，可見(jiàn)PRX 可通過(guò)破壞小鼠睪丸組織的抗氧化系統(tǒng)而降低其抗氧化能力。經(jīng)牡蠣肽處理后，與PRX 組相比，MDA 含量顯著低于PRX 組 (P＜0.01)，SOD 活性也得到了顯著提高 (P＜0.01)。說(shuō)明牡蠣肽可減緩PRX 引起的睪丸氧化應(yīng)激損傷。

圖6 牡蠣肽對(duì)睪丸組織抗氧化能力的影響Fig. 6 Effect of oyster peptid on antioxidant capacity of testis tissue

2.8 牡蠣肽對(duì)睪丸組織結(jié)構(gòu)及精子質(zhì)量的影響

由圖7 可知，睪丸組織HE 染色切片結(jié)果表明，CN 組小鼠睪丸組織內(nèi)生精小管排列整齊有序，生精細(xì)胞數(shù)量豐富、形態(tài)規(guī)則良好；而PRX組小鼠睪丸組織生精小管內(nèi)生精細(xì)胞排列稀松紊亂，細(xì)胞數(shù)量銳減，管腔內(nèi)空泡化嚴(yán)重。而經(jīng)牡蠣肽處理后，生精小管內(nèi)細(xì)胞排列規(guī)整、分布均勻，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，形態(tài)也明顯改善。由此可見(jiàn)，牡蠣肽可以減緩PRX 導(dǎo)致的睪丸組織結(jié)構(gòu)損傷。

圖7 睪丸組織病理分析Fig. 7 Pathological analysis of testicular tissue

精子質(zhì)量可由精子數(shù)量、活率和形態(tài)反映出來(lái)。如圖8 所示，PRX 組小鼠精子數(shù)量與活率較CN 組顯著下降 (P＜0.001)；而與PRX 組相比，PRX+SDF 與PRX+OP 組可有效改善精子數(shù)量與活率(P＜0.01,P＜0.001)。此外，由圖9 可知，PRX 組小鼠出現(xiàn)大量盤(pán)繞尾巴、彎曲尾巴、環(huán)頸、無(wú)頭、無(wú)尾等畸形精子；而牡蠣肽處理后，可有效降低精子發(fā)生異常。結(jié)果表明，PRX 對(duì)雄性小鼠精子質(zhì)量也產(chǎn)生了不利影響，與2.7 所述影響精子發(fā)生的幾種睪丸標(biāo)志性酶活性下降的結(jié)果及睪丸組織HE 染色切片結(jié)果一致；本研究發(fā)現(xiàn)也與Saikia等[35]的結(jié)果相似。

圖8 精子數(shù)量與活率Fig. 8 Sperm count and motility

圖9 精子形態(tài)分析Fig. 9 Sperm morphology analysis

3 討論

大量研究表明，持續(xù)服用抗抑郁藥PRX 后會(huì)導(dǎo)致雄性動(dòng)物的性能力下降，包括ML、IL、EL、PEL 的延長(zhǎng)，以及MF 與IF 的下降[2]，而這些性行為指標(biāo)是反映雄性動(dòng)物性能力強(qiáng)弱最直觀的指標(biāo)。在本研究中，雄性小鼠經(jīng)口腔灌胃PRX 28 d 后，性能力明顯下降，而經(jīng)牡蠣肽干預(yù)后，其性能力得到明顯改善，與Luo 等[22]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣肽可以提高疲勞雄性小鼠性能力的結(jié)果相似。

性激素具有促進(jìn)性腺器官生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)性成熟、刺激性欲等作用，在維持男性性健康中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[26]。雄性小鼠在服用PRX 后，血清性激素水平顯著低于CN 組，可能是PRX 作用后對(duì)性腺軸產(chǎn)生了直接的毒性作用，亦或是PRX 對(duì)下丘腦或垂體的毒性作用而間接影響了性激素的合成與釋放[36]。本研究中PRX 導(dǎo)致的性激素水平下降與已有研究結(jié)果[36-38]一致，即持續(xù)服用PRX 會(huì)導(dǎo)致雄性動(dòng)物性激素水平紊亂，繼而誘發(fā)雄性動(dòng)物性功能障礙。然而經(jīng)牡蠣肽處理后，雄性小鼠性激素水平可恢復(fù)至接近正常水平，說(shuō)明牡蠣肽可能通過(guò)介導(dǎo)“下丘腦-垂體-性腺軸”而調(diào)節(jié)PRX 導(dǎo)致的雄性小鼠性激素水平紊亂。

