攜帶不同耐藥基因?qū)δ吞记嗝瓜╊惙窝卓死撞m應(yīng)性及毒力的影響*

瞿巧莉 李霄 王鵬飛 胡瑩 單斌 毛俊 陳如才

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,云南 昆明 650101;2.云南大學(xué)省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650032;3.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650101;4.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,云南 昆明 650001)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是自然界中常見的革蘭氏陰性腸桿菌,主要分布于人體內(nèi)胃腸道和鼻咽部的正常寄居菌群[1]。當(dāng)其生態(tài)位發(fā)生改變或者人體免疫力降低時(shí),可引起肺炎、下尿路感染、菌血癥等嚴(yán)重的感染性疾病,是社區(qū)和院內(nèi)感染最常見的機(jī)會(huì)致病菌之一[2];尤其對(duì)于ICU患者、有手術(shù)治療史及接受氣管插管等創(chuàng)傷性操作史的患者,肺炎克雷伯菌感染將帶來致命性的后果[3]。然而,隨著抗生素的不合理使用,肺炎克雷伯菌對(duì)多種抗生素的耐藥性正逐年增加,2017年曾倩倩等[4]的回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn),肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢吡肟、阿米卡星、頭霉素等各類常用抗生素的耐藥率也呈不同程度上升,使得碳青霉烯類抗生素成為了對(duì)抗肺炎克雷伯菌的最后一道防線[5]。然而,近十年來耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的檢出率呈逐年上升趨勢(shì)[6]。這將給臨床感染的治療及控制帶來巨大的挑戰(zhàn)。有研究報(bào)導(dǎo),我國目前流行的CRKP主要為CG258(Clonal group)克隆的ST11型菌株,占我國CRKP的60%[7]。CRKP的耐藥性主要通過菌體產(chǎn)生碳青霉烯酶水解抗生素所賦予,碳青霉烯酶基因通常由CRKP的大型耐藥質(zhì)粒攜帶,常見的類型包括blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM及blaIMP等[8-9]。Bedhomme等[10]研究表明大型耐藥質(zhì)粒的攜帶會(huì)帶來差異適應(yīng)性。由于質(zhì)粒的運(yùn)輸成本,所以會(huì)造成宿主菌適應(yīng)性的降低,除此之外適應(yīng)性還與攜帶耐藥基因的質(zhì)?？截悢?shù)相關(guān)。Newbury等[11]研究也證實(shí)了細(xì)菌長(zhǎng)期暴露于抗生素環(huán)境中可能會(huì)增加質(zhì)粒-宿主之間的連接性,其所攜帶的多個(gè)質(zhì)粒之間會(huì)存在互利或拮抗的相互作用。雖然攜帶耐藥基因的大型質(zhì)粒能為宿主菌帶來抗生素耐藥性,但如此大型的質(zhì)粒對(duì)宿主菌更廣泛的適應(yīng)性效應(yīng)及毒力影響尚不明確[12]。本研究主要通過探究攜帶不同耐藥基因的質(zhì)粒以及攜帶單個(gè)或多個(gè)耐藥基因的質(zhì)粒對(duì)CRKP環(huán)境適應(yīng)性及毒力作用的影響,以期對(duì)臨床CRKP的感染控制與治療提供重要的理論依據(jù)和用藥指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細(xì)菌及線蟲:收集2011年～2015年昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院CRKP臨床分離株共10株。N2野生型秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans,C. elegans)、大腸桿菌E.coli OP50、肺炎克雷伯菌質(zhì)控菌株ATCC10031、肺炎克雷伯菌ATCC700603均購自American Type Culture Collection,ATCC(https://www.atcc.org/)。②培養(yǎng)基:NGM線蟲培養(yǎng)基配方(1L): NaCl 3 g,蛋白胨2.5 g,瓊脂17 g,膽固醇(5 mg/mL,無水乙醇配置,過濾除菌)1 mL,高壓滅菌后加入過濾除菌的1 M CaCl21 mL,1 M MgSO41 mL,1 M磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)10 mL倒入平板,過夜晾干后加適量E.coli OP50單克隆菌液制成NGM發(fā)育板上,加適量CRKP分離株的單克隆菌液制成NGM檢測(cè)板備用;LB液體及固體培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置[13-14]。③主要試劑及緩沖液:M9緩沖液(1 L):七水磷酸氫二鈉5.8 g,磷酸二氫鈉3.0 g,氯化鈉5.0 g,七水硫酸鎂0.25 g,添加ddH2O至1 L,高壓蒸汽滅菌備用;線蟲 Bleach裂解液(100 mL體系):5 M NaOH 10 mL,次氯酸鈉20 mL(5%有效氯含量),ddH2O 70 mL,4 ℃避光儲(chǔ)存?zhèn)溆?1 M磷酸鹽緩沖液(pH=6.0):KH2PO4117.3 g,K2HPO424.0 g,添加ddH2O 至1 L,高壓滅菌備用;線蟲凍存液 (1 L):NaCl 5.85 g,KH2PO46.80 g,甘油300 mL,1 M NaOH 5.60 mL,滅菌后加入0.3 mL無菌1M MgSO4備用。

