不同海拔急性髓系白血病患者化療前后血清及骨髓造血因子表達(dá)水平差異研究

孫琦，周厚法，李文倩，解友邦，王愛博

1.810016 青海省西寧市，青海大學(xué)研究生院

2.277000 山東省棗莊市立醫(yī)院消化科

3.810000 青海省西寧市，青海省人民醫(yī)院血液科

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種造血干、祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病?；熥鳛锳ML患者重要的治療手段，在發(fā)揮療效的同時也產(chǎn)生一定的毒副作用，其中最常見的毒副作用是骨髓抑制，是導(dǎo)致化療藥物劑量減量、治療受限甚至中止治療的重要原因之一［1］。在臨床中發(fā)現(xiàn)中海拔環(huán)境下，即使沒有身體因素和年齡因素的影響，給予標(biāo)準(zhǔn)劑量的治療方案后，AML患者的骨髓抑制明顯加重，骨髓造血功能恢復(fù)時間明顯延長，最長能達(dá)到4～5周。骨髓中各類血細(xì)胞的發(fā)育增殖、分化受到多種造血因子的調(diào)控，主要有正性調(diào)節(jié)因子，如促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）、FMS樣酪氨酸激酶3配體（FMS-like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)lt3-L）、促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、白介素（interleukin，IL）-3、IL-6等，負(fù)性調(diào)控因子如干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。EPO主要促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，對巨核系造血也具有一定的輔助作用［2］。Flt3-L通過刺激造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）的增殖和分化促進(jìn)造血。IL-3可與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子協(xié)同造血，并具有重疊活性，主要作用于早、中期造血祖細(xì)胞的增殖、分化。多種造血因子相互作用才能使造血細(xì)胞的增殖更新處于穩(wěn)態(tài)，正、負(fù)調(diào)節(jié)的失常在AML化療后骨髓抑制發(fā)病機制中具有十分重要的地位。

研究不同海拔AML患者化療后骨髓抑制期間骨髓及血清造血因子表達(dá)水平是否存在差異，探討存在差異的造血因子在骨髓抑制恢復(fù)中的作用，為導(dǎo)致不同海拔骨髓抑制差異的原因提供研究方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021—2022年青海省人民醫(yī)院血液科（中海拔地區(qū)1 501～2 500 m）及中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院血液科（低海拔地區(qū)500～1 500 m）首診初治的28例AML患者（非M3型）為研究對象，根據(jù)就診醫(yī)院海拔高低將AML患者分為中海拔組（13例）和低海拔組（15例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）滿足國際最新的細(xì)胞形態(tài)學(xué)（morphology）、免疫學(xué)（immunology）、細(xì)胞遺傳學(xué)（cytogenetics）和分子生物學(xué)（molecular biology）分型，即MICM分型診斷模式，分型采用急性白血病FAB標(biāo)準(zhǔn)，明確診斷為AML；（2）采用標(biāo)準(zhǔn)方案化療患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）治療相關(guān)性AML；（2）合并嚴(yán)重急、慢性感染性疾?。唬?）存在化療禁忌證或未完成1個周期化療。本研究已獲得青海省人民醫(yī)院倫理審查通過（倫理批件號：2022-25），且患者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

AML患者均采取常規(guī)的誘導(dǎo)緩解治療方案：標(biāo)準(zhǔn)劑量阿糖胞苷［賽德薩，輝瑞制藥（無錫）有限公司，0.1 g］100～200 mg·m-2·d-1×7 d聯(lián)合去甲氧柔紅霉素（艾諾寧，瀚暉制藥有限公司，5 mg）12 mg·m-2·d-1×3 d或柔紅霉素（初潔，山東新時代藥業(yè)有限公司，20 mg）60～90 mg·m-2·d-1×3 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 骨髓抑制分度評估：采用WHO抗癌藥物急性及亞急性毒性反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)評估患者化療第8、14、28天骨髓抑制分度。

