韓鑫　郭金菊　張惠堯　吳廷全　張長遠

摘? ? 要：以苦瓜八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene dehydrogenase，PDS）基因為靶標，構建其特異gRNA的CRISPR/Cas9基因編輯載體，以期為建立苦瓜CRISPR/Cas9基因編輯技術體系奠定基礎。以苦瓜自交系B07葉片cDNA為模板，同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。結果表明，McPDS基因CDS序列全長1731 bp，編碼576個氨基酸，蛋白質相對分子質量為64.44 kD，理論等電點（PI）為7.09?？缒そY構分析結果表明，該蛋白為親水性非跨膜蛋白。系統(tǒng)進化樹分析結果表明，McPDS與黃瓜、甜瓜等葫蘆科植物中的PDS蛋白同源性較高。此外，以McPDS為靶標基因，在5端篩選2個高特異性靶點，經設計引物，成功構建1個雙靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體，為苦瓜基因編輯體系的建立奠定了技術基礎。

關鍵詞：苦瓜；McPDS；基因克??；載體構建；基因編輯

中圖分類號：S642.5 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）03-020-08

Cloning and CRISPR/Cas9 gene editing vector construction of McPDS in bitter gourd（Momordica charantia L.）

HAN Xin1， 2， GUO Jinju1， ZHANG Huiyao1， WU Tingquan1， ZHANG Changyuan1

（1. Institute of Facility Agriculture， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， Guangdong， China; 2. College of Horticulture & Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， Hubei， China）

Abstract： A gRNA-specific CRISPR/Cas9 gene editing vector targeting phytoene dehydrogenase （PDS） gene of bitter gourd was constructed， hoping to lay a foundation for the establishment of CRISPR/Cas9 gene editing technology system of bitter gourd. In this study， the CDS region of McPDS gene was cloned from the leaf cDNA of bitter gourd inbred line B07. The results showed that the coding region length of McPDS was 1731 bp， encoded 576 amino acids，the theoretical relative molecular weight was 64.44 kD， and the theoretical isoelectric point（PI） was 7.09. The transmembrane structure analysis showed that the protein was a hydrophilic non-transmembrane protein. Phylogenetic analysis showed that McPDS had high homology with PDS proteins in cucurbit plants such as cucumber and melon. In addition， using McPDS as the target gene， two highly specific targets were screened at the 5' end， primers were designed， and a double-target CRISPR/Cas9 gene editing vector was successfully constructed， which laid a technical foundation for the establishment of bitter gourd gene editing system.

Key words： Bitter gourd；McPDS；Gene cloning；Vector construction；Gene editing

苦瓜是葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬（Momordica charantia L.）一年生攀緣草本植物，廣泛分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)[1-3]?？喙纤幧偶嬗?，富含維生素、膳食纖維、粗蛋白、氨基酸等營養(yǎng)物質和皂苷、酚類、類黃酮、多糖等化合物[4]，具有降糖、降脂、抗病毒、防衰老等多種藥理作用[5-6]，深受廣大消費者青睞，市場前景廣闊。

八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene dehydrogenase，PDS）是類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵限速酶，與ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）和類胡蘿卜素異構酶（CRTISO）共同催化八氫番茄紅素合成番茄紅素，影響番茄紅素及下游類胡蘿卜素的生成[7-8]。PDS基因編碼的蛋白主要位于葉綠體的類囊體膜上，對葉綠體具有光保護作用，其功能的缺失會導致葉綠素降解，造成光漂白現象[9]。由于該表型明顯，易于觀察，PDS基因常被用作報告基因，建立病毒誘導的基因沉默（VIGS）體系和基因編輯技術體系等，對基因功能研究和作物遺傳改良具有重要意義[10]。

CRIPSR/Cas9系統(tǒng)是新近發(fā)展起來的一種高效、精準的基因組編輯技術，已成功應用于擬南芥、煙草和水稻等多個物種中，實現了基因定向編輯[11]。目前該技術正在被廣泛應用于植物基因功能鑒定和品種改良等領域，具有廣闊的應用前景。Zeng等[12]利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)對水稻的PIN5b、GS3和MYB30基因同時進行定點突變，獲得的突變體分別表現出穗長增加、粒徑增大和耐寒性增強等特點。Santosh等[13]利用CRISPR/Cas9方法在秈稻CV.MTU1010基因組中創(chuàng)建了突變等位基因DST?184-305，該基因有助于提高秈稻品種的耐旱耐鹽性和產量。在番茄中，通過CRISPR/Cas9技術敲除SP5G、SlMYB12、AGL6等基因，可使果實產量快速提升[14]、高效獲得粉紅果色番茄[15]和無籽果實[16]。馬存發(fā)等[17]利用CRISPR/Cas9技術敲除青花菜的BoSP11基因，創(chuàng)制了花期自交親和材料。

