景清荷 孔虹雨 綜述 趙晨 審校

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科,上海 200031

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是全球老年人口視力喪失的主要原因[1-2]。隨著世界人口老齡化的加劇,到2040年,全球將有2.88億人受AMD影響[3]。AMD的特征表現為光感受器、視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)、Bruch膜及脈絡膜毛細血管復合體的功能退化。RPE細胞的退化引起光感受器不可逆的功能障礙,最終導致視力喪失[4]。AMD主要分為干性(非滲出性)和濕性(滲出性)2種類型,其中干性AMD主要表現為地圖樣萎縮(geographic atrophy,GA),約占AMD患者的90%[5]。AMD早期階段表現為RPE色素沉著的變化,溶酶體脂褐素和細胞外黃色核仁沉積物的積累標志著AMD的進展[2-3]。在晚期階段,干性AMD的特征是RPE細胞和光感受器細胞缺失,引起外層視網膜萎縮性病變,在黃斑區(qū)形成GA[2,6];濕性AMD的特征是脈絡膜毛細血管發(fā)出新生血管,穿過Bruch膜至視網膜下間隙或視網膜層間,在黃斑區(qū)形成脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)[7]。在不同類型的AMD中,導致黃斑變性致病事件的順序可能有所不同[4]。在干性AMD中,最初的損傷可能源于受損的蛋白沉積,導致脂褐素及核仁形成以及炎癥增加;隨著病情的進展,干性AMD可能會轉變?yōu)闈裥訟MD,這與脈絡膜血管的喪失、缺氧以及隨后的CNV的形成密切相關[8]。在AMD疾病中,光感受器、RPE、Bruch膜以及脈絡膜毛細血管均表現出異常。然而,RPE細胞的功能損害是導致臨床相關AMD變化的早期關鍵事件[9]。

程序性細胞死亡在應激反應、體內平衡調節(jié)和疾病中起著重要作用[10]。除了經典的凋亡之外,最近有研究[11-13]發(fā)現了新的細胞死亡形式,如焦亡、壞死性凋亡和鐵死亡,它們均可能參與AMD中RPE細胞的程序性死亡。對程序性細胞死亡通路的研究可能會為AMD的治療提供新的治療靶點。

1 凋亡

1.1 凋亡機制

凋亡是1972年由Kerr等[14]首次描述的在一系列內源性基因的調控下發(fā)生的自然或生理性細胞死亡的過程。凋亡可以表現為細胞質濃縮、染色質凝固、細胞核破裂,繼而形成凋亡小體。根據細胞類型和所遭遇的損傷不同,凋亡可被2條不同的通路激活,外在通路的激活主要依賴細胞膜受體途徑,而內在固有性通路激活則主要通過線粒體途徑,這2條通路都可以激活半胱天冬酶(Caspase)級聯反應[15]。外在凋亡途徑始于細胞膜死亡受體和配體的激活,主要包括FasL/FasR、TNFα/TNFR1和TNFR2,這些受體激活后可形成三聚體形式,繼而招募腫瘤壞死因子受體1相關死亡結構域(TNF-receptor 1-assocaited death domain protein,TRADD)蛋白和Fas相關死亡結構域(Fas associated death domain,FADD)蛋白,進而引起死亡誘導信號復合體(death inducing signaling complex,DISC)形成。在DISC中,FADD蛋白招募Caspase-8和Caspase-10,激活下游效應分子Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7,引起底物分解和凋亡細胞死亡[16]。另外,Caspase-8介導的底物分解可通過激活內源性凋亡途徑而放大死亡受體引起細胞程序性死亡[17-18]。生長因子缺乏、DNA損傷、紫外線、過高的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、病毒感染等均可激活內在固有凋亡通路。內在固有凋亡通路的激活則是由于位于線粒體外膜的促凋亡分子Bcl-2蛋白家族中亞型Bax蛋白的激活引起線粒體膜上通透性轉換孔開放,釋放細胞色素C進入細胞質,細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1結合形成凋亡小體,凋亡小體進一步招募和激活Caspase-9,引發(fā)隨后的效應Caspase激活[16,19-22]。

1.2 RPE細胞與凋亡

臨床研究和基礎實驗研究均已證實RPE細胞凋亡參與了AMD。Kaneko等[23]研究發(fā)現,相比于未患有GA的尸眼,患有GA的尸眼RPE中存在DNA片段化和Caspase-3被激活,說明GA患者的RPE細胞中存在凋亡通路激活。Sharma等[24]發(fā)現4-羥基壬烯酸作用于培養(yǎng)的RPE細胞和APRE-19細胞后可使p53發(fā)生磷酸化,進一步激活內在固有凋亡通路使Bax、p21、JNK和Caspase-3被激活,使RPE細胞發(fā)生凋亡。從小鼠眼部分離出的原代RPE細胞暴露于H2O2后,RPE細胞線粒體跨膜電位被破壞,細胞色素C被釋放,最終表現為TUNEL染色陽性,說明RPE細胞發(fā)生凋亡[25]。

