劉嬋　馬東升　于林芳

[摘要] 目的 分析長(zhǎng)鏈非編碼RNAMEG3在胃癌組織中的表達(dá)水平，并探討MEG3過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生的具體影響。方法 將正常胃組織和細(xì)胞作為對(duì)照組，將胃癌組織和細(xì)胞的MEG3表達(dá)水平作為觀察組，采用qRT-PCR（定量反轉(zhuǎn)錄PCR）技術(shù)對(duì)觀察組的MEG3表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，利用轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3將其上調(diào)，檢測(cè)其轉(zhuǎn)染率。然后將上調(diào)后MEG3水平對(duì)BGC-823和MGC-803細(xì)胞的增殖能力的影響采用MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩種細(xì)胞中的p53蛋白水平進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果 （1）用熒光定量PCR測(cè)量36例胃癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織組正常組織中MEG3相對(duì)表達(dá)水平均存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）MGC-803和BGC-823細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，MEG3水平和對(duì)照組比較，顯著上升310和251倍，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（3）經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)，MEG3水平上升后，MGC-803和BGC-823細(xì)胞的增殖能力顯著下降（P<0.05）。（4）和對(duì)照組比較，MGC-803和BGC-823經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，其中p53的表達(dá)顯著增加（P<0.05）。結(jié)論 胃癌組織和細(xì)胞中的MEG3下降可以抑制p53蛋白的激活，從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖，影響胃癌的發(fā)展進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞] 胃癌；細(xì)胞增殖；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；MEG3；具體影響

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2016）09-21-04

[Abstract] Objective To analyze the long non-coding RNA MEG3 expression levels in gastric cancer and explore MEG3 specific impact on gastric cancer cell proliferation by over-expression. Methods The normal gastric tissues and cells as the control group， the expression levels of gastric carcinoma cells and MEG3 as the observation group， using qRT-PCR（quantitative reverse transcription PCR） technique MEG3 expression levels in the observation group were detected using transfection pcDNA-MEG3 be raised， to detect the transfection efficiency. Then after impact MEG3 raise the level of proliferation of BGC-823 and MGC-803 cells using MTT assay testing， and by Western blot detection of two cells p53 protein levels. Results （1）measuring 36 cases of gastric cancer tissues and the corresponding normal tissues adjacent to cancer tissue groups in the presence of water on average relative expression MEG3 significant difference was statistically significant（P<0.05） with fluorescence quantitative PCR. （2）MGC-803 and BGC-823 cells were transfected with pcDNA-MEG3， compared with a significant increase in the level of the control group MEG3 310 and 251 times the difference between the groups was significantly（P<0.05）. （3）By MTT assay， after rising MEG3 level， proliferation MGC-803 and BGC-823 cells was significantly decreased（P<0.05）. （4）And the control group， MGC-803 and BGC-823 transfected pcDNA-MEG3， which significantly increased the expression of p53（P<0.05）. Conclusion The gastric cancer tissues and cells MEG3 decline can inhibit the activation of p53 protein， leading to gastric cancer cell proliferation and the development process of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer； Cell proliferation； Long chain non encoding RNA； MEG3；Specific effects

經(jīng)全球相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌已經(jīng)成為癌癥死亡中的第二殺手，而且隨著人們飲食習(xí)慣的變化，該病的發(fā)生率正逐年上升[1-3]。由于胃癌早期并不具備典型的臨床癥狀，故確診人數(shù)有限，多以進(jìn)展期的胃癌為主，而且大部分確診患者會(huì)伴隨腹

腔內(nèi)侵襲、轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，所以很難取得令人滿意的臨床治療效果，預(yù)后效果不佳，5年生存率不足1/10[4-6]。正因如此，掌握胃癌的病理機(jī)制和分子水平的變化對(duì)于發(fā)展生物的診斷標(biāo)志物具有重要意義，可以為胃癌的有效治療提供科學(xué)依據(jù)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA具有很多生物學(xué)功能，而且在很多生物進(jìn)程中具有重要作用。有研究顯示[7-8]，lncRNA的變異和調(diào)節(jié)功能異常是導(dǎo)致腫瘤的重要因素，所以確定與癌癥密切相關(guān)的lncRNA，對(duì)其生物和分子學(xué)作用進(jìn)行研究對(duì)于腫瘤的研究具有重要意義。為了分析長(zhǎng)鏈非編碼RNAMEG3在胃癌組織中的表達(dá)水平，并探討MEG3過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生的具體影響，我院進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院在2008年4月～2012年12月期間收治的胃癌手術(shù)治療患者共36例，入選者均符國(guó)際胃癌診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)，且術(shù)前未接受任何局部或全身治療。將36例胃癌手術(shù)患者歸為觀察組，組內(nèi)男21例，女15例；年齡34～59歲，平均（48.3±3.9）歲。選取另36例胃部健康人群歸為對(duì)照組，組內(nèi)男20例，女16例；年齡32～58歲，平均（47.1±3.4）歲。兩組研究對(duì)象在性別、年齡等方面無(wú)明顯差異（P>0.05），具有可比性。