目前，利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)對苦瓜基因進行定點編輯的研究還未見報道。筆者以苦瓜自交系B07葉片為試材，采用RT-PCR技術同源克隆苦瓜McPDS基因，對其編碼蛋白的理化性質、結構特征及保守結構域等進行分析，并以該基因為靶標，利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)構建雙靶點基因編輯載體，以期為苦瓜基因編輯體系的建立及農藝性狀的定向改良奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用植物材料B07是由廣東省農業(yè)科學院設施農業(yè)研究所選育的高世代、大頂類型苦瓜自交系，于2023年3月下旬種植于廣東省農業(yè)科學院白云試驗基地，常規(guī)管理。于幼苗四葉一心時，取其嫩葉立即放入液氮速凍，并于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

植物總RNA提取試劑盒SV Total RNA Isolation System Kit（Promega，美國），反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT Kit（TaKaRa，日本），DNA凝膠回收試劑盒（TIANGEN，德國），pMD-19T Vector、T4 DNA連接酶（TaKaRa，日本），限制性內切酶BsaI（NEB，美國），質粒小提中量試劑盒（TIANGEN，德國），大腸桿菌DH5α、根癌農桿菌GV3101均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 McPDS基因克隆

提取苦瓜葉片總RNA，反轉錄合成cDNA。利用Primer Premier 5.0設計McPDS基因序列特異性引物，引物序列如下：McPDS-F：ATGTCACTATGTGGATCTGTCTCTG；McPDS-R：TCACCGAACGCCCGCCTCAGC。PCR反應體系（20 μL）：PrimeSTAR Max Premix （2X） 10 μL，引物McPDS-F/R（10 μmol·L-1）各0.5 μL，模板（cDNA）1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸4 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠、純化回收目的片段。

目的片段加A尾后連接至克隆載體pMD19-T。連接反應體系及條件：pMD19-T Vector 1 μL，目的片段4 μL，SolutionⅠ 5 μL，16 ℃連接30 min。采用熱激法將重組載體轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含100 mg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h，篩選到的陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 McPDS蛋白生物信息學分析

利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析McPDS蛋白的理化性質；利用ProtScale（http：//web.expasy.or g/protscale/）對McPDS蛋白進行親水性分析；通過在線軟件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析McPDS蛋白的保守結構域；利用TMHMM 2.0 Server （TMHMM 2.0 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services）分析McPDS蛋白跨膜結構；通過Signal P 4.1 Server （SignalP 4.1 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services）預測McPDS蛋白信號肽；分別利用PRABI（npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和Swiss-Model（Swissmodel.expasy.org）預測McPDS蛋白的二級和三級結構；采用ClustalW和MEGA-X軟件進行氨基酸多序列比對及系統(tǒng)進化樹構建。

1.4 CRISPR/Cas9基因編輯載體構建

1.4.1 gRNA靶點選擇和靶標引物設計 利用在線網站CRISPOR（http：//crispor.tefor.net/）進行靶位點選擇，最終篩選出2個靶位點，序列分別為：靶標1：GGAGAACAGCATCTCHAGGTTGG；靶標2：AAAGTAGTGATCGCTGGTGCAGG。根據靶點序列合成相應的靶點引物，序列如下：CrMcPDS-F：CAGTGGTCTCATGCAGGAGAACAGCATCTCGAGGT；CrMcPDS-R：CAGTGGTCTCAAAACGCACCAGCGATCACTACTTT。

1.4.2 CRISPR/Cas9表達載體構建 利用引物CrMcPDS-F/CrMcPDS-R擴增“gRNA1+骨架+tRNA+ gRNA2”序列，PCR反應體系（50 μL）：Biorun Pfu PCR Mix 25 μL，CrMcPDS-F 1 μL，CrMcPDS-R 1 μL，模板（SEQ1）1 μL，Nuclease-free Water 補足至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 54 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。目的片段經切膠、回收后，酶切連接至載體PHsbdcas9i，獲得pHSbdcas9i-McPDS-gRNA表達載體。酶切連接體系：10×Buffer 2 μL，BsaⅠ 1 μL，T4_ligase 1 μL，PHsbdcas9i 4 μL，膠回收產物 4 μL，Nuclease-free Water 補足至20 μL。反應條件：37 ℃ 20 min；37 ℃ 10 min，20 ℃ 10 min，循環(huán)5次；37 ℃ 20 min，80 ℃ 5 min。上述使用的模板SEQ1序列為：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca。