2 焦亡

2.1 焦亡機制

焦亡是于2001年發(fā)現的炎癥相關性細胞死亡途徑,形態(tài)學上可表現為細胞腫脹、質膜出泡、破裂,孔隙和焦亡小體形成[26-27]。根據信號通路不同,焦亡可分為經典途徑和非經典途徑。經典途徑依賴于Caspase-1的激活。當細胞受到病毒、細菌等信號的刺激時,Caspase-1前體與模式識別受體核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族含吡啶結構域1[nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor family,pyrindomain containing 1,NLRP1]、NLRP3等通過接頭蛋白ACS形成一個高分子蛋白復合物,即炎癥小體,激活Caspase-1[28-29]?；罨腃aspase-1一方面剪切Gasdermin D形成一個包含氮末端活性域的Gasdermin D(GSDMD-N)氨基多肽,它可以與細胞膜內側的脂質層作用形成10～20 nm的小孔,使得細胞破裂,細胞內容物釋放,引起炎癥反應[30];活化的Caspase-1還可以剪切白細胞介素(interleukin,IL)-18和IL-1β的前體,形成活化的IL-18、IL-1β,釋放到細胞外,招募炎癥細胞,擴大炎癥反應[31]。當細胞受到外界壓力信號刺激時,依賴于Caspase-4/5/11的非經典焦亡途徑被激活,活化的Caspase-4/5/11亦可剪切Gasdermin D形成包含GSDMD-N的氨基多態(tài),釋放炎癥因子,引起細胞焦亡[27,32]。

2.2 RPE細胞與焦亡

研究發(fā)現焦亡也參與了AMD中RPE細胞的死亡。Tseng等[33]用免疫組織化學的方法檢測發(fā)現患有GA和CNV患者的眼部切片病變部位NLRP3炎性小體呈陽性。大鼠玻璃體腔注射淀粉樣蛋白β后發(fā)現RPE-脈絡膜組織中存在剪切的Caspase-3和Gasdermin D,但是形態(tài)學上卻未出現明顯的視網膜變薄和RPE丟失[34]。Yang等[11]用淀粉樣蛋白β1-40低聚物誘導RPE-19細胞,發(fā)現細胞活性降低,IL-1β、IL-18表達增加,并發(fā)生焦亡。用藍光照射RPE-19和原代人RPE細胞后,誘發(fā)氧化應激,顯著降低細胞活力,并引發(fā)焦亡;而NLRP3炎性小體促進的IL-1β釋放又能反饋抑制Caspase-1表達,從而減少細胞焦亡[35]。

3 壞死性凋亡

3.1 壞死性凋亡機制

壞死性凋亡是2005年發(fā)現的一種新的程序性細胞壞死,是一種被動的細胞死亡形式,主要形態(tài)學變化表現為細胞腫脹,細胞質空泡形成,內質網腫脹,線粒體凝結、腫脹或破裂,染色體分解,細胞器膜破壞,溶酶體腫脹和破裂,最終導致細胞膜的破裂[16,36]。

壞死性凋亡不依賴于Caspase的激活,它是基于壞死體形成的一種死亡形式。受體相互作用蛋白家族(receptor interacting proteins,RIP)中的RIP1、RIP3和激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)是與壞死性凋亡相關的主要分子[37]。RIP1和RIP3同屬RIP激酶家族,由于二者之間結構域的差異,它們在壞死性凋亡的過程中發(fā)揮著不同的作用[38]。細胞凋亡與壞死性凋亡具有相同的受體,如TNF受體,它可以通過募集Caspase-8而導致外源性凋亡[39]。RIP1可與TNFR1及TNFR1死亡相關蛋白結合形成復合體Ⅰ;當去泛素化的RIP1離開復合體Ⅰ轉而與FADD和Caspase-8前體結合形成復合體Ⅱ。由于RIP3和MLKL的激活,Caspase-8的活性被抑制時,細胞可由凋亡轉變?yōu)閴乃佬缘蛲鯷40-43]。壞死性凋亡過程中,RIP3中的Ser227被磷酸化,該磷酸化是激活MLKL的必要條件,也是RIP1和RIP3下游的效應蛋白。MLKL作為壞死性凋亡的執(zhí)行者,可誘導質膜滲透直接形成孔并導致Ca2+或Na+的流入,釋放致細胞損傷的相關模式分子,如線粒體DNA、高遷移率族蛋白B、IL-33、IL-1α和三磷酸腺苷[10],誘發(fā)壞死性凋亡。