1.3.2 造血因子表達(dá)水平測定：使用血清生化管于化療前、給予標(biāo)準(zhǔn)初次化療第8天（僅外周）以及第28天收集外周血及骨髓液樣本2 mL，4 ℃下離心（1 600 r/min）10 min后取上清液，4 ℃下超速離心（12 000 r/min）2 min，取上層血清0.1 mL置于無菌無酶凍存管，-80 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法對患者血清及骨髓上清液EPO、Flt3-L、TPO和IFN-γ水平進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；偏態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）表示，兩獨立樣本比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗，兩相關(guān)樣本偏態(tài)分布樣本比較采用Wilcoxon秩和檢驗，多個相關(guān)樣本偏態(tài)分布資料比較采用Friedman檢驗，組間存在差異時采用Bonferroni法進(jìn)行分組成對比較；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗或秩和檢驗（有序多分類結(jié)局）。檢驗標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

兩組患者性別、年齡及FAB分型比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組AML患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data of AML patients in the two groups

2.2 兩組AML患者化療第8、14、28天骨髓抑制分度比較

化療第8天，兩組患者骨髓抑制分度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-1.284，P=0.199）；化療第14、28天，低海拔組患者骨髓抑制分度均高于中海拔組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-1.975，P=0.048；Z=-2.049，P=0.040），見圖1。

圖1 中、低海拔AML患者骨髓抑制分度比較堆疊圖Figure 1 Stacked plot comparing myelosuppression scores in AML patients at middle and low altitudes

2.3 兩組AML患者化療前后血清造血因子表達(dá)水平比較

2.3.1 兩組AML患者化療前后血清EPO表達(dá)水平比較：（1）組間比較：化療前、化療第8天，兩組患者血清EPO表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組血清EPO表達(dá)水平高于中海拔組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。（2）組內(nèi)比較：中海拔組化療第28天血清EPO表達(dá)水平低于化療第8天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；低海拔組化療前后血清EPO表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 兩組AML患者化療前后血清造血因子表達(dá)水平比較［M（P25，P75）］Table 2 Comparison of serum hematopoietic factor expression levels in two groups of AML patients before and after chemotherapy

2.3.2 兩組AML患者化療前后血清Flt3-L表達(dá)水平比較：（1）組間比較：化療前、化療第28天，低海拔組血清Flt3-L表達(dá)水平均高于中海拔組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；化療第8天，兩組患者血清Flt3-L表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（2）組內(nèi)比較：兩組患者化療第8天、化療第28天血清Flt3-L表達(dá)水平均高于化療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3.3 兩組AML患者化療前后血清TPO表達(dá)水平比較：（1）組間比較：化療前、化療第8天、化療第28天，低海拔組血清TPO表達(dá)水平均高于中海拔組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。（2）組內(nèi)比較：中海拔組化療前后血清TPO表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；低海拔組患者化療第8天血清TPO表達(dá)水平低于化療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3.4 兩組AML患者化療前后血清IFN-γ表達(dá)水平比較：兩組患者化療前后血清IFN-γ表達(dá)水平組間、組內(nèi)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.4 兩組AML患者化療前后骨髓造血因子表達(dá)水平比較

2.4.1 兩組AML患者化療前后骨髓EPO表達(dá)水平比較：化療前，兩組患者骨髓EPO表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組骨髓EPO表達(dá)水平高于中海拔組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組患者化療前后骨髓EPO表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P≥0.05），見表3。

表3 兩組AML患者化療前后骨髓造血因子表達(dá)水平比較［M（P25，P75）］Table 3 Comparison of bone marrow hematopoietic factor expression levels in two groups of AML patients before and after chemotherapy

2.4.2 兩組AML患者化療前后骨髓Flt3-L表達(dá)水平比較：化療前，兩組患者骨髓Flt3-L表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組骨髓Flt3-L表達(dá)水平高于中海拔組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組患者化療第28天骨髓Flt3-L表達(dá)水平均高于化療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4.3 兩組AML患者化療前后骨髓TPO表達(dá)水平比較：化療前，兩組患者骨髓TPO表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組骨髓TPO表達(dá)水平高于中海拔組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。中海拔組化療第28天骨髓TPO表達(dá)水平低于化療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；低海拔組化療前后骨髓TPO表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

