新型大黃酸丹皮酚偶聯(lián)物的合成及抗炎活性

劉成波,何 冰,譚鴻舟,吳 虹,何黎琴*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥 230038; 2.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,安徽 六安 237000)

骨關(guān)節(jié)炎(Ostoarthritis,OA)是世界范圍內(nèi)常發(fā)于中老年人群體的一種慢性、退行性疾病[1]。近幾十年來OA發(fā)病率以及致殘率在全球范圍內(nèi)穩(wěn)步增長,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,也增加了家庭經(jīng)濟負擔(dān)[2]。目前治療骨關(guān)節(jié)炎的常用藥物是非甾體抗炎藥,但由于長期用藥對胃腸道的不良反應(yīng)較多,降低患者的依從性。因此,尋找高效及副作用小的新型抗骨關(guān)節(jié)炎藥物具有重要的現(xiàn)實意義。

大黃酸是傳統(tǒng)中藥大黃的主要活性成分,具有廣泛的藥理活性,如抗菌、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用[3-6]。研究發(fā)現(xiàn),大黃酸能有效降低受損軟骨細胞和滑膜細胞中TNF-α,IL-1β和IL-6的mRNA水平,可通過抑制炎性因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[7-11]。大黃酸溶解性能較差,生物利用度低,這一缺陷嚴(yán)重影響其在臨床上的應(yīng)用。臨床實踐發(fā)現(xiàn),通過對大黃酸的結(jié)構(gòu)修飾,可以獲得臨床應(yīng)用的藥物。比如用于治療骨關(guān)節(jié)炎的雙醋瑞因就是大黃酸羥基的雙乙?；a(chǎn)物,通過對其羥基修飾,可以達到減輕腹瀉的副作用。受此鼓舞,激發(fā)了眾多藥物研究者從事大黃酸的結(jié)構(gòu)修飾工作,并取得了豐碩的研究成果。

丹皮酚是中藥牡丹皮中的主要有效單體成分,具有抗炎、抗血小板聚集等多種生物活性[12]。臨床上丹皮酚主要用于鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱和抑制變態(tài)反應(yīng)等方面的治療。研究表明,對丹皮酚進行結(jié)構(gòu)修飾和改造可以得到抗炎活性增強的丹皮酚衍生物[13]。課題組前期也著手丹皮酚的結(jié)構(gòu)修飾和改造,得到了多個在抗血小板聚集活性方面具有研發(fā)前景的丹皮酚衍生物[14-16]?；诖?考慮到大黃酸和丹皮酚(1)均具有良好的抗炎作用,加上大黃酸具備與骨組織中羥基磷灰石結(jié)合的條件,具有骨親和性[17],本研究利用藥物化學(xué)的拼合原理,將大黃酸的2-位羧基和丹皮酚的2-位羥基通過不同鏈長的連接臂偶聯(lián),設(shè)計合成了5個目標(biāo)化合物3a～3e(圖1);采用脂多糖刺激巨噬細胞(RAW264.7)構(gòu)建細胞炎癥模型,RT-qPCR檢測炎性因子TNF-α,IL-1β和IL-6的mRNA表達,對目標(biāo)化合物進行體外抗炎活性初步評價,期望得到的目標(biāo)化合物能夠發(fā)揮骨親和性和協(xié)同抗炎作用,為獲得療效良好、不良反應(yīng)少的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物打下基礎(chǔ)。

圖1 目標(biāo)化合物3a～3e的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVⅢ 600MHz型核磁共振儀;Mel-TEMP Ⅱ型數(shù)字熔點儀(上海索光光電技術(shù)有限公司);Dinnigan LCQ Advantage MAX型液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀;ZF-7型暗箱線分析三用紫外儀;CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司);LightCycler 480 Ⅱ型全自動熒光定量PCR儀(美國Roche公司)。

丹皮酚,大黃酸(98%,西安小草植物科技有限公司);二溴烷烴,N-N二甲基甲酰胺(DMF),K2CO3(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);脂多糖(LPS;美國Sigma-Aldrich公司);DMEM(南京維森特公司);胎牛血清(FBS;美國GIBCO公司);TRIzol試劑(蘇州新賽美公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Master Mix試劑(上海翊圣生物科技有限公司)。其他所用試劑均為分析純。小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 合成

