張振宇 崔海燕 王 勇

酰胺醇類藥物作為廣譜抗菌藥被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的抗菌治療,常用的酰胺醇類藥物有氯霉素(chloramphenicol)、甲砜霉素(thiamphenicol)和氟苯尼考(florfenicol)[1]。由于酰胺醇類藥物半衰期較長(zhǎng),進(jìn)入人體后難以通過(guò)消化系統(tǒng)排出[2]。氯霉素和甲砜霉素對(duì)人體均有較強(qiáng)的毒性,不僅會(huì)使人體產(chǎn)生耐藥性,嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致白血病、再生性障礙性貧血及灰色嬰兒綜合癥的發(fā)生;氟苯尼考雖無(wú)致癌、致畸和致突變作用,但會(huì)可逆性地抑制紅細(xì)胞的生成,且具有胚胎毒性[3-4]。GB 31650—2019對(duì)食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的最高殘留限量均作出了規(guī)定(表1)。目前酰胺醇類藥物殘留的檢測(cè)方法主要有色譜法[5]、質(zhì)譜法[6-7]、電化學(xué)法與電致化學(xué)發(fā)光法[8-9]、熒光法[10]、免疫法[11]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[12]等。文章擬綜述近5年來(lái)上述方法在動(dòng)物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考檢測(cè)的各種應(yīng)用,以期為動(dòng)物源性食品中酰胺醇類藥物殘留檢測(cè)新方法的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

表1 中國(guó)規(guī)定的食品中酰胺醇類藥物最高殘留限量

1 色譜法

色譜法可以對(duì)復(fù)雜的組分進(jìn)行分離并實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè),被廣泛應(yīng)用于藥物、食品、化工等領(lǐng)域,具有分離效率高、重現(xiàn)性能好、能與多種檢測(cè)器兼容且易于自動(dòng)化等特點(diǎn)[13-14]。

樣品前處理過(guò)程中萃取方法的選擇是影響色譜法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中酰胺醇類藥物殘留的重要因素之一。Moudgil等[15]利用高效液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)牛奶中的氯霉素,借助Oasis HLB固相萃取柱凈化樣品中的氯霉素,在最佳的試驗(yàn)條件下,氯霉素的線性范圍為50～500 ng/mL,檢出限為21.4 ng/mL。

加速溶劑萃取法是在高溫高壓條件下利用未達(dá)到臨界點(diǎn)的液體作為萃取溶劑的提取方法,具有萃取時(shí)間較短和溶劑使用量少的優(yōu)點(diǎn)。Wang等[16]使用加速溶劑萃取法提取禽蛋中的甲砜霉素和氟苯尼考,利用液相色譜—熒光檢測(cè)器可以在5 min內(nèi)準(zhǔn)確檢出甲砜霉素和氟苯尼考,2種殘留物的檢出限為1.8～4.9 μg/kg,回收率>80.1%,說(shuō)明該法可以用于檢測(cè)不同品種禽蛋中的甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩簟?/p>

濁點(diǎn)萃取法是通過(guò)改變pH值、溫度或離子強(qiáng)度等使表面活性劑產(chǎn)生濁點(diǎn)析相,從而將疏水性物質(zhì)和親水性物質(zhì)分離,該法不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑,是一種較為環(huán)保的提取方法[17]。Sürücü等[18]使用聚乙二醇6000作為表面活性劑,在添加pH為5.0的Britton-Robinson緩沖溶液與20%的硫酸鈉溶液后提取樣品中的氯霉素,經(jīng)渦旋、孵育、離心、相分離等步驟后,氯霉素便吸附至聚乙二醇6000表面,最后使用乙醇洗脫后利用高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè),該法在檢測(cè)牛奶樣品中氯霉素時(shí)回收率為95.4%～102.4%,檢出限為2.98 ng/mL。