2.4.4 兩組AML患者化療前后骨髓IFN-γ表達(dá)水平比較：兩組患者化療前后骨髓IFN-γ表達(dá)水平組間、組內(nèi)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

3 討論

AML患者化療后最常見的毒副作用是骨髓抑制，這是導(dǎo)致化療藥物劑量減量、治療受限甚至中止治療的重要原因之一［1］?；熀蠊撬枰种埔褔?yán)重威脅惡性腫瘤患者的生存率及生存質(zhì)量，需要在預(yù)防及管理上做出及時而有效的措施，這也是臨床AML患者治療中的一項棘手工作。李國元等［3］采用隨機自身對照的研究方法針對不同海拔地區(qū)化療后骨髓抑制展開研究，發(fā)現(xiàn)患者在高海拔時骨髓抑制程度較中海拔嚴(yán)重，且使用粒細(xì)胞集落刺激因子治療有效率降低。

3.1 EPO表達(dá)水平的改變

EPO主要由腎臟和肝臟細(xì)胞產(chǎn)生，刺激骨髓內(nèi)HSC增殖和分化，主要促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，對巨核系造血也具有一定的輔助作用［2］。EPO的產(chǎn)生受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中最主要的是氧氣濃度與紅細(xì)胞數(shù)量［4］。當(dāng)身體缺氧或紅細(xì)胞數(shù)量降低時，腎臟會感知到缺氧信號，缺氧誘導(dǎo)因子1α 和EPO基因位于3'末端的增強子中的氧敏感反應(yīng)元件相結(jié)合，激活腎臟上皮細(xì)胞中EPO基因的轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)EPO基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄［5］。SAWABE等［6］選取了12例血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者并對其血清EPO表達(dá)水平進(jìn)行了多療程長期監(jiān)測，研究結(jié)果顯示化療開始后血清EPO表達(dá)水平很快升高，達(dá)峰值時間約為12.8 d，并在化療停止后降低，且這種變化與化療方案無關(guān)。該研究還對患者血清EPO表達(dá)水平與Hb濃度進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在相同Hb濃度下，化療期間EPO表達(dá)水平高于化療前，因此推測在化療期間EPO表達(dá)水平主要受骨髓抑制而非Hb濃度的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)化療第8天血清EPO表達(dá)水平較治療前有上升趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，化療第28天時血清EPO表達(dá)水平處于回落階段?；煹?天血清EPO表達(dá)水平較化療前有升高趨勢，提示化療后骨髓抑制期間機體造血功能的恢復(fù)需要EPO的支持，化療第28天血清EPO表達(dá)水平較化療第8天降低可能是由于機體造血功能已處于恢復(fù)階段所致。

通過對化療前、化療第8天及化療第28天3個時間點兩組患者血清及骨髓EPO表達(dá)水平的分析，化療前，兩組患者血清及骨髓EPO表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組血清及骨髓EPO表達(dá)水平高于中海拔組（P<0.05）?？赡苁怯捎诘秃０位煹?8天EPO表達(dá)水平更高，促進(jìn)了低海拔AML患者骨髓抑制的恢復(fù)。盡管低氧可促進(jìn)EPO的表達(dá)，但BASAK等［7］研究發(fā)現(xiàn)久居高海拔地區(qū)的健康人與低海拔地區(qū)健康人EPO水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，研究表明，當(dāng)?shù)秃０尉用裨L問高海拔地區(qū)時，急性缺氧暴露后血清EPO水平升高，以適應(yīng)高原低氧環(huán)境，當(dāng)機體通過自身調(diào)節(jié)適應(yīng)高海拔環(huán)境后EPO水平將恢復(fù)到暴露前的水平。因此，推測海拔導(dǎo)致血清EPO水平升高主要集中在從低海拔地區(qū)前往高海拔地區(qū)的個人，而對于長期居住兩地的健康者來說，血清EPO表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本課題研究對象均為長期居住于各自海拔的AML患者，海拔因素在化療期間對EPO的分泌起到的作用及其機制尚未闡明，仍需進(jìn)一步研究。此外，由于本試驗僅選取了中海拔AML患者，并未納入高海拔患者，且樣本量較小，后續(xù)仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證。