(1) 化合物2的合成

以化合物1為原料,通過Williamson合成法在堿性條件下利用2-位羥基與二溴烷烴Br(CH2)nBr進行反應(yīng),得到中間體丹皮酚溴代烷基醚(2)。將265 mg(1.0 mmol)化合物1,120 mg(3.0 mmol) NaOH,10 mL DMF置于50 mL圓底燒瓶內(nèi),35 ℃下攪拌20 min,再加入相應(yīng)的二溴烷烴(6.0 mmoL),繼續(xù)攪拌反應(yīng),TLC檢測跟蹤反應(yīng)結(jié)束后,抽濾反應(yīng)液,將濾液倒入100 mL水中,加入二氯甲烷萃取(3×50 mL)。有機相經(jīng)飽和食鹽水洗滌、適量無水硫酸鈉干燥后濃縮,柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚=1∶4,V∶V)得2a:白色固體212 mg,產(chǎn)率78.2%;2b:白色固體216 mg,產(chǎn)率79.3%;2c:白色固體224 mg,產(chǎn)率為82.4;2d:白色固體219 mg,產(chǎn)率為80.5%;2e:白色固體223 mg,產(chǎn)率為82.1%。

(2) 化合物3的合成

化合物2與大黃酸羧基進行親核取代反應(yīng)得到化合物3。向50 mL圓底燒瓶中加入426 mg(1.5 mmol)大黃酸,276 mg(2.0 mmol)碳酸鉀,10 mL DMF在60 ℃下攪拌反應(yīng)30 min后,滴加相應(yīng)的中間體丹皮酚溴代烷基醚(1.0 mmoL),繼續(xù)60 ℃攪拌反應(yīng),TLC檢測跟蹤反應(yīng)結(jié)束后,抽濾,二氯甲烷洗滌濾餅,濾液加100 mL水稀釋,二氯甲烷萃取(3×50 mL)。有機相經(jīng)飽和食鹽水洗滌、適量無水硫酸鈉干燥后濃縮,經(jīng)柱層析分離(乙酸乙酯∶石油醚=1∶3,V∶V)得黃色固體3a～3e。

3a:黃色固體,220 mg,產(chǎn)率46.3%,m.p.136.2～137.5 ℃;1H NMR(CDCl3,600 MHz),δ:12.03(s,1H),11.95(s,1H),8.43(s,1H),7.94(s,1H),7.86(d,2H,J=8.2 Hz),7.73(t,1H,J=7.7 Hz),7.34(d,1H,J=8.4 Hz),7.26(s,1H),6.57(d,1H,J=8.7 Hz),6.48(s,1H),4.82(t,2H,J=7.2 Hz),4.43(t,2H,J=7.1 Hz),3.86(s,3H),2.60(s,3H);13C NMR(151 MHz,Chloroform-d)δ:164.43,162.42,137.77,133.47,132.88,130.82,128.81,125.30,124.90,120.40,120.12,105.88,99.16,68.16,66.13,55.55,31.86; HR-MS(ESI-TOF),m/z:Calcd for C26H20O9{[M+H]+} 476.1171,found 476.1154。

3b:黃色固體,223 mg,產(chǎn)率47.8%,m.p.138.2～139.5 ℃;1H NMR(600 MHz,CDCl3),δ:11.94(s,1H),8.39(d,1H,J=1.7 Hz),7.92(d,1H,J=1.7 Hz),7.86(d,1H,J=7.5 Hz),7.83(d,1H,J=8.8 Hz),7.72(t,1H,J=7.9 Hz),7.33(d,1H,J=8.4 Hz),7.25(s,1H),6.52(d,1H,J=2.3 Hz),6.46(d,1H,J=2.3 Hz),4.62(t,2H,J=6.3 Hz),4.22(t,2H,J=6.1 Hz),3.84(s,3H),2.60(s,3H),2.43～2.35(m,2H);13C NMR(151 MHz,Chloroform-d)δ:197.33,192.76,180.79,164.41,164.29,162.80,162.38,160.20,137.90,137.70,133.92,133.48,132.69,125.19,124.84,121.31,120.32,120.06,118.25,115.82,105.22,98.95,67.81,65.47,55.44,31.88,25.61;HR-MS(ESI-TOF),m/z:Calcd for C27H22O9{[M+H]+} 490.1337,found 490.1348。

