賈珍珍,孫敬蒙,辛宇,張?chǎng)?莫一燕,張煒煜*

1(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春,130117)2(吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床藥學(xué)部,吉林 長(zhǎng)春,130061)

花青素(anthocyanins,ACN)是一種天然食用色素,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、資源豐富,具有抗衰老、抗氧化、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)血糖血脂、改善視力、預(yù)防癌癥和神經(jīng)退行性疾病等多種生理活性[1-8],在保健食品和食品加工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。但花青素自身多羥基的1-O(+)苯并吡喃環(huán)結(jié)構(gòu),使其易受內(nèi)外環(huán)境因素影響而發(fā)生降解失活,造成生物活性和生物利用度降低,嚴(yán)重限制了其相關(guān)應(yīng)用[9-10],故如何解決花青素的不穩(wěn)定性已經(jīng)成為亟待解決的問題。

目前提高花青素穩(wěn)定性的制劑方法主要是通過載體材料將其制成納米顆粒、乳液、脂質(zhì)體、微囊等[11-14],其制備工藝復(fù)雜、制備成本高、輔料用量大,易導(dǎo)致給藥劑量較大。共無定型復(fù)合物(coamorphous complex,CAC)是藥物和藥物或小分子物質(zhì)組合形成的均勻單相無定形體系[15],其制備工藝簡(jiǎn)單,可提高藥物的穩(wěn)定性、溶解度、溶出度,提高藥物療效與生物利用度[16]。楊仲平等[17]將熊果酸與茶氨酸制備成共無定型復(fù)合物后,其溶解度增加了2.7倍;施元旦等[18]將姜黃素和茶氨酸聯(lián)合使用制備成共無定型復(fù)合物,與單體姜黃素相比,生物利用度提高了2.08倍;任麗佳等[19]將葛根素與殼寡糖制備成共無定型,有效提高了葛根素的體外溶出度及共無定型藥物的穩(wěn)定性。

煙酰胺(nicotinamide,NCT)是一種水溶性B族維生素,為輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分之一,在機(jī)體內(nèi)參與多種氧化還原反應(yīng),具有加強(qiáng)DNA修復(fù)、預(yù)防腫瘤與神經(jīng)退行性疾病、抗衰老、抗菌等作用[20-23],其結(jié)構(gòu)中含有氫鍵受體和供體,具備形成共無定形的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),已有研究將煙酰胺與葛根素、喹硫平制備成共無定形[24-25],但還未有花青素方面的相關(guān)報(bào)道,因此,本研究將花青素與煙酰胺組合制備共無定型復(fù)合物,一方面提高花青素穩(wěn)定性,為增強(qiáng)其穩(wěn)定性提供一種新的技術(shù)手段,另一方面可為保健食品中花青素聯(lián)合用藥提供新的研究思路和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花青素(批號(hào)：20200219),大興安嶺林格貝寒帶生物科技股份有限公司;矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(批號(hào)：DST200420-019),德思特生物技術(shù)有限公司;煙酰胺(批號(hào)：20200110),英博生物科技有限公司;檸檬酸(批號(hào)：C11114955),上海麥克林生化有限公司;檸檬酸鈉、鹽酸、氯化鉀(批號(hào)：20200311、20180228、20181106),北京化工廠;冰醋酸、無水乙酸鈉(批號(hào)：15011211、1211231),西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140型電子天平、DSC3型差示掃描量熱儀,梅特勒-托利多儀器有限公司;PHS-3C pH計(jì),上海精科公司;85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器,常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠;ZF-6型三用紫外分析儀,上海嘉鵬科技有限公司;UV5100型紫外-可見分光光度計(jì),山東析遠(yuǎn)儀器有限公司;Epsilon 2-4 Lsplus型真空冷凍干燥機(jī),德國(guó)Christ公司;VECTOR-33型傅立葉變換紅外光譜儀,德國(guó)Bruker公司;XRD-7000型X-射線衍射儀,日本SHIMADZU公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 花青素-煙酰胺共無定型復(fù)合物制備(anthocyanins-nicotinamide coamorphous complex,ACN-NCT CAC)

采用冷凍干燥法[26]制備ACN-NCT CAC：取摩爾比1∶4的花青素和煙酰胺加入適量去離子水,攪拌,冷凍干燥,即得。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化ACN-NCT CAC制備工藝

在考察了溶劑用量、攪拌速度、攪拌時(shí)間等單因素之后,仍以ACN-NCT CAC在紫外條件下8 h后ACN的保存率為響應(yīng)值,對(duì)3個(gè)顯著因素溶劑用量(A)、攪拌速度(B)和攪拌時(shí)間(C)進(jìn)一步進(jìn)行Box-Behnken Design響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定最優(yōu)處方,因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.3 保存率的測(cè)定

1.3.3.1 ACN含量測(cè)定

采用pH示差法[27]測(cè)定ACN含量。以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷作為參比物,將待測(cè)樣品溶液分別用pH 1.0的氯化鉀緩沖溶液和pH 4.5的乙酸鈉緩沖溶液稀釋10倍后,以去離子水為空白對(duì)照,分別測(cè)定其在514 nm和700 nm處的吸光度,按照Fuleki公式[公式(1)、公式(2)]計(jì)算出ACN的含量：