1.2 細(xì)菌耐藥基因型鑒定 根據(jù)檢驗(yàn)科VITEK平臺(tái)的藥敏及菌種鑒定結(jié)果,收集昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院CRKP臨床分離株10株,根據(jù)《全國臨床檢驗(yàn)規(guī)程》對(duì)菌株進(jìn)行分離、純化、保菌備用。采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA,利用PCR技術(shù)對(duì)碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP,β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、blaLAP進(jìn)行擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,隨后對(duì)陽性條帶進(jìn)行測(cè)序、Blastn比對(duì)分析。肺炎克雷伯菌ATCC10031、ATCC700603作為對(duì)照菌株。見表1。

表1 各耐藥基因PCR引物

1.3 菌種鑒定及MLST分型 擴(kuò)增16S rRNA基因,sanger雙向測(cè)序后進(jìn)行Blastn比對(duì)分析,鑒定菌種;PCR擴(kuò)增七個(gè)管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB),sanger雙向測(cè)序后通過等位基因數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定其ST類型(http://bigsdb.web.pasteur.fr/)。

1.4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 分離純化后的菌株從-80 ℃取出,接種于5 mL未添加亞胺培南抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,200 rpm,37 ℃搖菌復(fù)蘇培養(yǎng)4 h。將復(fù)蘇后的細(xì)菌在無抗性LB平板上劃線過夜培養(yǎng),挑取單克隆菌落在5 mL無抗LB液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)8～12 h,待細(xì)菌進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后,用無菌PBS稀釋菌液至OD600=0.1(MCF=0.13～0.14),取稀釋后的菌液50 μL接種至加有5 mL LB液體培養(yǎng)基的濁度瓶中,加入亞胺培南抗生素,濃度分別為:0、2和8 mg/mL,200 rpm,37 ℃搖菌培養(yǎng)。測(cè)定濁度瓶初始MCF值,之后每隔30 min測(cè)定一次MCF值,連續(xù)測(cè)定24 h。每個(gè)分離株的各抗生素濃度組平行培養(yǎng)2瓶,整體實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制生長(zhǎng)曲線,采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 線蟲侵染實(shí)驗(yàn)