氣相色譜法在檢測(cè)酰胺醇類藥物殘留時(shí)一般需經(jīng)過(guò)衍生處理,步驟較為繁瑣,但農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-13-2007(水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的測(cè)定)選擇氣相色譜法來(lái)檢測(cè)水產(chǎn)品中的氯霉素和甲砜霉素,說(shuō)明氣相色譜法具有一定的適用性。胡紅美等[19]利用氣相色譜—電子捕獲方法來(lái)測(cè)定水產(chǎn)品中的氯霉素,樣品經(jīng)乙酸乙酯超聲萃取和正己烷除脂后,使用N-丙基乙二胺固相吸附劑凈化并通過(guò)硅烷化試劑衍生,再使用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè),氯霉素的線性范圍為1.5～100.0 μg/L,檢出限為0.1 μg/kg,該法在鰻鱺、鱖魚(yú)和大管鞭蝦3種不同基質(zhì)中的回收率為78%～108%,在實(shí)際樣品復(fù)雜基質(zhì)檢測(cè)的應(yīng)用中效果良好。

色譜法具有準(zhǔn)確度較高、可同時(shí)快速檢測(cè)多種藥物殘留的優(yōu)點(diǎn),整體耗費(fèi)較低,因此較為適合市、縣級(jí)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)酰胺醇類藥物殘留的日常監(jiān)測(cè)。但色譜法在檢測(cè)酰胺醇類藥物時(shí)具有前處理方法較為繁瑣、前處理時(shí)間較長(zhǎng)以及揮發(fā)性有機(jī)試劑消耗較多等缺點(diǎn),需進(jìn)一步完善。

2 質(zhì)譜法

質(zhì)譜法是根據(jù)目標(biāo)分析物的質(zhì)荷比進(jìn)行定量檢測(cè),可以在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)上百種目標(biāo)分析物。質(zhì)譜儀可連接不同的色譜儀進(jìn)行分離步驟,GB/T 22338—2008中規(guī)定了動(dòng)物源性食品中氯霉素類殘留量的氣相色譜—質(zhì)譜和液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定方法,GB/T 20756—2006、GB 31658.2—2021使用了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法。除了這些國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),廣大科研人員也借助質(zhì)譜法來(lái)開(kāi)發(fā)新的方法用于檢測(cè)動(dòng)物源食品中的酰胺醇類藥物殘留,并取得了令人滿意的結(jié)果。

與色譜法一樣,前處理過(guò)程的效果直接影響質(zhì)譜法在檢測(cè)藥物殘留應(yīng)用中的準(zhǔn)確度,科研人員在使用質(zhì)譜法檢測(cè)酰胺醇類藥物殘留時(shí),常常會(huì)嘗試多種方法以尋找合適的提取試劑和方法。Saito-Shida等[20]建立了一種利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛和鰻魚(yú)中氟苯尼考與氟苯尼考胺總殘留量的方法,樣品經(jīng)鹽酸水解及固相萃取凈化,最大限度地降低了基質(zhì)效應(yīng),該法在檢測(cè)氟苯尼考?xì)埩魰r(shí)回收率>90%。Xie等[21]利用乙酸乙酯—乙腈—氨水(V乙酸乙酯∶V乙腈∶V氨水為49∶49∶2)混合溶液作為提取劑提取雞蛋中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考藥物殘留,3種藥物殘留的檢出限為0.04～0.50 μg/kg,回收率為90.84%～108.23%。

氣相色譜—質(zhì)譜法檢測(cè)酰胺醇類藥物殘留時(shí)也需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理。勞哲等[22]對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化、衍生化和定容后,利用在線凝膠滲透色譜—?dú)庀嗌V串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)氯霉素,上機(jī)溶液經(jīng)凝膠滲透色譜柱后由切換閥可以排出殘留的脂肪和色素,在優(yōu)化提取溶劑、衍生溫度、衍生時(shí)間等試驗(yàn)條件后,該法在檢測(cè)食品中氯霉素時(shí)檢出限為0.05 μg/kg,線性范圍為0.25～10.00 ng/mL。

固相萃取過(guò)程中吸附劑的選擇直接影響萃取效果,Zhou等[23]建立了一種新的微波輔助合成硼酸改性膨脹石墨(B-EG)方法,得到了蠕蟲(chóng)狀和片狀結(jié)構(gòu)的B-EG,并將B-EG作為固相萃取吸附劑來(lái)富集和分離雞蛋樣品中的氯霉素,利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)時(shí),檢出限為0.27 ng/g,在50 ng/g的添加濃度下,氯霉素回收率為87%～94%。

