許 麗, 樂麗歡, 楊 雪, 王炤坤, 李蘭英, 聞艷麗, 陶 晴, 胡軼紅, 劉 剛

(1.上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院 國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(生物分析計(jì)量溯源)，上海 201203；2.中國科學(xué)院 上海免疫與感染研究所 公共技術(shù)服務(wù)中心 病原發(fā)現(xiàn)與大數(shù)據(jù)平臺，上海 200031)

1 引 言

呼吸道感染是引起人類尤其是嬰幼兒死亡的主要病因之一,病毒是呼吸道感染的主要病原體,可通過接觸、飛沫和氣溶膠傳播,傳染性強(qiáng),嚴(yán)重威脅人類健康[1, 2]。甲型流感病毒(influenza A virus, FluA)是一種RNA病毒,根據(jù)病毒表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)的不同,可以分為18個HA亞型(H1～H18)和11個NA亞型(N1～N11)[3, 4],其中H1N1亞型是感染人類的主要亞型之一[5],易引起流感破壞性大流行,需要做到早期快速靈敏診斷,以減少病毒傳播和流行。

近年來,應(yīng)用于病毒核酸高靈敏度檢測的技術(shù)飛速發(fā)展,包括逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)、恒溫核酸擴(kuò)增、重組酶聚合酶擴(kuò)增、生物傳感器等[6～13],相關(guān)檢測試劑盒不斷被研發(fā)并投入使用,為診療一線的快速精準(zhǔn)診斷和治療提供了有利支撐[14, 15]。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以用于評價核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和溯源性,經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢,目前國內(nèi)針對流感病毒核酸檢測共有5種國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),分別為禽流感病毒H5亞型(WF19株)核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)091224)、禽流感病毒H7亞型(LN114株)核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)091225)、甲型H1N1流感病毒假病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)091257)、甲型H3N2流感病毒假病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)091258)和乙型(維多利亞系)流感病毒假病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)091259)。但需要注意的是,目前缺乏滅活病毒形式的甲型流感病毒H1N1型核酸有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),已有標(biāo)物序列不能覆蓋甲型流感病毒H1N1型基因組全長,也無法對提取、檢測等病毒分析全過程進(jìn)行質(zhì)量控制,給病毒核酸檢測的量值溯源帶來風(fēng)險(xiǎn),影響相關(guān)試劑和產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

針對上述情況,研制了一種滅活病毒形式的甲型流感病毒H1N1型核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),其原料來源于培養(yǎng)的真實(shí)病毒。具體制備流程為:首先對滅活后的病毒進(jìn)行滅活效果確認(rèn);然后采用數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)方法聯(lián)合多家實(shí)驗(yàn)室對滅活病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物進(jìn)行定值;再對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性進(jìn)行評估;最后對量值不確定度及應(yīng)用性能進(jìn)行分析。經(jīng)驗(yàn)證該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可為H1N1型甲型流感病毒檢測的全過程提供計(jì)量溯源和質(zhì)量控制支撐。

2 材料與方法

2.1 主要試劑

甲型流感病毒H1N1型毒株(VR-825)購自美國細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(American type culture collection, ATCC);病毒核酸提取試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;病毒稀釋保存液購自廣州邦德盛生物科技有限公司;新冠病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)091111)來自上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院;新型冠狀病毒、副流感病毒、人鼻病毒A型、人鼻病毒B型、人鼻病毒C型、呼吸道合胞病毒、人麻疹病毒、人風(fēng)疹病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品來自上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院;One-step RT-ddPCR Kit for Probes購自美國伯樂公司;甲型H1N1流感病毒(2009)RNA檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自廣州達(dá)安基因股份有限公司;甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自鄭州安圖生物工程股份有限公司;引物探針由百力格生物科技(上海)股份有限公司合成。

2.2 主要儀器

病毒培養(yǎng)箱(Thermo scientific);倒置相差顯微鏡(Olympus);微滴式數(shù)字PCR儀及配套儀器(伯樂);實(shí)時熒光PCR儀(Life Technologies);芯片式dPCR儀(臻準(zhǔn)生物科技(上海)有限公司)。

2.3 滅活病毒培養(yǎng)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

培養(yǎng)甲型流感病毒H1N1型,宿主細(xì)胞為MDCK細(xì)胞,培養(yǎng)條件為EMEM培養(yǎng)基(1%青霉素/鏈霉素,1 μg/mL TPCK),35 ℃,5%CO2。培養(yǎng) 3～5天后收集病毒液,離心去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片,使用0.45 μm濾膜過濾除去細(xì)小顆粒。冰浴條件下向病毒液加入β-丙內(nèi)酯(終濃度為0.1%),室溫?fù)u晃過夜滅活病毒。離心收集滅活病毒,將滅活后的病毒重新接種培養(yǎng)宿主細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)7天,采用實(shí)時熒光PCR法監(jiān)測病毒Ct值變化趨勢,如Ct值不變即表明病毒完全滅活。將收集的滅活病毒按照一定的比例進(jìn)行稀釋,隨后進(jìn)行分裝,共分裝200管,每管210 μL,分裝完成后立即置于-80～-70 ℃條件下保存。

