付長龍 涂海水 張文鍵 陳毅濤 陸詩雨 李超 金靈璐 鄭春松

【摘 要】目的：探討狗脊多糖通過調(diào)節(jié)lncRNA NEAT1延緩椎間盤終板軟骨細(xì)胞衰老的作用機(jī)制。方法：將15只C57BL/6小鼠的椎間盤終板軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)；經(jīng)10 ng·mL-1白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）干預(yù)24 h誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞；將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組（10 ng·mL-1 IL-1β）和狗脊多糖各劑量組（100，200，400 μg·mL-1）；Real-time PCR及Western blot分別檢測狗脊多糖對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞lncRNA NEAT1、衰老相關(guān)通路p53-p21中p53、p21水平及衰老相關(guān)分泌表型的基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表達(dá)情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測各組軟骨細(xì)胞凋亡率情況。結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的椎間盤終板軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1、p21、p53水平顯著增高；與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組lncRNA NEAT1、p21、p53水平顯著降低；與空白對照組比較，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的椎間盤終板軟骨細(xì)胞中MMP-13、Caspase-3蛋白表達(dá)含量顯著增高，CollagenⅡ蛋白表達(dá)降低；經(jīng)狗脊多糖干預(yù)后，可顯著改善MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表達(dá)；此外，與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組椎間盤終板軟骨細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)論：狗脊多糖通過調(diào)控lncRNA NEAT1影響p53、p21、MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3表達(dá)，降低軟骨細(xì)胞凋亡率，進(jìn)而延緩椎間盤終板軟骨細(xì)胞衰老。

【關(guān)鍵詞】 椎間盤退變；狗脊多糖；軟骨細(xì)胞；長鏈非編碼RNA NEAT1；衰老；小鼠

The Effect of Cibotium Barometz Polysaccharides Regulating lncRNA NEAT1 to Delay the Aging of Intervertebral Disc Endplate Chondrocytes

FU Chang-long，TU Hai-shui，ZHANG Wen-jian，CHEN Yi-tao，LU Shi-yu，LI Chao，JIN Ling-lu，ZHENG

Chun-song

【ABSTRACT】Objective：To explore the mechanism of cibotium barometz polysaccharides in delaying the aging of intervertebral disc endplate chondrocytes by regulating lncRNA NEAT1.Methods：The intervertebral disc endplate chondrocytes of 15 C57BL/6 mice were cultured in vitro.10 ng·mL-1 of interleukin-1β（IL-1β）was used for intervention for 24 hours to induce chondrocytes.Chondrocytes were randomly divided into a blank control group and a model control group（10 ng·mL-1 IL-1β）and different dosage groups of cibotium barometz polysaccharides（100，200，400 μg·mL-1）.Real time PCR and Western blot were used to detect the effect of cibotium barometz polysaccharides on IL-1β induced lncRNA NEAT1，the levels of p53，p21 in aging related pathway p53-p21 and the expression of aging related secretory phenotype MMP-13，

CollagenⅡ，and Caspase-3 protein.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of chondrocytes in each group.Results：Real time PCR results showed that the levels of lncRNA NEAT1，p21 and p53 in IL-1β induced intervertebral disc endplate chondrocytes were significantly increased;compared with the model control group，the levels of lncRNA NEAT1，p21，and p53 in each dose group of cibotium barometz polysaccharides were significantly reduced;compared with the blank control group，the expression levels of MMP-13 and Caspase-3 proteins in IL-1β induced intervertebral disc endplate chondrocytes were significantly increased，while the expression of CollagenⅡ protein was reduced.After intervention with cibotium barometz polysaccharides，the expression of MMP-13，CollagenⅡ，and Caspase-3 proteins could be significantly improved.In addition，compared with the model control group，the apoptosis rate of intervertebral disc endplate chondrocytes in the cibotium barometz polysaccharide group showed a decreasing trend.Conclusion：Cibotium barometz polysaccharides affect the expression of p53，p21，MMP-13，Collagen Ⅱ，and Caspase-3 by regulating lncRNA NEAT1，reducing the apoptosis rate of chondrocytes and delaying the aging of intervertebral disc endplate chondrocytes.