內(nèi)標(biāo)法可以顯著提高質(zhì)譜法檢測(cè)的準(zhǔn)確度,內(nèi)標(biāo)物的加入可以在一定程度上消除進(jìn)樣量和色譜條件的微小變化,并且可以部分補(bǔ)償待測(cè)組分在前處理過(guò)程中的損失。氘代氯霉素(d5-氯霉素)為氯霉素的內(nèi)標(biāo)物,在開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法時(shí)往往會(huì)選擇加入氘代氯霉素作為內(nèi)標(biāo)物。表2展示了利用內(nèi)標(biāo)法在檢測(cè)動(dòng)物源性食品中酰胺醇類藥物殘留的應(yīng)用效果。

表2 內(nèi)標(biāo)法在檢測(cè)酰胺醇類藥物殘留中的應(yīng)用效果

質(zhì)譜法檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確度和自動(dòng)化程度高,在農(nóng)業(yè)、食品、藥品等檢測(cè)工作中具有十分重要的作用,但是質(zhì)譜法也具有儀器和耗材昂貴、前處理過(guò)程繁瑣、有機(jī)溶劑使用量多等缺點(diǎn)。

3 電化學(xué)法與電致化學(xué)發(fā)光法

電化學(xué)法是通過(guò)分子識(shí)別元件與目標(biāo)分析物發(fā)生作用產(chǎn)生信號(hào),經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為可以識(shí)別的電信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)定性與定量分析。電化學(xué)法檢測(cè)速度較快,通常幾十秒便可以完成一次檢測(cè),靈敏度高,檢出限可達(dá)到“fg/mL”級(jí),且電化學(xué)法儀器簡(jiǎn)單便宜,便于小型化[27-28]。電化學(xué)傳感器是電化學(xué)法的基礎(chǔ)和重點(diǎn),其性能直接影響電化學(xué)法的靈敏度。常見(jiàn)的電化學(xué)法檢測(cè)方式有循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法[29-30]。

電致化學(xué)發(fā)光法是將電化學(xué)法與化學(xué)發(fā)光法結(jié)合而產(chǎn)生的方法,也是利用電化學(xué)傳感器來(lái)檢測(cè)目標(biāo)分析物,與電化學(xué)法不同的是電致化學(xué)發(fā)光法是檢測(cè)光信號(hào),因此靈敏度要比電化學(xué)法更高[31]。由表3可知,在檢測(cè)酰胺醇類藥物殘留時(shí),貴金屬、金屬氧化物、聚合物、石墨烯、核酸適配體、金屬有機(jī)框架材料等均可以作為電極材料用于構(gòu)筑電化學(xué)傳感器。

表3 不同電化學(xué)傳感器在檢測(cè)酰胺醇類藥物殘留中的應(yīng)用

電化學(xué)法在檢測(cè)一種藥物殘留時(shí)性能優(yōu)秀,但在同時(shí)檢測(cè)多種藥物殘留時(shí)存在較大的缺陷:① 多種藥物的氧化還原峰很接近,難以區(qū)分;② 一種固定濃度藥物的電流響應(yīng)值會(huì)隨另一種藥物濃度的變化而發(fā)生較大變化,嚴(yán)重影響測(cè)定的準(zhǔn)確性;③ 電化學(xué)法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性不理想,利用滴涂法制作的電化學(xué)傳感器在幾個(gè)測(cè)量之后表面的電極材料脫落嚴(yán)重。

4 熒光法

熒光法是基于輻射躍遷原理的檢測(cè)方法,當(dāng)利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射目標(biāo)分析物時(shí),具有特定結(jié)構(gòu)的分子/原子會(huì)發(fā)出熒光。該法具有特異性,適合復(fù)雜樣品中藥物殘留的檢測(cè)[41]。Yi等[42]使用上轉(zhuǎn)換納米材料NaYF4:Yb與金納米粒子設(shè)計(jì)了一種熒光探針,當(dāng)加入甲砜霉素時(shí),金納米顆粒會(huì)聚集從而抑制熒光共振能量轉(zhuǎn)移過(guò)程,使熒光強(qiáng)度減弱來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)甲砜霉素的定量檢測(cè),該法在檢測(cè)雞蛋中甲砜霉素時(shí)回收率為98.2%～105.3%,檢出限為0.003 μmol/L。

