李巴侖,呂長榮,顏小云,趙獻軍,華進聯(lián)*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,陜西省干細胞工程技術研究中心,陜西楊凌 712100;2.百歐派(天津)生物技術有限公司,天津 300350;3.西安家佳動物醫(yī)院,陜西西安 710000)

傷口延遲愈合的原因有感染、藥物、異物存留、損傷嚴重、營養(yǎng)不良、疾病、年齡因素、皮膚缺損、自體敏感、脂肪液化、皮下積液等[1-2]。常見的處理辦法包括抑制炎癥、清除異物和失活組織,徹底止血,沖洗傷口及再縫合[3]。但由于創(chuàng)傷形成的復雜性,臨床上常出現(xiàn)傷口難以愈合的現(xiàn)象。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我更新、多向分化潛能的細胞類群[4]。MSCs具有低免疫原性、多來源途徑、多分化潛能及強大的旁分泌功能等特征,能夠在機體中通過全身性功能調(diào)節(jié)以恢復機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[4]。已有多項研究針對MSCs在疾病中的治療作用進行了試驗探究,包括治療心肌梗塞、自身免疫性疾病、糖尿病、肝損傷及腎臟損傷等[4-8]。MSCs治療涉及到多種途徑,包括抗炎、抗氧化應激、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、激活免疫系統(tǒng)及促進受損部位再生等[4]。

MSCs的應用方法包括靜脈輸注、局部注射等方式。MSCs治療一個療程通常需要多次輸注,每次間隔一定時間,一個療程約為1～2個月。且MSCs分次輸注操作繁瑣,需每次輸注前進行MSCs的復蘇傳代及擴增,單個流程通常需要3～5 d,一般需要3～5次。MSCs的保存、培養(yǎng)條件及操作人員的變化也影響著MSCs治療的效果。將MSCs療法用于寵物臨床中某些發(fā)病急、病程快的疾病的最大障礙包括MSCs準備時間長,操作要求高、保存時間短等。

MSCs受限于操作時間和操作平臺無法大規(guī)模應用于疾病治療。已有部分研究集中于MSCs的儲存溫度和環(huán)境。中短途運輸(≤60 h)中4℃保存的MSCs比在25℃和37℃具備更強的細胞活力[9]。在MSCs制劑中加入50 mL/L人血清白蛋白提高了MSCs的凍存效率[10]。在0.9%生理鹽水基礎上增加脯氨酸作為保護劑以增強MSCs短途運輸效率[11]。在MSCs中短途運輸(≤60 h)中常使用0.9%生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液、林格溶液等作為溶媒,但上述方案仍不能滿足大規(guī)模制備和長期保存MSCs以用于臨床疾病治療。本文用甜菜堿和海藻糖作為細胞制劑的主要冷凍保存組分。在MSCs制劑中添加褪黑素,米托蒽醌甲磺酸鹽及膠原蛋白以促進MSCs的存活和療效[4,12]。

本病例由于創(chuàng)口反復感染化膿,上述辦法嘗試2個月后仍無法治愈。為了促進該病例的良好預后,將間充質(zhì)干細胞與多種小分子組合,治療貓的創(chuàng)傷延遲愈合。本文描述了一種新型直接使用的MSCs劑型,以保證MSCs治療的時效性和便攜性,并完全治愈了貓延遲愈合的舊創(chuàng),顯示了干細胞治療的強大優(yōu)勢的舊創(chuàng),顯示了干細胞治療的強大優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 貓脂肪間充質(zhì)干細胞(MSCs)由陜西省干細胞工程技術研究中心分離擴增[4,8]。

1.1.2 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基、Tryple Express,Gibco公司產(chǎn)品;MSC Serum-free Basal Medium,創(chuàng)凌生物公司產(chǎn)品;無水甜菜堿、D-海藻糖,優(yōu)索生物公司產(chǎn)品;褪黑素、MitoQ、一型膠原蛋白均,索萊寶公司產(chǎn)品;卡波姆-940,源葉生物公司產(chǎn)品;甘油、氫氧化鈉、Tween-80、尼珀金乙酯鈉鹽、三乙醇胺,均為梯希愛公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱,美國賽默飛公司產(chǎn)品;超凈工作臺,北京亞泰科隆公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡,日本尼康公司產(chǎn)品;冷凍干燥機,順治公司產(chǎn)品;-80℃冰箱,海爾公司產(chǎn)品;全自動血常規(guī)分析儀,美國Bio Tec公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病例概況 2022年10月西安家佳寵物醫(yī)院接診1例雌性加菲貓膀胱結(jié)石,進行開腹手術取出結(jié)石。術后2月創(chuàng)口無法愈合,傷口四周紅腫。經(jīng)獸醫(yī)師診斷,血清淀粉樣蛋白A顯示4 mg/L(正常范圍:<10 mg/L)及血常規(guī)數(shù)據(jù)顯示正常(表1),按5 mg/kg頭孢克肟聯(lián)合甲硝唑20 mL靜脈注射連續(xù)用藥2月未見好轉(zhuǎn)。該病例傷口延遲愈合可能與前期手術、年齡、自體敏感等因素相關,導致傷口處皮膚再生能力減弱。