【Keywords】 intervertebral disc degeneration;cibotium barometz polysaccharides;chondrocytes;lncRNA NEAT1;aging;mice

脊柱關(guān)節(jié)處椎間盤退變是引起患者軀干部疼痛的重要原因之一。隨著椎間盤退變的加劇可導(dǎo)致多種脊柱關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展［1］。鑒于軟骨終板為椎間盤（缺乏血供組織）提供了絕大多數(shù)營養(yǎng)，一旦軟骨終板受不良因素（異常力學(xué)、炎癥等）誘導(dǎo)，可破壞其正常結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤退變。細(xì)胞衰老通常是機(jī)體應(yīng)對細(xì)胞損傷后的應(yīng)激反應(yīng)，但在過度損傷及年齡增長等因素刺激下，原有的衰老-清除-再生程序發(fā)生失衡，加劇細(xì)胞出現(xiàn)或進(jìn)入周期阻滯狀態(tài)，同時誘導(dǎo)衰老相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)異常及衰老相關(guān)通路（例如p53-p21、p16等）處于激活狀態(tài)，對機(jī)體退變產(chǎn)生重要影響［2-3］。終板軟骨細(xì)胞衰老在加劇椎間盤退變過程中扮演了重要角色［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（lncRNA）NEAT1在調(diào)控骨關(guān)節(jié)疾病的進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用［5］。

課題組既往研究證實，狗脊多糖可改善關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2含量及一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，延緩椎間盤軟骨細(xì)胞退變［6］。此外，狗脊多糖可影響基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）-3、解整合素金屬肽酶-4、解整合素金屬肽酶-5、聚集蛋白多糖表達(dá)，維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)趨于穩(wěn)態(tài)［7］。因此，本研究從lncRNA NEAT1調(diào)控細(xì)胞衰老角度，進(jìn)一步探討狗脊多糖對軟骨細(xì)胞衰老相關(guān)通路及衰老相關(guān)分泌表型因子調(diào)控的作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SPF級3周齡C57BL/6小鼠15只，雄性，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）

2017-0005；清潔級醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK（閩）2019-0007。動物處置及實驗方法符合福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會要求（倫理批號FJTCM IACUC-2020048）。

1.2 主要試劑 MMP-13一抗（Proteintech，批號00089106）；Caspase-3一抗（Proteintech，批號00092560）；CollagenⅡ（Proteintech，批號00124977）；GAPDH兔抗（Proteintech，批號00098110）；qPCR反應(yīng)試劑盒（Vazyme，批號7E410L0）；PCR引物設(shè)計與合成（福州尚亞生物）。

1.3 主要儀器 DNA擴(kuò)增儀（PE，型號9600）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD，型號GELDOC2000）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技，型號BB16/BB5060）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，型號IX70）。

2 方 法

2.1 狗脊多糖的制備 狗脊多糖制備與濃度使用參照本課題組前期實驗［7］。稱取狗脊藥材50 g，依次經(jīng)粉碎與篩檢、脫脂，重復(fù)提取2次（均為10倍體積蒸餾水·次-1/（2 h）-1，收集提取液2次，抽濾減壓，濃縮體積至100 mL；加入無水乙醇沉淀過夜，離心機(jī)以1000 r·min-1離心20 min，離心半徑10 cm；將分離出的沉淀再進(jìn)行凍干，粗多糖浸泡后再溶于蒸餾水（200 g·L-1），采用Sevag法除蛋白質(zhì)，放于超低溫冰箱保存。

2.2 軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)、造模 15只C57BL/6小鼠經(jīng)異氟烷（體積分?jǐn)?shù)為5%）麻醉后脫頸處死，逐層解剖至終板軟骨組織層，分離并收集軟骨組織，后依次經(jīng)PBS洗凈、修塊、胰蛋白酶（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%）消化、PBS再漂洗、Ⅱ型膠原酶溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%）消化等操作，將含有終板軟骨細(xì)胞的懸液接種于培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵化培養(yǎng)、傳代［7］。IL-1β（10 ng·mL-1）誘導(dǎo)12 h制備軟骨細(xì)胞衰老模型［8］。

2.3 Real-time PCR檢測各組軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1、p53、p21相對表達(dá)水平 將培養(yǎng)好的軟骨細(xì)胞分為空白對照組，模型對照組和狗脊多糖低、中、高劑量組。狗脊多糖各劑量組細(xì)胞在加入10 ng·mL-1 IL-1β干預(yù)12 h后，分別更換100，200，400 μg·mL-1 狗脊多糖繼續(xù)培養(yǎng)48 h［6］。提取各組軟骨細(xì)胞總RNA（Trizol法），逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，待Real-time PCR反應(yīng)（反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s持續(xù)40個循環(huán)；熔解曲線設(shè)置為65～95 ℃，梯度升溫，每5秒升高0.5 ℃）完成后，對各組基因表達(dá)結(jié)果采用2-ΔΔct法分析。Real-time PCR相關(guān)引物見表1。