3.2 RPE細胞與壞死性凋亡

隨著對壞死性凋亡分子機制認識的逐漸完善,越來越多的研究聚焦到了視網膜疾病。Pan等[44]研究發(fā)現干性AMD患者RPE中存在p-MLKL的表達,為我們提供了老年AMD患者視網膜中壞死性凋亡被激活的有力證據,并經實驗證實視網膜脂褐素是依賴于溶酶體的不穩(wěn)定而觸發(fā)了一種非典型的壞死性凋亡的級聯反應。在AMD中,RPE細胞的丟失和功能障礙是導致疾病發(fā)生的首要因素。雙鏈RNA等產物的增加被認為是促進炎癥的重要因素[23]。研究表明,在雙鏈RNA誘導的視網膜退化動物模型中,RPE主要表現為胞質膜和核膜廣泛腫脹破裂的壞死性凋亡樣死亡形態(tài),而非細胞核濃縮和細胞固縮等凋亡樣死亡形態(tài),且與野生型相比,RIP3敲除模型的RPE壞死性凋亡率顯著降低[45]。提示壞死性凋亡可能是參與AMD病程中RPE細胞死亡的一種重要形式。上述研究均提示壞死性凋亡在AMD的RPE細胞死亡過程中扮演重要角色,與以往研究中認為凋亡起主導作用的觀點不同。另有研究探索壞死性凋亡與AMD的發(fā)病機制氧化應激的聯系,在碘酸鈉誘導的AMD體外模型中證實了壞死性凋亡的作用。當ARPE-19細胞暴露于碘酸鈉時,靶向RIP1和RIP3激酶的抑制劑可顯著提高細胞存活率[12],此項少有的黃斑變性體外模型中出現的壞死性凋亡的研究,也進一步提示了其在RPE細胞死亡過程中可能發(fā)揮的不容忽視的作用。

4 鐵死亡

4.1 鐵死亡機制

鐵死亡是2012年由Dixon等[43]發(fā)現并描述的一種鐵依賴的非凋亡途徑的程序性死亡形式。它起始于鐵積累和鐵超載,由于細胞內谷胱甘肽(glutathione,GSH)依賴性的抗氧化系統(tǒng)能力減弱,過量鐵引起ROS升高,接著通過芬頓反應(Fenton reaction)產生脂質自由基,進一步引起細胞膜的破壞,發(fā)生鐵死亡[10,46-47]。與正常的細胞相比,發(fā)生鐵死亡的細胞形態(tài)可表現為:線粒體體積縮小、線粒體膜密度增大、線粒體嵴減少、消失,甚至發(fā)生線粒體外膜破裂[10,48]。

鐵是一種生物基本元素,參與多種生命過程。但是,過量鐵積累會產生毒性反應,參與細胞內的氧化應激過程:(1)鐵超載可引起RNA短散在核元件的轉錄增加,其中包括Alu RNA、B1 RNA和B2 RNA[49]。雷恩宇等[50]的研究顯示H2O2應激的肺泡Ⅱ型上皮細胞A549可產生大量的Alu RNA,其過表達可顯著促進A549細胞中活性氧的產生。(2)Fe2+具有不穩(wěn)定性和高反應活性,其可通過芬頓反應催化H2O2產生羥自由基,可直接與細胞膜、質膜中的多不飽和脂肪酸反應,產生大量脂質ROS,這些具有極強氧化損傷作用的自由基進一步引起細胞膜的破壞,促使細胞鐵死亡[47-48,51]。生理條件下,細胞內的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài),當GSH依賴性的抗氧化系統(tǒng)能力減弱時,易發(fā)生鐵死亡。GSH是RPE細胞中最有效的抗氧化劑,在視網膜和RPE中含量較高,是谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的一個必要輔因子,GPX4可將還原型GSH轉化為氧化型GSH(oxidized glutathione,GSSH),同時將脂質過氧化物還原為正常的脂質,防止脂質過氧化物的集聚,從而減輕氧化應激損傷,抑制鐵死亡的發(fā)生[52-55]。