1.5.1 線蟲復(fù)蘇及同步化 取凍存的線蟲室溫融化,用10 mL M9緩沖液洗滌,靜置后棄上清液。將線蟲沉淀加入到含有E.coli OP50的NGM發(fā)育板上,20 ℃培養(yǎng)2～3 d,期間顯微鏡下觀察線蟲發(fā)育情況、密度及產(chǎn)卵情況,直到平板上有大量蟲卵或者線蟲體內(nèi)有大量蟲卵。用3 mL M9緩沖液將線蟲及蟲卵從平板上沖洗下來,得到的混懸液裝到15 mL離心管,離心棄上清。用5 mL M9緩沖液洗滌、離心、棄上清,盡量將細(xì)菌洗凈,剩余沉淀即為線蟲和蟲卵。加入2倍體積的線蟲裂解液,劇烈漩渦震蕩5 min直至液體變得清亮,離心棄上清。此時(shí)剩下的沉淀為蟲卵,加入10 mL M9緩沖液重懸蟲卵,離心棄上清,重復(fù)兩次,以去除殘余的線蟲裂解液。再加入1 mL M9緩沖液重懸蟲卵,吸取1～2 μL蟲卵液至載玻片上推開,在顯微鏡下觀察蟲卵數(shù)量及裂解效果,將重懸后的蟲卵傾斜放置于20 ℃培養(yǎng)箱孵化,16 h后得到同步化的線蟲幼蟲。將線蟲幼蟲加入NGM發(fā)育板中,20 ℃培養(yǎng)45～54 h得到同步化的線蟲成蟲。

1.5.2 線蟲侵染 在NGM培養(yǎng)基中加入0.2 mmol/L的氟尿苷(Floxuridine,FUDR)以抑制線蟲繁殖,倒板,取過夜培養(yǎng)的單克隆菌液用M9緩沖液稀釋25倍后鋪至無抗生素的NGM平板,配置成NGM檢測(cè)板,對(duì)照組采用肺炎克雷伯菌ATCC10031和ATCC700603菌株配置。將同步化的線蟲成蟲用M9緩沖液從發(fā)育板上洗脫下來,離心棄上清,加入適量M9緩沖液重懸,取適量重懸后的線蟲加到NGM檢測(cè)板及NGM對(duì)照板上,在體式解剖鏡下計(jì)數(shù)線蟲數(shù)量,控制每個(gè)平板線蟲數(shù)為(50±5)條,每個(gè)分離株做兩個(gè)平行檢測(cè)板,整體實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.5.3 繪制線蟲生存曲線 每天同一時(shí)間段在顯微鏡下觀察線蟲的存活情況,記錄每日死亡數(shù)量,線蟲死亡的判定標(biāo)準(zhǔn):蟲體僵直,腫脹破裂,輕輕敲打平板線蟲仍不能運(yùn)動(dòng)。利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制線蟲生存曲線,Log-rank檢驗(yàn)法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌耐藥基因型鑒定 10個(gè)分離株耐藥基因鑒定結(jié)果見圖1、表2。

圖1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因型電泳圖

表2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因型鑒定及MLST序列分型

2.2 細(xì)菌菌種鑒定及ST分型 通過對(duì)10個(gè)分離株進(jìn)行16S rRNA基因驗(yàn)證,對(duì)sanger測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blastn比對(duì),確認(rèn)10個(gè)分離株均為肺炎克雷伯菌;對(duì)七個(gè)管家基因PCR擴(kuò)增后測(cè)序,MLST等位基因比對(duì)后,得到5種ST類型,其中ST-11型和ST-290型各三株、ST-395型兩株、ST-340型和ST-437型各一株。見表2。