2.4 Western blot檢測各組軟骨細(xì)胞的MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白含量 待狗脊多糖干預(yù)后，提取總蛋白，依次經(jīng)BCA定量分析、配制分離膠和濃縮膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗、二抗后進(jìn)行顯影、成像，分析數(shù)據(jù)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測狗脊多糖干預(yù)后軟骨細(xì)胞中凋亡率情況 采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測。用胰酶（無EDTA）消化收集軟骨細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒（Annexin-Ⅴ-FITC/PI）說明書操作，于流式管加入100 μL Binding buffer（1×），將FITC和PI各5 μL混勻（避光反應(yīng)15 min），再加入400 μL Binding buffer（1×）充分混勻。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用t檢驗與單因素方差分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組椎間盤軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1、p53、p21 mRNA水平比較 Real-time PCR結(jié)果顯示，與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組lncRNA NEAT1、p53、p21水平顯著降低（P < 0.05）。見表2。

3.2 各組軟骨細(xì)胞中MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示，狗脊多糖作用于IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞后，可改善MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白含量表達(dá)。與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組的MMP-13、Caspase-3蛋白含量表達(dá)顯著降低，而CollagenⅡ顯著增高（P < 0.05）。見圖1、表3。

3.3 各組椎間盤軟骨細(xì)胞凋亡率比較 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。與空白對照組比較，模型對照組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著增高（P < 0.05）；與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低（P < 0.05）。見圖2、表4。

4 討 論

脊柱關(guān)節(jié)處椎間盤退變屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，即其病位在“肝腎”，然病在“筋骨”。隨著肝腎日漸虧虛，引起筋骨失養(yǎng)、腠理空虛，正氣不足以驅(qū)逐外邪，故風(fēng)寒濕邪滯留關(guān)節(jié)而發(fā)病。因此，補(bǔ)腎柔肝、除痹消痛是其重要治則［9］。中藥狗脊始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性溫，味苦甘，入肝腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎、壯筋骨之效，切合痹證的治療病機(jī)，是臨床用于治療脊柱關(guān)節(jié)疾病的常用藥物之一［10］。狗脊多糖是中藥狗脊的重要活性物質(zhì)成分。既往研究證實，狗脊多糖可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制氧化應(yīng)激及軟骨細(xì)胞凋亡［11-13］。

近年來，大量證據(jù)表明，骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展與相關(guān)衰老細(xì)胞數(shù)量的增加密切相關(guān)［14］。一旦終板軟骨細(xì)胞經(jīng)異常因素誘導(dǎo)發(fā)生衰老，其細(xì)胞合成蛋白質(zhì)能力減弱，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，造成軟骨終板結(jié)構(gòu)紊亂，進(jìn)而加劇脊柱關(guān)節(jié)退變［15］。另有研究發(fā)現(xiàn)，衰老相關(guān)分泌表型（MMPs等）表達(dá)異常加劇了終板軟骨細(xì)胞衰老［16］。Ⅱ型膠原作為構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白成分的主要物質(zhì)，一旦發(fā)生異常降解，可引起軟骨的抗壓與彈性功能下降［17］。MMP-13作為降解Ⅱ型膠原的關(guān)鍵酶類之一，可進(jìn)一步加重軟骨退變與衰老［18］。已有研究證實，IL-1β（10 ng·mL-1）可誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞發(fā)生衰老，而衰老的終板軟骨細(xì)胞中相關(guān)衰老標(biāo)志物p53、p21蛋白呈現(xiàn)表達(dá)異常增高狀態(tài)［8］。

本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，10 ng·mL-1 IL-1β誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞后，其p53、p21水平及MMP-13、Caspase-3蛋白含量顯著增高，而Collagen Ⅱ含量顯著降低。經(jīng)狗脊多糖干預(yù)后，可顯著降低IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中p21、p53基因水平，并可改善MMP-13、Collagen Ⅱ、Caspase-3蛋白表達(dá)，并降低軟骨細(xì)胞凋亡率。究其原因，狗脊多糖的作用機(jī)制可能與調(diào)控lncRNA NEAT1密切相關(guān)。lncRNA NEAT1已被證實在退變軟骨中上調(diào)表達(dá)，并通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡加劇軟骨退行性變［19］。此外，lncRNA NEAT1的異常表達(dá)與衰老相關(guān)信號分子p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)［20］。本研究結(jié)果表明，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1水平增高，與p53變化具有一致性，進(jìn)而提示lncRNA NEAT1可能參與了對終板軟骨細(xì)胞衰老的調(diào)控；經(jīng)狗脊多糖干預(yù)后，lncRNA NEAT1水平顯著降低。

綜上所述，狗脊多糖可通過影響p53、p21、MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3表達(dá)，降低軟骨細(xì)胞凋亡率，進(jìn)而延緩椎間盤終板軟骨細(xì)胞衰老，其作用機(jī)制與調(diào)控lncRNA NEAT1有關(guān)。然而，本研究當(dāng)前仍存在不足，例如狗脊多糖調(diào)控何種與lncRNA NEAT1相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA途徑發(fā)揮延緩軟骨衰老的深層次作用機(jī)制仍需做進(jìn)一步探討。

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收稿日期：2023-10-08；修回日期：2023-11-15