病理組織樣本采集后立刻行液氮冷凍，置于-80℃環(huán)境中保存待檢。本次研究經(jīng)我院倫理組織委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者均自愿簽署《知情同意書(shū)》。購(gòu)置專業(yè)的SGC7901、MGC-803和BGC-823胃癌細(xì)胞系以及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1，在37℃以及5%二氧化碳的恒溫箱中，上述細(xì)胞系均接受高糖DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，每24～48小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)開(kāi)始傳代培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 提取RNA和qRT-PCR 將正常胃組織和細(xì)胞作為對(duì)照組，將胃癌組織和細(xì)胞的MEG3表達(dá)水平作為觀察組，采用TRIzol試劑（福州晶康生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)品規(guī)格：100mL；產(chǎn)品編號(hào)：RP1001）提取培養(yǎng)細(xì)胞中或組織中的總RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄盒使其反轉(zhuǎn)錄為cRNA，并使用專門(mén)試劑（一步法快速PCR檢測(cè)試劑盒，規(guī)格200×25μL，商品型號(hào)DDM0069A-25μL×200）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果采用GAPDH進(jìn)行量化表達(dá)，記錄MEG3以及GAPDH的上下游PCR引物。在ABI 7500平臺(tái)上收集數(shù)據(jù)和qRT-PCR結(jié)果，并采用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)MEG3的表達(dá)進(jìn)行計(jì)算。

1.2.2 構(gòu)建和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 MEG3序列經(jīng)合成和反克隆為pcDNA載體，經(jīng)pcDNA-MEG3轉(zhuǎn)染對(duì)MEG3的異常水平進(jìn)行表達(dá)，并將空pcDNA載體作為對(duì)照，使用qPCR檢驗(yàn)MEG3的表達(dá)水平。所有pcDNA-MEG3和空pcDNA載體均經(jīng)專門(mén)試劑盒提取，嚴(yán)格按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將其轉(zhuǎn)染到6孔平板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，于2d后收集細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR和Western blot分析，以及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本次研究數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)重要指標(biāo)進(jìn)行給出95%CI區(qū)間，并對(duì)其相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2或t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中的MEG3水平

用熒光定量PCR測(cè)量36例胃癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織組正常組織中MEG3相對(duì)表達(dá)水平，其中MEG3表達(dá)水平為（△CT=8.1542±1.571），顯著低于癌旁正常組織中的表達(dá)水平（△CT=6.224±1.976），組間差異顯著（t=4.5872，P=0.025<0.05）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)外源性上調(diào)MEG3表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

MGC-803和BGC-823細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，MEG3水平和對(duì)照組比較，顯著上升310和251倍，組間差異顯著（t=2.036，P=0.002<0.05）。經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)，MEG3水平上升后，MGC-803和BGC-823細(xì)胞的增殖能力顯著下降（t=3.632，P=0.000<0.05）。

2.3 MEG3誘導(dǎo)p53蛋白激活

和對(duì)照組比較，MGC-803和BGC-823經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，其中p53的表達(dá)顯著增加（t=1.945，P=0.004<0.05）。具體見(jiàn)圖1。

3 討論

胃癌屬于多因素和異質(zhì)性的侵襲性疾病，是各種癌癥患者中死亡率較高的一種疾病類(lèi)型，已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，胃癌很難徹底治愈，且預(yù)后效果和確診時(shí)胃癌的分期具有密切關(guān)聯(lián)，將癌組織完全切除是目前治療胃癌的唯一有效措施[9-11]。

在胃癌患者的細(xì)胞水平表達(dá)中，早期患者和遠(yuǎn)期發(fā)展患者的一系列復(fù)雜分子的異常將會(huì)對(duì)正常細(xì)胞的功能造成嚴(yán)重影響，在遺傳和表觀遺傳學(xué)修飾的作用下，很多基因在正常細(xì)胞和受影響的細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)存在明顯的差異。因此，對(duì)這些的發(fā)生異常變化的分子進(jìn)行研究，對(duì)于深刻了解癌細(xì)胞生物學(xué)的行為機(jī)制以及胃癌具有重要意義[12-14]。

近年來(lái)，隨著長(zhǎng)鏈非編碼RNA的研究逐漸深入，它的異常表達(dá)對(duì)胃癌發(fā)生以及發(fā)展機(jī)制的影響研究也開(kāi)始深入[15-16]。所以，本次研究通過(guò)檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼 RNAMEG3在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平，以及其過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，以此來(lái)確立MEG3水平和胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，結(jié)合前人實(shí)驗(yàn)的MEG3對(duì)其他腫瘤細(xì)胞增殖的抑制機(jī)制，來(lái)推測(cè)其可能的在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制[17-19]。

在本次研究中，相對(duì)于正常健康胃部組織而言，存在癌細(xì)胞的胃部組織及細(xì)胞中的MEG3水平明顯更低，組間各細(xì)胞中的MEG3表達(dá)水平均存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果說(shuō)明，MEG3水平可成為胃癌的診斷依據(jù)。和對(duì)照組比較，MGC-803和BGC-823經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，其中p53的表達(dá)顯著增加（P<0.05）。這一結(jié)果充分說(shuō)明，提高M(jìn)GC-803和BGC-823細(xì)胞中的MEG3水平有助于提高p53的表達(dá)，可能提示MGC-803和BGC-823MEG3在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能通過(guò)促進(jìn)p53的激活而發(fā)揮抑癌作用[20-23]。

由此可知，胃癌組織和細(xì)胞中的MEG3下降可以抑制p53蛋白的激活，從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖，影響胃癌的發(fā)展進(jìn)程。當(dāng)然，MEG3水平對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響可能不僅僅限于p53，所以還有待進(jìn)行更深入的后續(xù)研究。

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（收稿日期：2015-12-02）