此外，本研究通過(guò)測(cè)定牡蠣肽游離氨基酸含量發(fā)現(xiàn)，其精氨酸含量在所有游離氨基酸中占比最高。研究發(fā)現(xiàn)，L-精氨酸除可以維持精子功能、改善精子質(zhì)量，提高血清睪酮濃度外，其亦是NO 的合成前體，在NOS 的作用下參與NO/cGMP 信號(hào)通路；當(dāng)NO 進(jìn)入到陰莖平滑肌細(xì)胞后，可使鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶 (Guanylate cyclase, GC) 激活，從而升高平滑肌細(xì)胞內(nèi)的cGMP 濃度，進(jìn)而降低鈣離子(Ca2+) 濃度使平滑肌松弛，最終引起陰莖勃起[39-40]。而PDE-5 則是NO/cGMP 勃起通路中的破壞者，可降解cGMP，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞內(nèi)的cGMP 濃度下降，使陰莖難以勃起[41]。在本研究中，PRX 組中NO 濃度的下降，可能是由于PRX 的作用使得精氨酸酶活性增強(qiáng)，從而使L-精氨酸發(fā)生了降解[25]；抑或是因?yàn)镻RX 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，使得超氧化物與NO 作用形成了過(guò)氧亞硝酸鹽[42]。而經(jīng)牡蠣肽處理后，雄性小鼠NO、cGMP 含量與NOS 活性較PRX 組顯著提高，PDE-5 活性顯著降低，可見(jiàn)牡蠣肽可能作為前體物質(zhì)提高平滑肌細(xì)胞內(nèi)NO與cGMP 濃度，亦可能作為精氨酸酶與PDE-5 的抑制劑而抑制精氨酸酶與PDE-5 的活性，以達(dá)到維持NO 與cGMP 濃度的目的。

精子的發(fā)生功能與睪丸標(biāo)志性酶ACP、ALP和LDH 的活性密切相關(guān)，ACP 主要負(fù)責(zé)睪丸生殖細(xì)胞之間的物質(zhì)交換，促進(jìn)精母細(xì)胞的發(fā)育；ALP 主要負(fù)責(zé)管腔液與精子膜之間的物質(zhì)交換，以及雄激素在精管周間質(zhì)與曲細(xì)精管之間的轉(zhuǎn)移；而LDH 主要影響精子發(fā)生過(guò)程中的能量代謝與生物利用度[43]。本研究中PRX 作用后，睪丸磷酸酶與LDH 活性均顯著低于正常水平，影響了睪丸的生物功能與代謝活性，導(dǎo)致雄激素與精子細(xì)胞能量的生物利用度均降低。然而，在使用牡蠣肽干預(yù)后，睪丸標(biāo)志性酶活性明顯增強(qiáng)，說(shuō)明牡蠣肽具有較強(qiáng)的雄激素效應(yīng)，在維持睪丸功能與精子發(fā)生功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致男性ED 與生殖障礙的重要原因。Ogunro 和Yakubu[44]發(fā)現(xiàn)，PRX 作用后，睪丸組織的抗氧化防御系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞；Adefegha 等[45]也發(fā)現(xiàn)，PRX 會(huì)引起睪丸脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA 含量與非蛋白硫醇含量升高。由此可見(jiàn)，PRX 的作用會(huì)誘導(dǎo)雄性動(dòng)物產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而影響男性性功能，這一現(xiàn)象在本研究中PRX 組小鼠睪丸組織SOD 活性較CN 組顯著下降，MDA 含量顯著升高的結(jié)果中也得到了驗(yàn)證。而牡蠣肽作用后，有效減緩了PRX 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，說(shuō)明牡蠣肽具有較強(qiáng)的抗氧化能力，這在本課題組前期的大量研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[24,26]。

綜上，牡蠣肽對(duì)PRX 導(dǎo)致的雄性小鼠性功能障礙具有潛在保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與介導(dǎo)“下丘腦-垂體-性腺軸”調(diào)節(jié)性激素水平、作用NO/cGMP 勃起信號(hào)通路、減緩氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本研究為今后研發(fā)相關(guān)的牡蠣產(chǎn)品提供了理論依據(jù)，也為藥物PRX 導(dǎo)致的性功能障礙的作用機(jī)制研究及PRX 的臨床使用提供了新的研究方案。