ΔA=(A514nm-A700nm)pH1.0-(A514nm-A700nm)pH 4.5

(1)

(2)

式中：ΔA,總吸光度值;A514nm,樣品在514 nm處測(cè)定的吸光度值;A700nm,樣品在700 nm處測(cè)定的吸光度值;DF,稀釋倍數(shù);M,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量,449.2 g/mol;ε,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的消光系數(shù),26 900 L/(mol·cm);L,光程,1 cm。

1.3.3.2 ACN保存率測(cè)定

取ACN-NCT CAC,在相應(yīng)條件下作用后,分別加入pH 1.0和pH 4.5緩沖溶液稀釋,按照1.3.3.1節(jié)計(jì)算ACN含量,并計(jì)算保存率,計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：R1為ACN保存率,%;w1,ACN-NCT CAC不同條件作用后ACN的含量,mg;w2,ACN-NCT CAC中ACN的初始含量,mg。

1.3.4 ACN-NCT CAC表征分析

1.3.4.1 差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry,DSC)

參照陸佳璐等[28]的方法,取5 mg ACN、NCT、物理混合物、ACN-NCT CAC于鋁坩中,N2為吹掃氣,以50 ℃/min的升溫速度,在30～300 ℃溫程內(nèi)進(jìn)行DSC分析。

1.3.4.2 X射線衍射分析(X-ray diffraction,XRD)

參照劉歡等[29]的方法,取適量ACN、NCT、物理混合物、ACN-NCT CAC,平鋪在載玻片,置于X射線衍射儀上進(jìn)行分析。測(cè)定條件為：Cu靶(40 kV,30 mA);掃描范圍3°～80° (2θ);掃描速度10°/min;步長(zhǎng)0.02°。

1.3.4.3 傅里葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)

參照余丹妮等[30]的方法,取 ACN、NCT、物理混合物、ACN-NCT CAC,加入KBr混合壓片,在400～4 000 cm-1波數(shù)內(nèi)掃描譜圖。

1.3.5 ACN-NCT CAC穩(wěn)定性研究

1.3.5.1 pH穩(wěn)定性

取ACN、ACN-NCT CAC約2 mg,精密稱定,置于5 mL量瓶中,用pH 5.0的緩沖液稀釋,定容至刻度,每隔1 h,測(cè)定吸光度并計(jì)算保存率,平行測(cè)定3次。

1.3.5.2 溫度穩(wěn)定性

取ACN、ACN-NCT CAC約2 mg,精密稱定,置于5 mL量瓶中,用pH 3.0的緩沖液稀釋,定容至刻度,置于60 ℃下恒溫保存,每隔1 h,測(cè)定吸光度并計(jì)算保存率,平行測(cè)定3次。

1.3.5.3 光照穩(wěn)定性

取ACN、ACN-NCT CAC約2 mg,精密稱定,置于5 mL量瓶中,用pH 3.0的緩沖液稀釋,定容至刻度,置于紫外光下,每隔1 h,測(cè)定吸光度并計(jì)算保存率,平行測(cè)定3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用軟件Origin 9.8、GraphPad Prism 8.0.2和SPSS 21進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)分析,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示,每組試驗(yàn)平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。應(yīng)用軟件Design Expert 12對(duì)表2進(jìn)行擬合分析,結(jié)果見表3。分析得到二次回歸方程為Y=56.39-1.41A-5.28B-5.26C+0.778 7AB+ 0.831 8AC+4.27BC-8.48A2-6.92B2-6.83C2。該回歸模型的P<0.01,失擬項(xiàng)P值>0.05,表明所建模型可靠,擬合效果好,可用于結(jié)果分析。其三維響應(yīng)面和等高線圖見圖1,其中A、B、C、BC、A2、B2、C2對(duì)保存率的影響均顯著,交互項(xiàng)AB、AC對(duì)保存率的影響不顯著,對(duì)于保存率的影響顯著性順序?yàn)锽>C>A。分析后得到最優(yōu)處方為：溶劑用量為35 mL,攪拌速度為300 r/min,攪拌時(shí)間為9 min,模型預(yù)測(cè)保存率為59.47%。

a-溶劑用量-攪拌速度響應(yīng)面圖;b-溶劑用量-攪拌速度等高線圖;c-溶劑用量-攪拌時(shí)間響應(yīng)面圖;d-溶劑用量-攪拌時(shí)間等高線圖;e-攪拌速度-攪拌時(shí)間響應(yīng)面圖;f-攪拌速度-攪拌時(shí)間等高線圖圖1 各因素交互對(duì)保存率的影響

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Designs and results of Box-Behnken test