3c:黃色固體,258 mg,產(chǎn)率51.3%,m.p.140.5～141.6 ℃,1H NMR(CDCl3,600 MHz),δ:11.99(s,1H),11.93(s,1H),8.37(d,1H,J=1.6 Hz),7.89(d,1H,J=1.7 Hz),7.86～7.82(m,1H),7.80(d,1H,J=8.7 Hz),7.71(d,1H,J=8.0 Hz),7.32(d,1H,J=8.5 Hz),6.48(d,1H,J= 2.3 Hz),6.41(d,1H,J=2.3 Hz),4.47(m,2H),4.12(m,2H),3.81(s,3H),2.59(s,3H),2.09～2.01(m,4H);13C NMR(151 MHz,Chloroform-d)δ:197.33,192.76,180.79,164.41,164.29,162.80,162.38,160.20,137.90,137.70,133.92,133.48,132.69,125.19,124.84,121.31,120.32,120.06,118.25,115.82,105.22,98.95,67.81,65.47,55.44,31.88,25.97,25.61; HR-MS(ESI-TOF),m/z:Calcd for C28H24O9{[M+H]+} 504.1473,found 504.1483。

3d:黃色固體,252 mg,產(chǎn)率48.7%,m.p.141.3～142.9 ℃,1H NMR(CDCl3,600 MHz),δ:12.01(s,1H),11.95(s,1H),8.39(d,1H,J=1.7 Hz),7.91(d,1H,J=1.7 Hz),7.86(d,1H,J=7.4 Hz),7.80(d,1H,J=8.9,3.2 Hz),7.72(t,1H,J=8.0 Hz),7.31(d,1H,J=8.3 Hz),6.52～6.45(m,1H),6.42(d,1H,J=2.5 Hz),4.43(t,2H,J=6.7 Hz),4.13～4.01(m,2H),3.83(d,3H,J=4.2 Hz),2.58(d,3H,J=10.2 Hz),2.00～1.81(m,2H),1.68(m,2H),1.41(d,2H,J=7.1 Hz);13C NMR(151 MHz,Chloroform-d)δ:197.49,192.80,180.88,164.44,164.36,162.81,162.40,160.37,138.02,137.69,136.03,133.95,133.51,132.65,125.21,124.85,121.29,120.34,120.11,119.34,105.16,98.95,69.76,68.32,55.45,31.90,31.58,30.30,22.86; HR-MS(ESI-TOF),m/z:Calcd for C29H26O9{[M+H]+} 518.1637,found 518.1642。

3e:黃色固體,產(chǎn)率49.4%,m.p.142.2～143.4 ℃,1H NMR(CDCl3,600 MHz)δ:11.94(s,1H),11.89(s,1H),7.92～7.83(m,1H),7.82～7.63(m,3H),7.33～7.26(m,1H),7.27(s,1H),6.48～6.35(m,2H),4.39(t,2H),4.03(t,2H,J=6.4 Hz),3.79(s,3H),2.55(s,3H),1.94～1.91(m,2H),1.90(t,2H,J=6.5 Hz),1.65～1.51(m,2H),1.28～1.24(m,2H);13C NMR(151 MHz,Chloroform-d)δ:197.49,192.80,180.88,164.44,164.36,

162.81,162.40,160.37,138.02,137.69,136.03,133.95,133.51,132.65,125.21,124.85,121.29,120.34,120.11,119.34,105.16,98.95,69.76,68.32,55.45,31.90,31.58,30.30,29.66,28.82; HR-MS(ESI-TOF),m/z:Calcd for C30H28O9{[M+H]+} 532.1786,found 532.1793。

1.3 體外抗炎活性分析[18]

將生長狀態(tài)良好的巨噬細胞(RAW264.7)加至12孔板中(5×105/孔),加培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜(培養(yǎng)基為含10% FBS及雙抗的DMEM)。次日更換細胞新鮮培養(yǎng)基,向孔中加入20 μg/mL濃度的目標(biāo)化合物3a～3e,30 min后加入LPS(0.1 μg/mL)刺激細胞,6 h后收集細胞,Trizol裂解,提取總RNA,進行反轉(zhuǎn)錄,實時熒光定量PCR檢測TNF-α,IL-1β和IL-6的mRNA水平,平行實驗重復(fù)3次。結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示:目標(biāo)化合物在20 μg/mL濃度下可下調(diào)炎癥因子TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA的表達。

表1 20 μg/mL濃度下3a～3e對TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物合成工藝優(yōu)化分析