2.3 菌株生長(zhǎng)曲線 根據(jù)碳青霉烯類耐藥基因鑒定結(jié)果,對(duì)分離株進(jìn)行分組(表3),繪制生長(zhǎng)曲線。在沒有抗生素壓力下,各組菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致,在2～5 h處于指數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)菌生長(zhǎng)迅速;第5～24 h生長(zhǎng)曲線趨于穩(wěn)定,處于平臺(tái)期,體系MCF值趨于穩(wěn)定,各組生長(zhǎng)曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2A)。在2 mg/mL亞胺培南壓力下,對(duì)照組全程未見生長(zhǎng),所有分離株均在4 h后才開始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,6 h后進(jìn)入平臺(tái)期(圖2B),攜帶單個(gè)耐藥基因組中blaIMP組細(xì)菌總量最低,其次為blaKPC組;攜帶雙耐藥基因組中blaKPC+blaNDM組、blaIMP+blaOXA組細(xì)菌總量最高。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析發(fā)現(xiàn),除blaNDM組、blaOXA組與blaNDM+blaOXA組比較沒有差異,攜帶單個(gè)耐藥基因與攜帶雙耐藥基因?qū)?xì)菌的生長(zhǎng)適應(yīng)性和細(xì)菌總量有不同的影響,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖3)。在8 mg/mL亞胺培南壓力下,對(duì)照組全程未見生長(zhǎng),其余各組菌株表現(xiàn)出不同程度的適應(yīng)性差異(圖2C)。其中blaKPC組、blaKPC+blaNDM組最快進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期(4～6 h),其次為blaNDM組,blaOXA組在第14 h才開始生長(zhǎng),15～17 h處于對(duì)數(shù)期;blaKPC組在從16 h開始曲線出現(xiàn)下降趨勢(shì)進(jìn)入衰亡期。細(xì)菌總量以blaKPC+blaNDM組最高,blaIMP+blaOXA組最低。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析發(fā)現(xiàn),單耐藥基因組中blaNDM組和blaIMP組適應(yīng)性強(qiáng)于blaOXA組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);雙耐藥基因組中blaKPC+blaNDM組和blaNDM+blaOXA組分別比單耐藥基因組blaKPC和blaOXA生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖4。

圖2 不同抗生素濃度下各菌株的生長(zhǎng)曲線

圖3 2 mg/mL亞胺培南培養(yǎng)基中各組細(xì)菌總量的兩兩比較

圖4 8 mg/mL亞胺培南培養(yǎng)基中各組細(xì)菌總量的兩兩比較

表3 根據(jù)菌株攜帶的碳青霉烯類耐藥基因分組

2.4 線蟲生存曲線 在沒有抗生素存在的情況下,用攜帶不同耐藥基因的菌株感染線蟲后,繪制線蟲的生存曲線(圖5),采用Log-rank檢驗(yàn)法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,與對(duì)照組(中位生存時(shí)間為9 d)相比,blaKPC組、blaKPC+blaNDM組和blaIMP+blaOXA組的生存曲線右移,中位生存時(shí)間為10 d,菌株對(duì)線蟲的毒力作用減弱(P=0.009 2、0.022、0.001 7);blaIMP+blaNDM組生存曲線左移,中位生存時(shí)間為8 d,表明菌株對(duì)線蟲的毒力作用增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0064);其余各組中位生存時(shí)間為9 d,與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),菌株毒力未表現(xiàn)出增強(qiáng)或減弱。

圖5 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對(duì)線蟲毒力作用比較

3 討論

CRKP作為目前臨床耐碳青霉烯類腸桿菌科(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)感染的主要病原菌,是臨床感染的治療與控制面臨的重大挑戰(zhàn)[17]。本研究通過細(xì)菌生長(zhǎng)曲線及線蟲毒力模型,探究攜帶不同碳青霉烯類耐藥基因的CRKP菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和對(duì)線蟲毒力作用的影響,闡述不同碳青霉烯類耐藥基因的潛在風(fēng)險(xiǎn),補(bǔ)充我國CRKP的分子流行特征,為CRKP的爆發(fā)流行和感染控制提供理論依據(jù)。