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of Box-Behnken design

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按最優(yōu)處方制備3批ACN-NCT CAC,測(cè)得其保存率分別為59.67%、58.40%、59.46%,平均保存率為(59.18±0.68)%,與模型預(yù)測(cè)值59.47%偏差較小,表明該模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確,可信度高,優(yōu)化得到的最佳制備工藝穩(wěn)定可靠,重復(fù)性良好。

2.3 ACN-NCT CAC表征分析

2.3.1 DSC分析

如圖2所示,ACN在93.95 ℃有一寬吸熱峰,NCT在129.06 ℃有一尖銳吸熱峰。ACN和NCT物理混合物在127.45 ℃有一尖銳吸熱峰,說明ACN和NCT可能形成了共融物。ACN-NCT CAC中ACN和NCT的熔點(diǎn)特征峰消失,并在73.12 ℃出現(xiàn)一個(gè)區(qū)別于ACN、NCT及其混合物的寬吸熱峰,表明形成了共無定型復(fù)合物。

A-ACN;B-NCT;C-ACN和NCT物理混合物;D-ACN-NCT CAC(下同)圖2 ACN、NCT、ACN和NCT物理混合物、ACN-NCT CAC的DSC圖

2.3.2 XRD分析

結(jié)果如圖3所示,ACN為彌散寬峰,NCT在10°、15°、23°、25°、30°處出現(xiàn)較強(qiáng)的衍射峰,為晶體型態(tài)。在二者的物理混合物中雖然部分NCT的衍射峰減弱或消失,但仍可以觀察到NCT的晶體衍射峰,表明物理混合物為非共無定型態(tài),而共無定型復(fù)合物表現(xiàn)為彌散寬峰,未觀察到相應(yīng)晶體衍射峰,證明為共無定型態(tài),說明形成了ACN-NCT CAC。

圖3 ACN、NCT、ACN和NCT物理混合物、ACN-NCT CAC的XRD圖

2.3.3 FTIR分析

圖4 ACN、NCT、ACN和NCT物理混合物、ACN-NCT CAC的FTIR光譜圖

2.4 ACN-NCT CAC穩(wěn)定性研究

2.4.1 pH穩(wěn)定性

結(jié)果如圖5所示,無論是ACN還是ACN-NCT CAC在一定pH條件下放置時(shí)間越長(zhǎng),其保存率越低,但ACN-NCT CAC的保存率顯著高于ACN(P<0.01),放置6 h后,ACN-NCT CAC的保存率為75.96%,ACN保存率為69.52%,提高了6.44%,表明將ACN制備成ACN-NCT CAC,可以提高其pH穩(wěn)定性。

圖5 ACN與ACN-NCT CAC在pH 5.0保存率

2.4.2 熱穩(wěn)定性

溫度對(duì)ACN的穩(wěn)定性影響如圖6所示,60 ℃下ACN和ACN-NCT CAC的總體變化趨勢(shì)相同,均一直處于降解狀態(tài),但在6 h的加熱過程中,ACN-NCT CAC的降解量明顯低于ACN,每個(gè)取樣點(diǎn)的ACN-NCT CAC保存率均高于ACN(P<0.01),6 h后,ACN-NCT CAC的保存率為81.76%,相較ACN原料藥,保存率提高了5.22%,表明ACN-NCT CAC可以提高其ACN的熱穩(wěn)定性。

圖6 ACN與ACN-NCT CAC在60 ℃保存率

2.4.3 光照穩(wěn)定性

結(jié)果如圖7所示,紫外光照對(duì)ACN的影響較大,隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng),ACN降解逐漸增多,降解速率逐漸加快,而在ACN-NCT CAC中,ACN的降解速率呈漸緩趨勢(shì),光照6 h后,ACN-NCT CAC的保存率為68.67%,ACN原料藥的保存率為44.20%,保存率提高了24.47%(P<0.001),說明共無定型復(fù)合物可提高花青素的紫外光穩(wěn)定性。

圖7 ACN與ACN-NCT CAC在紫外光照條件下保存率

3 結(jié)論

本研究以花青素保存率為指標(biāo),采用響應(yīng)面法優(yōu)化了花青素-煙酰胺共無定型復(fù)合物的制備工藝,得到最佳工藝參數(shù)：溶劑用量35 mL,攪拌速度300 r/min,攪拌時(shí)間為9 min,制備的花青素-煙酰胺共無定型復(fù)合物保存率為(59.18±0.68)%;差示掃描量熱法、X射線衍射證實(shí)花青素與煙酰胺確實(shí)以共無定型形式存在;傅里葉紅外光譜提示二者通過氫鍵相互作用形成了共無定型復(fù)合物。通過測(cè)定花青素-煙酰胺共無定型復(fù)合物在一定pH、溫度、光照下的保存率,證實(shí)其減緩了花青素的降解,提高了花青素的穩(wěn)定性。本研究成功制備了花青素-煙酰胺共無定型復(fù)合物,制備工藝簡(jiǎn)單可行,為花青素在食品加工等方面的進(jìn)一步相關(guān)應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ),也可為保健食品中花青素與相關(guān)活性物質(zhì)的聯(lián)合應(yīng)用提供新的研究思路。