取5～10 μL連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，將轉化菌液涂布于卡那霉素抗性平皿中，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑斑，利用引物zmpl-chen-F/zmpl-chen-R進行菌斑PCR，目的片段長度約800 bp。PCR反應體系（25 μL）：Biorun Magic PCR Mix 12.5 μL，M13F（100 μmol·L-1）1 μL，zmpl（100 μmol·L-1）1 μL，模板1 μL， Nuclease-free Water 補足至25 μL。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 54 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 min。篩選到陽性克隆后，利用引物zmpl-chen-F進行測序，對測序正確的菌液提取質粒。引物序列為：zmpl-chen-F：gtaaaacgacggccagt；zmpl-chen-R：ccagaaattgaacgccgaag。

2 結果與分析

2.1 苦瓜葉片總RNA提取

利用植物總RNA提取試劑盒提取苦瓜葉片總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳獲得2條清晰條帶（圖1），RNA質量濃度為366.534 ng·μL-1，A260/A280和A260/A230比值分別為2.18和2.27。結果表明，RNA純度較高，完整性好，可用于后續(xù)試驗。

2.2 苦瓜McPDS基因克隆

將上述提取的總RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，利用引物McPDS-F/McPDS-R進行PCR擴增，擴增條帶約1700 bp，與預期結果一致，凝膠電泳結果如圖2-A所示。對PCR產物進行凝膠回收，加A尾，連接至克隆載體pMD19-T，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，涂布于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h。挑取單菌落，37 ℃、200 r·min-1搖菌，PCR檢測篩選陽性單克?。▓D2-B），并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

測序結果表明，該基因編碼區(qū)長度1731 bp，編碼576個氨基酸。在NCBI數據庫BLAST比對結果表明，該基因編碼的氨基酸與甜瓜PDS基因編碼的氨基酸（NP_001284459.1）同源性高達93.58%，將該基因命名為McPDS。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 苦瓜McPDS蛋白理化性質分析 利用Protparam在線軟件分析苦瓜McPDS蛋白理化性質，結果表明，苦瓜McPDS蛋白分子式為C2908H4568N772O829S26，相對分子質量為64.44 kDa，其帶正、負電荷殘基數均為69，理論等電點（PI）為7.09，表明苦瓜McPDS為中性蛋白。不穩(wěn)定指數為44.05（>40），屬不穩(wěn)定蛋白。McPDS脂溶指數為92.08。

利用ProtScale對苦瓜McPDS進行蛋白親/疏水性分析，總平均親水性值為-0.154。一般而言，蛋白中氨基酸分值與其親水性呈負相關。苦瓜McPDS蛋白氨基酸序列中第151位的分值最低（-2.667），親水性值最強，而第111位因具最高分值（2.367），相應具最強的疏水性?？喙螹cPDS蛋白整個多肽鏈中親水性氨基酸呈均勻分布，疏水性區(qū)域不明顯，推測McPDS為親水性蛋白。保守結構域預測分析結果表明，McPDS蛋白具有1個保守的PDS結構域（PLN02612）（圖3）。

2.3.2 苦瓜McPDS蛋白跨膜結構分析 采用TMHMM 2.0 Server在線軟件對苦瓜McPDS蛋白跨膜區(qū)進行預測，結果表明，McPDS蛋白無跨膜區(qū)，屬非跨膜蛋白。SignalP-4.1預測結果顯示，苦瓜McPDS蛋白存在信號肽的概率僅為0.45%，說明苦瓜McPDS為非分泌蛋白。

2.3.3 苦瓜McPDS蛋白二、三級結構預測 二級結構預測結果表明，苦瓜McPDS蛋白由41.32%的α-螺旋、38.89%的無規(guī)則卷曲、15.28%的延伸主鏈和4.51%的β-折疊組成（圖4）。三級結構預測和同源建模分析表明，苦瓜McPDS基因編碼的蛋白三級結構與番木瓜八氫番茄紅素脫氫酶PDB ID：Q0PQZ4.1.A蛋白序列一致性高達83.33%，覆蓋度為100%（圖5）。

2.3.4 PDS蛋白多序列比對及系統(tǒng)進化分析 將McPDS基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進行BLAST比對，結果表明，其與黃瓜、南瓜、甜瓜、冬瓜的同源性分別為95.1%、94.3%、94.1%、93.8%，同源性較高。利用ClustalX和MEGA-X軟件，將McPDS基因編碼的氨基酸序列與NCBI數據庫中登錄的15種植物中的PDS序列構建Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)進化樹。結果表明，苦瓜McPDS與甜瓜、黃瓜、冬瓜和南瓜等其他葫蘆科作物的PDS蛋白聚為同一支，親緣關系較近（圖6）。