本研究通過在不同濃度抗生素壓力下測(cè)試各菌株的生長(zhǎng)曲線來研究耐藥基因?qū)RKP適應(yīng)性的影響。結(jié)果顯示,攜帶有blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株,在沒有抗生素的情況下生長(zhǎng)速度與其他組沒有明顯差異;在抗生素存在的情況下,尤其是高濃度抗生素(8 mg/mL)下,生長(zhǎng)速度明顯高于其他組,說明攜帶blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株在抗生素環(huán)境中適應(yīng)性更強(qiáng),這或許是由于其對(duì)抗生素的耐受、水解能力增強(qiáng),將有助于其在抗性環(huán)境中增殖與傳播。而攜帶blaOXA的菌株,在高濃度抗生素存在的情況下,生長(zhǎng)明顯被抑制,這可能是由于其對(duì)亞胺培南的水解作用較弱所導(dǎo)致的。所以攜帶不同的耐藥基因會(huì)產(chǎn)生不同的適應(yīng)性效應(yīng),在菌株的生長(zhǎng)速度和細(xì)菌總量上體現(xiàn)出不同的效果。攜帶blaKPC和blaKPC+blaNDM的菌株在抗生素環(huán)境中表現(xiàn)出的較強(qiáng)種群生長(zhǎng)增殖能力,使得他們更為廣泛傳播,而攜帶其他耐藥基因的菌株在高濃度抗生素下生長(zhǎng)較弱,所以只是零星爆發(fā)。

本研究通過線蟲侵染模型探究不同碳青霉烯類耐藥基因?qū)甓玖Φ挠绊?。結(jié)果顯示,在沒有抗生素的情況,攜帶blaKPC、blaKPC+blaNDM和blaIMP+blaOXA耐藥基因的菌株感染線蟲后,線蟲中位生存時(shí)間較其他組有所延長(zhǎng),說明對(duì)線蟲的毒力作用相較于其他菌株更低,而D′Apolito[18]、McLaughlin[19]等的研究結(jié)果也表明攜帶blaKPC會(huì)使菌株毒力降低,本文研究結(jié)果與其一致。雖然毒力減弱或許更利于臨床感染的控制與治療,但是隨著近年來的高毒力耐藥株被報(bào)道,攜帶blaKPC的耐藥株的毒力作用也在逐漸增強(qiáng)[20],高毒力耐藥株的出現(xiàn)也將為臨床帶來新的挑戰(zhàn)。在感染blaNDM+blaIMP菌株后,線蟲中位生存時(shí)間有所縮短,說明其毒力作用增強(qiáng)了。攜帶blaNDM、blaIMP、blaOXA、blaNDM+blaOXA與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明菌株毒力并沒有表現(xiàn)出增強(qiáng)或者減低。G?ttig[21]和Liu等[22]研究結(jié)果表明攜帶blaNDM并不會(huì)增強(qiáng)菌株的毒力,Jia等[23]的研究結(jié)果表明其為低毒力菌株,本研究結(jié)果與其一致。而攜帶blaKPC的菌株毒力強(qiáng)于blaOXA菌株這一點(diǎn)在本研究中并沒有得到證實(shí),與Mil-Homens等[24]的研究結(jié)果有差異。

碳青霉烯類耐藥基因一般位于大型質(zhì)粒上,由于質(zhì)粒之間存在相互作用,所以攜帶單個(gè)耐藥質(zhì)粒與攜帶多個(gè)耐藥質(zhì)粒所帶來的適應(yīng)性和毒力作用不同[25]。在細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)試結(jié)果可以看出,攜帶多個(gè)耐藥質(zhì)粒最終對(duì)細(xì)菌適應(yīng)性的影響似乎有加乘效應(yīng)。在抗生素存在時(shí),單獨(dú)攜帶blaKPC或blaNDM的菌株生長(zhǎng)適應(yīng)性都較強(qiáng),同時(shí)攜帶blaKPC和blaNDM的菌株表現(xiàn)出了強(qiáng)于單獨(dú)攜帶時(shí)的適應(yīng)性。而且在blaIMP和blaOXA組也能觀察到相似的效應(yīng):同時(shí)攜帶blaIMP和blaOXA的菌株比單獨(dú)攜帶blaIMP或blaOXA的菌株表現(xiàn)出了更強(qiáng)的適應(yīng)性,生長(zhǎng)速度和細(xì)菌總量明顯高于單獨(dú)攜帶的菌株。但是在線蟲毒力模型中,攜帶雙抗性質(zhì)粒的菌株,毒力作用的改變并不是兩個(gè)耐藥質(zhì)粒毒力作用的簡(jiǎn)單加乘或拮抗效果,由于本研究涉及樣本量較小,雙耐藥質(zhì)粒對(duì)毒力作用的影響規(guī)律和作用機(jī)制還需要更進(jìn)一步研究。