與傳統(tǒng)的熒光探針相比,量子點(diǎn)熒光探針的熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好,且量子點(diǎn)具有良好的生物相容性[43]。Sadeghi等[44]采用水熱法一步合成了新型離子液體包覆CdS量子點(diǎn)的熒光探針,在堿性介質(zhì)中加入氟苯尼考后會(huì)引起熒光猝滅,可據(jù)此來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)氟苯尼考的定量分析,優(yōu)化試驗(yàn)條件后,氟苯尼考檢出限為0.098 μmol/L,線性范圍為0.3～56.0 μmol/L,該法在檢測(cè)魚(yú)肉和雞肉中氟苯尼考時(shí)結(jié)果令人滿意,可用于肉制品中氟苯尼考?xì)埩舻目焖俸Y查。Sa-Nguanprang等[45]制備了CdTe*CdS*ZnS量子點(diǎn),隨后與介孔碳、分子印跡聚合物結(jié)合制備了用于靈敏檢測(cè)甲砜霉素的混合熒光傳感探針,在檢測(cè)牛奶中甲砜霉素時(shí)回收率為93.5%～100.1%。

熒光生物傳感器是將生物技術(shù)與熒光技術(shù)結(jié)合而成,識(shí)別元件主要有各種抗原、抗體、蛋白和核酸等,其中由核酸構(gòu)成的熒光生物傳感器對(duì)待測(cè)物具有特異性的識(shí)別能力,在檢測(cè)藥物殘留時(shí)具有優(yōu)秀的靈敏度[46]。Li等[47]利用三倍體DNA和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的無(wú)酶熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感平臺(tái)來(lái)檢測(cè)牛奶中殘留的氯霉素,氯霉素能夠特異性地與適配體結(jié)合引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成三倍體DNA導(dǎo)致熒光降低,進(jìn)而檢測(cè)牛奶中的氯霉素殘留,該法對(duì)氯霉素的檢出限為1.2 pg/mL,回收率為97.5%～106.0%。

以蛋白為模板合成的金納米簇在生物相容性、光穩(wěn)定性、綠色合成以及表面功能化修飾等方面具有十分重要的研究?jī)r(jià)值[48]。成玉梁等[49]合成了大豆蛋白—金納米簇,根據(jù)氯霉素對(duì)大豆蛋白—金納米簇的熒光猝滅現(xiàn)象開(kāi)發(fā)了可以檢測(cè)氯霉素的熒光傳感器,檢出限為22.86 μmol/L,回收率為87.80%～98.45%,可靠性較高,可用于檢測(cè)豬肉中的氟苯尼考。

碳點(diǎn)是一種新型的碳納米熒光材料,具有光學(xué)性能穩(wěn)定、生物相容性良好、易于制備等優(yōu)點(diǎn),既可以通過(guò)生物質(zhì)碳源制備,也可以由非生物質(zhì)碳源制得,來(lái)源十分廣泛[50]。Fu等[51]分別利用檸檬酸鹽、乙二胺和香菜制備了非生物質(zhì)碳點(diǎn)與生物質(zhì)碳點(diǎn),然后將SiO2和沸石咪唑酯骨架結(jié)構(gòu)材料(ZIF-8)結(jié)合制備了下/上轉(zhuǎn)換雙激發(fā)多發(fā)射熒光印跡傳感器,在370,780 nm光源激發(fā)條件下,該傳感器對(duì)甲砜霉素表現(xiàn)出雙通道熒光響應(yīng),線性范圍分別為5.0×10-3～6.0,6.0～26.0 μmol/L,可用于檢測(cè)肉類樣品與牛奶樣品中的甲砜霉素,回收率為95.0%～105.0%。

熒光法具有耗費(fèi)低、儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),適合現(xiàn)場(chǎng)高通量快速篩查,在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。但是熒光物質(zhì)穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)還未解決。

5 免疫法

免疫法是以抗原抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)而進(jìn)行測(cè)定抗原抗體含量的一種分析方法,主要有酶聯(lián)免疫法和免疫層析法,具有檢測(cè)速度快、價(jià)格便宜、便攜性好等優(yōu)點(diǎn)[52]。