2.4 數(shù)字PCR定值方法

經(jīng)核酸提取效率確認(rèn),選取基于核酸制備膜技術(shù)的試劑盒用于研究中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)核酸提取。優(yōu)化后采用的數(shù)字PCR定值引物探針見表1,配制體系見表2,擴(kuò)增程序見表3。

表1 數(shù)字PCR定值引物探針序列Tab.1 Sequences of primers and probe for digital PCR detection

表2 數(shù)字PCR體系配制Tab.2 Preparation of digital PCR system μL

表3 數(shù)字PCR擴(kuò)增程序Tab.3 Digital PCR amplification program

2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值和數(shù)據(jù)處理過程

聯(lián)合5家實(shí)驗(yàn)室采用優(yōu)化后的數(shù)字PCR方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的拷貝數(shù)濃度量值共同進(jìn)行定值。定值的同時發(fā)放統(tǒng)一的能力驗(yàn)證樣品,檢驗(yàn)參與定值實(shí)驗(yàn)室檢測準(zhǔn)確性和提取效率。對全部定值數(shù)據(jù)除以每家實(shí)驗(yàn)室的提取效率,隨后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,對組內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)、離群值檢驗(yàn),組間數(shù)據(jù)進(jìn)行等精度檢驗(yàn)、離群值檢驗(yàn),最后將符合要求的平均值再次計(jì)算平均值,即為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

甲型流感病毒H1N1型培養(yǎng)物經(jīng)化學(xué)滅活后,對其滅活效果進(jìn)行驗(yàn)證。將滅活前和滅活后病毒重新接種培養(yǎng)宿主細(xì)胞,培養(yǎng)一周時間,期間連續(xù)取樣5次進(jìn)行病毒核酸實(shí)時熒光PCR檢測,Ct值越小代表病毒核酸含量越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,滅活之前的接種樣品(圖1紅色線),隨著培養(yǎng)時間的延長,Ct值明顯降低,展示了典型的病毒感染細(xì)胞并進(jìn)行自我復(fù)制的過程;滅活后樣品病毒實(shí)時熒光PCR的Ct值沒有明顯變小(圖1藍(lán)色線),證明滅活病毒接種細(xì)胞后無復(fù)制繁殖,滅活效率良好,可確保無生物危害。

圖1 滅活病毒重新接種宿主細(xì)胞培養(yǎng)過程實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果Fig.1 Real-time PCR results of inactivated virus re-inoculation in host cell culture

3.2 定值方法的建立、優(yōu)化與驗(yàn)證

3.2.1 核酸提取效率驗(yàn)證

選取基于核酸制備膜技術(shù)的試劑盒用于研究中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)核酸提取,使用新冠病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)091111)對其核酸提取效率進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證方法:對加入人工血清的新冠病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行核酸提取;接著對N基因片段進(jìn)行數(shù)字PCR定值;檢測值除以新冠病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)N基因的標(biāo)準(zhǔn)值即為試劑盒的核酸提取效率。經(jīng)驗(yàn)證,研究所采用的試劑盒核酸提取效率為100.9%,滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值需求。

3.2.2 數(shù)字PCR定值方法優(yōu)化

設(shè)計(jì)2套引物探針對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取核酸進(jìn)行擴(kuò)增,2套引物探針擴(kuò)增信號如圖2所示,根據(jù)圖中結(jié)果可知,使用第1套引物探針(圖2引物探針1)獲得的數(shù)據(jù),明顯具有更優(yōu)的信號區(qū)分度,故而優(yōu)選第1對引物探針用于后續(xù)的病毒核酸數(shù)字PCR測量實(shí)驗(yàn)。

接下來,設(shè)置多種引物-探針濃度組合,分別進(jìn)行數(shù)字PCR測量,比較病毒核酸定量結(jié)果,最終選擇定量結(jié)果(如圖3(a)所示)濃度最高的組合(引物為 600 nM,探針為100 nM),作為最終數(shù)字PCR定值的引物探針條件?？疾鞌?shù)字PCR退火溫度條件,在50～60 ℃之間設(shè)置8個不同的梯度溫度作為數(shù)字PCR的退火溫度,進(jìn)行數(shù)字PCR測量,根據(jù)定量結(jié)果(如圖3(b)所示),優(yōu)選定量濃度最優(yōu)的54 ℃為最佳退火溫度。優(yōu)化后的數(shù)字PCR方法信號區(qū)分雨滴圖見圖3(c)。

圖3 關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化和優(yōu)化后的檢測結(jié)果圖Fig.3 Key parameter optimization and optimized test results