在目標(biāo)化合物的合成中,本文曾設(shè)計如下合成路線(圖2):將大黃酸與不同鏈長的二溴烷烴反應(yīng)得到相應(yīng)的大黃酸溴代烷基酯(化合物4a～4e),然后再與丹皮酚(化合物1)的2-位酚羥基反應(yīng)所得目標(biāo)化合物3a～3e。進一步分析發(fā)現(xiàn),此合成路線盡管可以以較高產(chǎn)率得到溶解性能較好的大黃酸溴代烷基酯,但在第二步反應(yīng)中,在強堿和溫度較高的反應(yīng)條件下,中間體大黃酸溴代烷基酯的穩(wěn)定性會受到影響。此外,大黃酸分子中的酚羥基也會以酚氧離子的形式存在,與丹皮酚的酚氧離子產(chǎn)生競爭,導(dǎo)致副產(chǎn)物增多,影響目標(biāo)化合物的產(chǎn)率,增大后處理的難度。本文也曾按照該反應(yīng)路線進行嘗試,結(jié)果如上述分析相近,第二步反應(yīng)雜點多,后處理難度較大,且產(chǎn)率很低。后續(xù)按圖1中路線進行反應(yīng),即先將丹皮酚與二溴烷烴反應(yīng),再與大黃酸偶聯(lián),發(fā)現(xiàn)反應(yīng)能順利進行。在實驗過程中,本文對第二步的反應(yīng)物配比進行了優(yōu)化,得到最佳反應(yīng)物配比為:大黃酸∶丹皮酚溴代烷基醚=1.5∶1.0,n∶n,在此條件下能以較高的產(chǎn)率(46.3%～51.3%)得到目標(biāo)化合物。

圖2 目標(biāo)化合物3a～3e的原合成設(shè)計路線

2.2 目標(biāo)化合物的溶解性分析

由于大黃酸在水中不溶,在乙醇、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷等有機溶劑中極難溶解(<0.5 mg/mL),會在一定程度上影響其藥效的發(fā)揮。本研究對大黃酸進行修飾的目的之一是改善其溶解性能。為此,對合成的目標(biāo)化合物進行了簡單的溶解性定性實驗,發(fā)現(xiàn)其在乙醇、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷等有機溶劑中溶解度均大于10 mg/mL,較大黃酸相比有了很好的改善,但其在水中的溶解度與大黃酸相似,仍小于0.5 mg/mL,可能會對其藥效的發(fā)揮產(chǎn)生影響,有待進一步的結(jié)構(gòu)修飾和改造。

2.3 體外抗炎活性分析

炎癥因子是炎癥反應(yīng)中重要的細胞活性因子,它們對細胞炎癥都有直接或間接的作用。IL-1β、IL-6、TNF-α是重要的促炎因子,TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA高表達,導(dǎo)致IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子釋放增加。研究表明:IL-1β已成為治療全身和局部炎癥性疾病的靶標(biāo),可通過降低IL-1β活性達到治療效果[19]。TNF-α是一個經(jīng)典的炎癥指標(biāo),表達量的多少可以直接反映炎癥的嚴(yán)重程度[20]。IL-6具有抗炎和致炎的雙向作用[21]。為檢測所得目標(biāo)化合物是否具有抗炎作用,本研究以LPS刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7構(gòu)建體外炎癥模型,采用實時熒光定量PCR檢測目標(biāo)化合物對炎性因子TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA表達的影響。結(jié)果表明(表1):20 μg/mL濃度下3a～3e均可下調(diào)炎癥因子TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA表達,尤其對IL-1β的mRNA表達影響明顯。其中,化合物3c、3d和3e下調(diào)TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達作用強于化合物3a和3b,尤其以3d作用最為顯著。研究結(jié)果表明,目標(biāo)化合物可減輕LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)。

3 結(jié)論

本論文利用拼合原理,以不同碳數(shù)的烷烴鏈為連接臂,將均具有抗炎作用的大黃酸和丹皮酚偶聯(lián),得到相應(yīng)的大黃酸丹皮酚偶聯(lián)物(3a～3e),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR和HR-MS(ESI)表征。采用LPS刺激巨噬細胞(RAW264.7)構(gòu)建細胞炎癥模型,熒光定量PCR檢測炎性因子TNF-α,IL-1β和IL-6的mRNA表達。結(jié)果顯示,目標(biāo)化合物能夠抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的表達,尤其以3d的作用最佳,在抗炎活性方面具有一定的開發(fā)潛力。在實驗過程中,本文發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物在乙醇等有機溶劑中具有較好的溶解性能(優(yōu)于大黃酸),但在水中的溶解度仍然很低,有待進一步的結(jié)構(gòu)修飾和改造。