膠體金免疫層析法是以膠體金作為示蹤物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種免疫法,該法特異性強(qiáng)且靈敏度高,不需要借助任何設(shè)備儀器[53]。Lei等[54]利用以納米金為基礎(chǔ)的單克隆抗體和間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法建立了可以檢測(cè)雞蛋中氟苯尼考和甲砜霉素藥物殘留的方法,優(yōu)化條件后,該試紙條在檢測(cè)氟苯尼考與甲砜霉素的檢出限為0.053 ng/mL。

近年來(lái),免疫法與儀器分析技術(shù)相結(jié)合開(kāi)發(fā)的時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)具有檢測(cè)速度快且可以實(shí)現(xiàn)定量分析的特點(diǎn),該法使用稀土元素作為標(biāo)記物,可以明顯提升方法的靈敏度[55]。崔乃元等[56]合成了羧基化的銪微球,并將其與氯霉素鼠單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)標(biāo)記,使用氯霉素抗原與羊抗鼠二抗分別包被于硝酸纖維膜上作為檢測(cè)線和控制線,將羧基化銪微球標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體噴灑在釋放墊上一起制成了試紙條,利用熒光免疫定量分析儀檢測(cè)水產(chǎn)品中的氯霉素時(shí),定量限為0.1 μg/kg。

免疫法常用于養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)對(duì)動(dòng)物尿液進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)分析,在動(dòng)物源性食品安全監(jiān)管方面發(fā)揮了很大作用。但是,免疫法具有假陽(yáng)性的缺點(diǎn),當(dāng)出現(xiàn)假陽(yáng)性時(shí),還需要借助其他方法進(jìn)行確證,而且大部分免疫法在檢測(cè)酰胺醇類藥物殘留時(shí)均不能給出具體的殘留量,免疫法與其他儀器結(jié)合使用可以克服這一缺點(diǎn)。

6 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼光譜法結(jié)合了拉曼光譜和表面材料技術(shù),由于局域表面等離子體共振和化學(xué)吸附現(xiàn)象導(dǎo)致拉曼散射信號(hào)顯著提升,檢測(cè)靈敏度得以提升,同時(shí)具有樣品消耗少、無(wú)損傷、響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)[57]。Li等[58]合成了具有3D結(jié)構(gòu)的ZnO@Ag納米花,Ag納米粒子均勻分布在ZnO表面,將ZnO@Ag納米花通過(guò)浸漬法組裝至聚酯纖維膜上制備了柔性基板,將含氟苯尼考的雞肉樣品利用乙酸乙酯提取后得到的上清液滴加至柔性基板上進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)量,在最佳的試驗(yàn)條件下,該法檢測(cè)氟苯尼考的檢出限達(dá)0.223 nmol/L。

7 結(jié)論

(1) 色譜法與質(zhì)譜法在同時(shí)檢測(cè)多種酰胺醇類藥物殘留的應(yīng)用方面優(yōu)勢(shì)明顯,準(zhǔn)確度高,已有許多國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的酰胺醇類藥物殘留,后續(xù)研究重點(diǎn)可聚焦于以下方面:① 開(kāi)發(fā)有機(jī)溶劑使用量少、萃取效率高、綠色環(huán)保以及安全的前處理方法;② 合成性能優(yōu)異的新型吸附劑,如磁性納米材料;③ 建立多種類藥物同時(shí)提取、檢測(cè)的方法,提高檢測(cè)效率,降低試驗(yàn)成本。

(2) 除了常見(jiàn)的循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法等方法,電化學(xué)法也可使用交流阻抗譜進(jìn)行酰胺醇類藥物殘留的定性與定量分析,以提高電化學(xué)法的靈敏度和準(zhǔn)確性。此外,可以合成新型功能化納米復(fù)合材料用于改善電化學(xué)傳感器的重現(xiàn)性,也可探索使用電沉積、電聚合、金—硫鍵反應(yīng)等方式制作穩(wěn)定性能更好的電化學(xué)傳感器。

(3) 聯(lián)合使用免疫法與熒光法,既保留了特異性也滿足定量分析,可合成具有多種顏色的熒光標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)多種酰胺醇類藥物殘留的同時(shí)檢測(cè),并且利用有機(jī)材料包裹熒光物質(zhì)制成納米微球可以顯著提高熒光探針的穩(wěn)定性。