3.2.3 數(shù)字PCR定值方法考察研究

對方法關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證和考察。首先驗(yàn)證了方法的特異性,選取6種其他呼吸道病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品(新型冠狀病毒、副流感病毒、人鼻病毒A型、人鼻病毒B型、人鼻病毒C型、呼吸道合胞病毒、人麻疹病毒、人風(fēng)疹病毒)作為核酸模板,用研究中的數(shù)字PCR定值方法進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,顯示該方法特異性良好。然后考察了方法的重復(fù)性,將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品獨(dú)立檢測8次,檢測數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%圖4,即為定值方法的重復(fù)性。最后驗(yàn)證了方法的檢測限,將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)核酸稀釋至2、1、0.5 copies/μL后進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增,確定95%置信度水平下能夠穩(wěn)定檢測的非0結(jié)果最低濃度為1 copies/μL,該濃度檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)為0.36,則該方法的最低檢測限(LOD)為1.09 copies/μL(3S),最低定量限(LOQ)為3.64 copies/μL(10S)。

圖4 數(shù)字定值PCR方法重復(fù)性考察結(jié)果Fig.4 Verification of the repeatability of digital PCR method

3.3 均勻性評估結(jié)果

參照J(rèn)JF 1343-2022《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及均勻性、穩(wěn)定性評估》[16]對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性評估。從分裝完畢的200瓶滅活病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品中隨機(jī)選取11瓶,每瓶取樣3次,每次取樣50 μL進(jìn)行檢測。核酸提取后,采用數(shù)字PCR方法進(jìn)行檢測,采用方差分析法(F檢驗(yàn))進(jìn)行均勻性檢驗(yàn),檢測結(jié)果見圖5。對計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的拷貝數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn),檢驗(yàn)結(jié)果見表4,由于F

圖5 均勻性評估檢測結(jié)果Fig.5 Uniformity evaluation test results

表4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性評估統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Tab.4 Statistical analysis results of homogeneity evaluation of reference materials

3.4 穩(wěn)定性評估

3.4.1 短期穩(wěn)定性評估結(jié)果

評估標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃及4 ℃溫度下放置0、1、3、7、10和14天后,采用數(shù)字PCR作為測量方法,考察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度量值隨著保存時間延長是否有量值變化的情況。采用同步穩(wěn)定性評估方案[16],通過回歸曲線方法來進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測,以判斷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值是否有單方向變化的趨勢。測定結(jié)果見圖6(a)和圖6(b),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃及4 ℃下放置14天量值均保持穩(wěn)定,滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)運(yùn)輸要求。

圖6 穩(wěn)定性檢測結(jié)果Fig.6 Stability test results

圖7 5家實(shí)驗(yàn)室數(shù)字PCR定值結(jié)果Fig.7 Digital PCR detection results of 5 laboratories

3.4.2 長期穩(wěn)定性評估結(jié)果

測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-80～-70 ℃條件下放置0、1、2、3、4、5月后的濃度量值,檢測結(jié)果見圖6(c)。通過回歸曲線方法來進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測,以判斷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值是否有單方向變化的趨勢,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在在-80～-70 ℃條件下保存5個月保持穩(wěn)定,并且穩(wěn)定性監(jiān)控還在持續(xù)進(jìn)行中。

3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果

共5家單位參與了本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的數(shù)字PCR聯(lián)合定值。每家實(shí)驗(yàn)室的提取效率及測量準(zhǔn)確性都進(jìn)行了科學(xué)評估。定值結(jié)果除以各家實(shí)驗(yàn)室的提取效率,即為最終的定值數(shù)據(jù),詳見圖8。對定值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,確保無組內(nèi)可疑值、組間等精度、組間無可疑值后,求出數(shù)據(jù)的總平均值,最終得出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果為1 384.5 copies/μL。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度評定結(jié)果

對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引起的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引起的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度分別進(jìn)行評定及統(tǒng)計(jì)合并,得出最終標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對擴(kuò)展不確定度為18%,各不確定度分量和評定結(jié)果見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評定結(jié)果Tab.5 Uncertainty evaluation results of the reference material (%)

4 結(jié) 論

通過真實(shí)病毒培養(yǎng)、濃縮、病毒滅活、滅活效果驗(yàn)證、核酸提取方法研究、數(shù)字PCR定值方法建立、優(yōu)化與驗(yàn)證、均勻性評估、穩(wěn)定性評估、應(yīng)用性能驗(yàn)證等步驟,研制了甲型流感病毒H1N1型滅活病毒形式的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。相較于RNA片段、質(zhì)粒DNA、假病毒等形式的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),該甲型流感病毒H1N1型滅活病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以為核酸提取與核酸檢測全過程提供質(zhì)量控制支持,因其包含病毒全基因組核酸,還具有更廣的適用范圍。此外,研究建立了一套高準(zhǔn)確度數(shù)字PCR定值方法,實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)核酸濃度的精準(zhǔn)定量。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或可在甲型流感病毒H1N1型核酸的檢測方法開發(fā)、試劑盒質(zhì)量評價、檢測實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)、室間質(zhì)控等方面得到應(yīng)用。