2.4 苦瓜McPDS基因編輯載體構建

利用引物CrMcPDS-F/CrMcPDS-R擴增gRNA表達盒，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖7-A），目的片段純化回收后，采用Golden Gate克隆法構建pHSbdcas9i-McPDS-gRNA表達載體，采用熱激法轉化大腸桿菌DH5α，涂板，利用引物zmpl-chen-F/R檢測陽性單克隆，目的片段大小約800 bp，與預期結果相符（圖7-B）。陽性克隆測序結果表明，“gRNA1+骨架+tRNA+ gRNA2”序列成功連接至植物表達載體pHSbdcas9i（圖7-C）。以上結果表明基因編輯載體pHSbdcas9i-Cr-PDS構建成功（圖7-D）。

將pHSbdcas9i-Cr-PDS提取質粒，轉化農桿菌GV3101，涂布于卡那霉素+利福平抗性的固體LB培養(yǎng)基中，菌落生長狀態(tài)如圖8-A所示。挑選出3個單克隆利用引物zmpl-chen-F/R進行PCR檢測，擴增片段大小約800 bp，與預期結果相符（圖8-B）。挑取陽性單克隆于卡那霉素+利福平抗性的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2 d，按體積比1∶1加入60%甘油，于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)苦瓜遺傳轉化。

3 討論與結論

基因編輯技術已經成為農業(yè)育種的主流方式，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有設計簡單、編輯效率高，以及成本低等特點，廣泛應用于作物育種研究中，在品質改良，提高產量，增強抗病、抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用[18]。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應用于水稻[12]、大豆[19]、番茄[20]、西瓜[21]、香蕉[22]、柑橘[23]等作物的遺傳改良。

八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）是植物類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵限速酶，通過在植物體內積累八氫番茄紅素來影響花、葉、果實中的類胡蘿卜素含量[24-25]。PDS基因敲除或者功能喪失能夠影響類胡蘿卜素合成代謝，導致植株白化[9]，可以用來作為判定植物基因編輯技術體系是否成功建立的標記。舒海燕等[26]對菠蘿八氫番茄紅素脫氫酶基因Aco-PDS1進行定點編輯，突變株系的白化表型表明了Aco-PDS1基因成功進行了編輯突變，以此來判定菠蘿CRISPR-Cas9系統(tǒng)的成功建立。胡春華等[22]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點敲除香蕉內源性八氫番茄紅素脫氫酶基因，成功獲得了香蕉白化突變株系。這些研究均表明了PDS基因在VIGS和CRISPR/Cas9等研究中的重要作用。

苦瓜作為重要的嶺南特色瓜類蔬菜，分子生物學研究起步較晚，相比黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科作物，分子研究基礎薄弱。截止到目前，尚未建立完善的苦瓜基因編輯體系。筆者以苦瓜自交系B07為材料，首次克隆出苦瓜McPDS基因，該基因cDNA序列全長為1731 bp，編碼576個氨基酸。苦瓜McPDS基因編碼的氨基酸序列與甜瓜、黃瓜、冬瓜和南瓜等其他葫蘆科作物PDS蛋白的氨基酸序列具有較高的同源性，均在80%以上，說明該基因在進化過程中較為保守。

筆者以McPDS為靶標基因，在5端編碼區(qū)位置設計2個靶位點，通過Golden Gate方法構建了1個雙靶點基因編輯載體。目前，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯載體已在很多作物中成功構建。陳博雯等[27]構建了尾葉桉EuCAD基因的雙靶點基因編輯載體，并利用原生質體轉化體系對基因編輯效果進行驗證。由于苦瓜遺傳轉化體系尚不成熟，筆者構建的基因編輯載體pHSbdcas9i-Cr-PDS尚未進行基因編輯效率的驗證，有待后續(xù)進一步研究。農桿菌介導法是目前植物中應用最為廣泛的基因轉化方法，具有操作簡單、能穩(wěn)定復制及表達等優(yōu)勢[28]。因此，利用本研究中構建的pHSbdcas9i-Cr-PDS編輯載體，通過農桿菌介導法建立苦瓜基因編輯體系，是后續(xù)研究的重點。

綜上所述，筆者克隆了苦瓜McPDS基因，并成功構建了1個雙靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體，填補了苦瓜在基因編輯研究方面的空白，為后續(xù)建立苦瓜基因編輯體系，并利用該體系研究苦瓜基因功能及定向改良苦瓜重要農藝性狀奠定了技術基礎。

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收稿日期：2023-11-27；修回日期：2024-01-12

基金項目：廣東省農業(yè)科學院協同創(chuàng)新中心項目（XTXM202203）；廣州市科技計劃項目（202206010170，202201010493）；廣東省自然科學基金項目（2022A1515010343）；廣東省農業(yè)農村廳種業(yè)振興行動專項（2022-NPY-00-027）；廣東省農業(yè)科學院創(chuàng)新基金項目（202301）；廣東省農業(yè)科學院學科團隊建設項目（202130TD）

作者簡介：韓? ? 鑫，女，在讀碩士研究生，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：hanxin7026@163.com

通信作者：張長遠，男，研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：zcy79130@163.com