表1 血常規(guī)檢查

1.2.2 間充質(zhì)干細胞擴增 MSCs經(jīng)37℃水浴復蘇后經(jīng)1 000 r/min離心3 min,去除上清液后加入含10% FBS的α-MEM重懸,接種于100 mm培養(yǎng)皿中。MSCs在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)[12]。待MSCs增殖至80%～90%時,棄去培養(yǎng)液。用PBS洗去殘余培養(yǎng)液后,加入0.25%胰酶,37℃消化3～5 min,加入與胰酶等量培養(yǎng)液終止消化,轉(zhuǎn)入離心管中1 100 r/min離心3 min。棄去上清后加入新α-MEM重懸,轉(zhuǎn)入100 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞長至80%～90%時,用上述消化方式消化MSCs。

1.2.3 間充質(zhì)干細胞制劑制備 將1.2.2得到的MSCs用含10% FBS的α-MEM重懸,加入80 μg無水甜菜堿,20 μg D-海藻糖充分混勻。加入10-6mmol/L 褪黑素,10-6mmol/L MitoQ及10 μg膠原蛋白,重懸混勻后加入細胞冷凍保存管,置于-80℃保存。

1.2.4 治療方法及預后 經(jīng)醫(yī)師或在醫(yī)師指導下清理創(chuàng)面,使創(chuàng)口環(huán)境有利于愈合。將干細胞制劑自冰箱取出,水浴或手持解凍使其恢復至室溫;使用注射器對細胞制劑反復吹打混勻,使細胞制劑不可見絮狀物質(zhì);將細胞制劑于傷口四周皮下注射,注射位置應盡量均勻分布在創(chuàng)口周圍。MSCs制劑每2 d注射1次,連用1周,持續(xù)監(jiān)測患寵損傷部位恢復情況。用ImajeJ軟件對傷口表面進行定量分析。

2 結(jié)果

該病例手術創(chuàng)口經(jīng)兩月余無法愈合,皮膚傷口處紅腫,持續(xù)感染化膿,多次清創(chuàng)再縫合均無法治愈(圖1)。經(jīng)MSCs治療第0天,組織壞死,潰爛,充血傷口滲出血液及纖維蛋白原。清創(chuàng)后局部注射MSCs制劑。第1天及第2天創(chuàng)口逐漸收縮,長出肉芽組織。治療第3天至第5天創(chuàng)口收縮,愈合速度加快,創(chuàng)口范圍逐漸縮小,由4 cm逐漸縮小至2.5 cm。第5天至第18天傷口表皮組織增生,創(chuàng)口收縮,化膿及紅腫等不利癥狀消失。第21天至第33天創(chuàng)口完全愈合,并長出毛發(fā)(圖2)。對創(chuàng)口表面信息進行定量分析(圖3)。

圖1 患寵治療前創(chuàng)口信息

圖2 間充質(zhì)干細胞制劑治療促進貓創(chuàng)傷延遲愈合

A.用干細胞治療第0天至第33天傷口愈合率定量分析; B.自發(fā)病起傷口愈合率定量分析

3 討論

大多數(shù)創(chuàng)傷可在1～2周完成愈合過程[2]。但在臨床治療中,感染、衰老、藥物、復雜的創(chuàng)傷環(huán)境,如營養(yǎng)缺乏或其他疾病導致的慢性創(chuàng)傷等引起傷口難以愈合。在寵物臨床診療中,由于原發(fā)病的復雜性、寵物品質(zhì)和相關診斷手段的局限性,常出現(xiàn)創(chuàng)口難以在常規(guī)時間內(nèi)愈合現(xiàn)象[13]。

近年來,針對干細胞治療各種寵物疾病已取得多項突破性進展,包括犬貓?zhí)悄虿?、肝損傷、腎損傷及皮膚損傷等[4-6,8,12,14]。目前,MSCs的主要治療機制包括旁分泌細胞因子、外泌體、定向趨化能力及體內(nèi)分化等。但MSCs療法局限于極短的保存時間、繁瑣的操作步驟及較高的操作要求,在寵物治療應用中往往不能及時發(fā)揮治療作用。褪黑素、MitoQ、膠原蛋白等可有效促進MSCs的體外活力[4]。本研究集合了多種促進MSCs活力的小分子,并改良MSCs的保存條件,制備了快速、便捷、作用效力強的新型MSCs制劑,對1例臨床貓創(chuàng)口延遲愈合進行治療。證明MSCs制劑治療效果較好。通過促進皮膚組織愈合,改善機體微環(huán)境,使預后不良的創(chuàng)口加速愈合過程。本病例用為未來MSCs臨床化提供了一種切實可行的治療策略。