值得注意的是,結(jié)合耐藥基因與ST分型數(shù)據(jù),本研究發(fā)現(xiàn)在本研究中所有ST11型菌株都恰好攜帶了blaKPC抗性基因。攜帶blaKPC基因所帶來的低毒力效應(yīng)及高濃度抗生素壓力下的強(qiáng)適應(yīng)性、強(qiáng)增殖能力,可能正是導(dǎo)致ST11型菌株成為我國CRKP的主要流行克隆株。

適合度代價(jià)是指在沒有選擇壓力的情況下,攜帶耐藥質(zhì)粒的菌株相較于沒有該質(zhì)粒的菌株表現(xiàn)出來的生長(zhǎng)緩慢、競(jìng)爭(zhēng)力減弱和(或)毒力減低等現(xiàn)象[26]。本研究發(fā)現(xiàn)無抗生素時(shí),blaKPC組和blaKPC+blaNDM組菌株對(duì)線蟲的毒力作用有所降低,說明這兩組菌株可能存在一定的適合度代價(jià)。這可能是由于獲得耐藥質(zhì)粒為宿主菌帶來了額外的DNA復(fù)制負(fù)擔(dān),從而對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的復(fù)制速率產(chǎn)生了負(fù)面影響[27],生長(zhǎng)增殖速度降低;菌株在提高環(huán)境適應(yīng)性的同時(shí),通過降低自身毒力,以減輕宿主菌的代謝負(fù)擔(dān),利于菌株的增殖與傳播。在選擇壓力存在的條件下,攜帶有耐藥質(zhì)粒的菌株優(yōu)勢(shì)就得以彰顯,將會(huì)表現(xiàn)出更高的環(huán)境適應(yīng)性和更強(qiáng)的抗生素耐受能力。本研究中這兩組菌株在抗生素存在時(shí)顯示出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),也印證了適應(yīng)性代價(jià)的存在。Li等[28]研究也證實(shí)了blaKPC基因的表達(dá)會(huì)帶來適應(yīng)性代價(jià),對(duì)菌株產(chǎn)生負(fù)面影響。對(duì)于blaKPC+blaNDM雙抗性菌株,臨床報(bào)道并不多,在Gao等[29]研究中,利用大腸桿菌EC600作為受體菌,獲得的雙抗性轉(zhuǎn)化株并不存在適應(yīng)性代價(jià),與本研究所采用雙抗性原始分離株進(jìn)行測(cè)試的結(jié)果不符,這可能是因?yàn)槟退庂|(zhì)粒存在宿主菌依賴性。Di等[30]研究表明blaKPC在CRKP和在E.Coli中的適應(yīng)度成本不一樣,說明質(zhì)粒-宿主菌的相互作用是特異性的,不同遺傳背景的宿主菌基因表達(dá)會(huì)影響質(zhì)?；虻谋磉_(dá),這或許可以解釋為什么本研究中blaKPC+blaNDM雙抗性菌株存在適應(yīng)性代價(jià),而Gao等[29]的研究中卻有不一樣的結(jié)果。

4 結(jié)論

攜帶不同的碳青霉烯類耐藥基因會(huì)對(duì)CRKP菌群產(chǎn)生不同的適應(yīng)性影響和毒力作用。了解臨床分離株的耐藥基因攜帶情況及既往抗生素使用史,有助于了解菌群的生長(zhǎng)增殖狀態(tài)和毒力情況,從而更有針對(duì)性的選擇抗生素,并在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)上調(diào)整抗生素用量,更好的控制感染。