3.2 Flt3-L表達(dá)水平的改變

Flt3-L主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和造血細(xì)胞產(chǎn)生，F(xiàn)lt3-L通過與受體結(jié)合，與其他造血細(xì)胞生長因子協(xié)同促進(jìn)HSC的自我更新及造血祖細(xì)胞的增殖和分化，同時也可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增生［8-9］。2001年，BRUSERUD等［10］發(fā)現(xiàn)治療前白血病患者（包括AML和ALL）血漿Flt3-L水平與健康對照組相當(dāng)，在化療期間表達(dá)水平升高。SATO等［11］的研究顯示血漿Flt3-L的濃度在化療開始后升高，在第15天達(dá)到峰值，然后在第25天降至基線。KUNCMAN等［12］發(fā)現(xiàn)直腸腺癌患者放化療后外周血中Flt3-L的濃度在前兩周增加，并在放化療結(jié)束前保持在類似水平，且Flt3-L濃度的初始增加量與活性骨髓的劑量/體積相關(guān)。2019年，DEMMERATH等［13］將人CD34+細(xì)胞移植到3 Gy照射的骨髓抑制小鼠中，使用Flt3-L和TPO反復(fù)治療，發(fā)現(xiàn)Flt3-L和TPO組合使用可通過抑制促細(xì)胞凋亡BCL-2蛋白BIM和BMF的轉(zhuǎn)錄，在治療第7天導(dǎo)致骨髓中的人類細(xì)胞相對增加，脾臟中的人類細(xì)胞數(shù)量略有增加，在一定程度上促進(jìn)了體內(nèi)人的造血再生。

本研究結(jié)果顯示，兩組患者化療第8天及化療第28天血清Flt3-L表達(dá)水平均較治療前顯著上升，提示化療后骨髓抑制期間機體造血功能的恢復(fù)需要Flt3-L的支持，且這一趨勢在骨髓與血清中表現(xiàn)相同。化療第28天，低海拔組血清及骨髓Flt3-L表達(dá)水平高于中海拔組（P<0.05）。通過對不同海拔患者臨床資料的分析發(fā)現(xiàn)中海拔骨髓抑制分度較低海拔更為嚴(yán)重，可能由于低海拔化療后Flt3-L表達(dá)水平更高，可促進(jìn)HSC的增殖并通過增加HSC中Bcl-2一種抗凋亡蛋白促進(jìn)HSC存活［14］，從而促進(jìn)了低海拔AML患者化療后骨髓抑制的恢復(fù)。此外，有研究指出，當(dāng)骨髓造血微環(huán)境受損時，機體Flt3-L表達(dá)水平明顯降低［15］，因此，當(dāng)患者接受多次化療，導(dǎo)致機體骨髓基質(zhì)損傷后，F(xiàn)lt3-L水平可一直低于正常水平。由于本研究以初次診斷AML患者為研究對象，對于多周期化療后不同海拔AML患者Flt3-L表達(dá)水平是否存在差異仍需進(jìn)一步研究。

3.3 TPO表達(dá)水平的改變

TPO是一種蛋白質(zhì)類激素，在人體內(nèi)可由多個部位產(chǎn)生，主要包括肝臟、腎臟、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞等，經(jīng)血液中循環(huán)輸送到骨髓，通過與促血小板生成素受體（MPL）結(jié)合，形成一種關(guān)鍵的造血細(xì)胞因子信號復(fù)合物，即TPO-MPL復(fù)合物，從而激活多種信號通路，主要促進(jìn)巨核細(xì)胞、血小板的生成和增殖［16-17］。近年來的一些研究也證實EPO在HSC的靜止、自我更新、增殖與分化中也起重要作用［18］。DEMMERATH等［13］提出TPO是通過抑制促凋亡效應(yīng)蛋白促進(jìn)造血細(xì)胞的存活而不是促進(jìn)造血祖細(xì)胞增殖，這將不會導(dǎo)致造血祖細(xì)胞過早衰竭。國內(nèi)學(xué)者吳永霞等［19］發(fā)現(xiàn)血清TPO水平在化療10 d顯著下降，而化療15 d有所上升，但仍低于治療前?？紤]化療前由于白血病細(xì)胞浸潤骨髓抑制巨核系造血，機體負(fù)反饋導(dǎo)致血清TPO水平升高。但國外學(xué)者的研究卻發(fā)現(xiàn)AML患者化療后骨髓抑制期間TPO水平顯著增加，但隨后降至健康對照受試者的水平［20］。