4.2 RPE細胞與鐵死亡

研究顯示,隨著年齡增長,人和大鼠視網膜中的鐵含量逐漸增多[56]。AMD患者黃斑處的RPE和Bruch膜中的鐵含量也明顯高于相同年齡組正常人黃斑處的鐵含量[57]。而干性AMD患者前房水中的鐵含量更是對照組的2倍以上[58]。這些證據側面說明鐵超載可能參與了AMD的發(fā)病過程。AMD的細胞模型可由多種物質進行誘導,如H2O2、叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,tBH)、碘酸鈉和外源性添加N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanolamine,A2E)后藍光照射等。鐵死亡參與或主導了不同物質誘導的RPE細胞的死亡。Totsuka等[13]研究發(fā)現鐵死亡抑制劑ferrostatin-1和去鐵胺(deferoxamine,DFO)與凋亡和壞死性凋亡抑制劑相比,能顯著逆轉tBH誘導的ARPE-19細胞產生的鐵離子積累、脂質過氧化物生成和GSH耗竭等鐵死亡相關表現,抑制鐵死亡的發(fā)生。Scimone等[59]對添加外源性A2E后再進行藍光照射的ARPE-19細胞進行轉錄組測序發(fā)現鐵死亡參與了RPE細胞的變性。Liu等[60]用碘酸鈉作用于ARPE-19細胞后發(fā)現RPE細胞呈現出鐵死亡相關改變,并且這些改變可被Ferrostatin-1和DFO抑制。Tang等[61]進一步對碘酸鈉作用的ARPE-19細胞進行高通量測序,研究發(fā)現ARPE-19細胞出現鐵死亡,并可通過血紅素氧合酶1特異性抑制劑鋅原卟啉9阻止RPE細胞的鐵死亡,為干性AMD的治療提供了一個潛在的新靶點。

5 程序性死亡間的關系

各種細胞死亡通路間可能存在交互或協同作用,可能被同時激活也可能通過相同的通路共同作用引起細胞的死亡。如Xu等[62]在七氟醚誘導的海馬神經元毒性模型中發(fā)現,細胞凋亡和壞死性凋亡通路均被激活,如果細胞凋亡被抑制,則壞死性凋亡可能作為替代的細胞死亡途徑;Gao等[63]研究發(fā)現,當RPE細胞暴露于可以激活炎性細胞死亡的蛋白復合體NLRP3炎性小體時,凋亡和焦亡通路均可被激活;Müller等[64]研究發(fā)現,當細胞鐵死亡通路被抑制后細胞的壞死性凋亡通路異?；钴S,反之亦然,這一發(fā)現說明細胞的鐵死亡和壞死性凋亡是可以互相替代的。雖然細胞凋亡、焦亡、壞死性凋亡和鐵死亡的死亡通路不同,但是結局均是引起細胞死亡。細胞凋亡、壞死后均可釋放DNA、RNA至細胞外,DNA和RNA均可通過觸發(fā)Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)誘導細胞因子如干擾素(interferon,IFN)-α的產生:根據與免疫細胞作用的結構和模式不同,雙鏈RNA可激活TLR3,單鏈RNA可激活TLR7,而DNA可激活TLR9[65]。細胞死亡釋放的DNA亦可通過激活固有的DNA識別受體cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)將ATP和GTP轉化為環(huán)狀二核苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP),cGAMP與內質網上的STING(stimulator of IFN genes)結合,進一步活化TBK1-IKKε介導的下游通路以產生Ⅰ型IFN[66]。Li等[67]研究發(fā)現,心臟移植后鐵死亡可通過TLR4/Trif/Ⅰ型IFN通路促進中性粒細胞黏附到冠脈血管內皮細胞中,進而引起梗死形成,導致心臟損傷。已有文獻證實,干性AMD drusen的成分如淀粉樣蛋白和糖基化終產物可以激活IFN-γ通路,而IFN-γ可協同其他前炎癥因子一起激活炎癥活性成分,直接引起光感受器的損傷,最終可能導致視力喪失[68]。目前對于AMD病程中RPE細胞死亡的具體形式、單一或是交互作用及其具體機制仍不清楚,需要進一步研究。那么,RPE細胞的凋亡、焦亡、壞死性凋亡和鐵死亡之間具體的交互作用以及是否可以通過激活共同的通路,例如IFN通路,引起炎癥損傷而促進AMD的發(fā)生發(fā)展可能會是一種新的研究思路。

6 展望

AMD的發(fā)病機制研究一直是眼科研究的熱點和難點,凋亡、焦亡、壞死性凋亡和鐵死亡是復雜的細胞死亡方式。雖然已有研究發(fā)現這4種死亡通路在AMD的RPE細胞死亡中發(fā)揮重要作用,但是就目前的研究成果來看,關于凋亡、焦亡、壞死性凋亡和鐵死亡在RPE細胞死亡中發(fā)揮的確切作用和機制尚缺乏更有力的臨床和實驗研究支持。另外,各死亡方式間是否存在潛在的相關性及是否可通過共同通路促進AMD的發(fā)生發(fā)展也有待深入研究。相信隨著國內外關于凋亡、焦亡、壞死性凋亡、鐵死亡與AMD的基礎與臨床研究的不斷深入,可以為AMD的防治提供新思路。

利益沖突所有患者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻說明景清荷:本文的主要撰寫者,負責凋亡、焦亡、鐵死亡和程序性死亡間的相互關系的綜述及全文的整理;孔虹雨:負責壞死性凋亡部分的綜述;趙晨:對文章進行審閱和提出指導性修改意見