目前對于AML患者化療前后TPO表達(dá)水平變化仍存在爭議，本研究結(jié)果顯示，兩組患者化療后血清及骨髓TPO表達(dá)水平較化療前有下降趨勢；化療第28天，低海拔組血清及骨髓TPO表達(dá)水平高于中海拔組（P<0.05）。

通過對兩組患者骨髓抑制分度的分析發(fā)現(xiàn)，中海拔組患者骨髓抑制更重，考慮可能是由于低海拔化療第28天TPO表達(dá)水平更高，促進(jìn)了低海拔AML患者骨髓抑制的恢復(fù)，目前對于不同海拔TPO表達(dá)水平的研究較少，海拔因素如何調(diào)節(jié)TPO的分泌仍需進(jìn)一步研究。由于本研究樣本量較小，且AML患者血小板低于20×109/L時進(jìn)行輸注血小板，可能對機體TPO表達(dá)水平造成一定影響，后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大樣本量、多時間段監(jiān)測，并在患者輸注血小板前進(jìn)行采樣，盡量減少血小板輸注對機體TPO表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步驗證兩組患者化療后TPO表達(dá)水平的差異。

3.4 IFN-γ表達(dá)水平的改變

IFN-γ是造血的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子。IFN-γ的上調(diào)被認(rèn)為是骨髓造血祖細(xì)胞破壞的關(guān)鍵分子事件，在再生障礙性貧血及免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭中均發(fā)現(xiàn)了TNF-α與IFN-γ的上調(diào)［21］。IFN-γ對造血負(fù)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）在體外抑制造血祖細(xì)胞的增殖；（2）IFN-γ刺激骨髓中造血祖細(xì)胞Fas的表達(dá)，通過激活T細(xì)胞中Fas/FasL凋亡信號通路損傷造血祖細(xì)胞［22］。本研究結(jié)果顯示，兩組患者化療前后血清及骨髓IFN-γ表達(dá)水平在組間及組內(nèi)比較均未見明顯差異，提示在化療后骨髓抑制期間骨髓的恢復(fù)可能以造血生長因子升高促進(jìn)造血為主，而不是降低造血負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)水平。

4 小結(jié)

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低海拔AML患者化療后骨髓抑制恢復(fù)期間造血生長因子EPO、Flt3-L、TPO表達(dá)水平高于中海拔AML患者，造血抑制因子IFN-γ表達(dá)水平在兩組間無明顯差異，這可能是導(dǎo)致中海拔AML患者化療后骨髓抑制程度重、時間長的重要因素，由于本研究僅對于造血因子表達(dá)差異進(jìn)行了研究，并未深入研究不同海拔相對缺氧的環(huán)境特點如何調(diào)控差異造血因子的分泌，故今后將進(jìn)一步探索不同海拔對各差異造血因子的調(diào)控機制，為中海拔AML患者化療后骨髓抑制管理提供新思路。

致謝：感謝中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院血液科為本研究提供協(xié)助與支持。

作者貢獻(xiàn)：孫琦提出主要研究目標(biāo)，負(fù)責(zé)研究的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施，撰寫論文；孫琦、周厚法、王愛博進(jìn)行標(biāo)本的采集，數(shù)據(jù)的收集與整理，統(tǒng)計學(xué)處理，表的繪制與展示；李文倩、解友邦進(jìn)行論文的修訂；李文倩負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制與審查，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。