王 康,劉格言,王 宇,楊 振,唐欣巍,曹三杰,黃小波,顏其貴,伍 銳,趙 勤,杜森焱,文心田,文翼平

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 豬病研究中心,成都 611130)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是導(dǎo)致豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原,該病毒能導(dǎo)致感染豬免疫功能抑制,從而引發(fā)豬斷奶后的多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、皮炎與腎病綜合征、肉芽腫性腸炎、母豬繁殖障礙、仔豬先天性震顫等疾病[1-2]。PCV2的衣殼蛋白(capsid protein,Cap)由PCV2的ORF2基因編碼,是其主要的免疫原性蛋白[3]。副豬革拉瑟菌(Glaesserellaparasuis, GPS)是一種常見于豬上呼吸道的條件致病菌,能引起豬的革拉瑟病(Glasser’s disease),臨床特征主要為豬的多發(fā)性漿膜炎、胸膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、腹膜炎和心包炎[4-6]。PCV2和GPS在臨床上常混合感染,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[7]。

細菌菌影(bacterial ghosts,BGs)是通過化學法、基因工程法或物理方法在細菌包膜上形成跨膜通道,并將核酸、細胞質(zhì)等內(nèi)容物釋放到細菌體外所形成的一個細菌空殼,可作疫苗、佐劑和抗原(核酸疫苗、亞單位疫苗)載體使用[8-9]。菌影疫苗溫和的滅活方式保留了細菌完整的抗原結(jié)構(gòu),不存在耐藥或毒力返強的風險,具有佐劑的固有特性,內(nèi)部空間還可以裝載大量質(zhì)粒DNA[10-11]。由于菌影表面保留了完整的形態(tài)結(jié)構(gòu),因此菌影易被機體免疫細胞(如RAW264.7細胞)識別并捕獲,裝載入菌影的 DNA 疫苗可以通過 3 種機制到達作用部位:第一,菌影附著在免疫細胞上,靜電結(jié)合的DNA疫苗被微環(huán)境 pH 破壞后在作用部位釋放;第二,菌影與免疫細胞的細胞膜發(fā)生融合,DNA 疫苗進入細胞質(zhì),在細胞質(zhì)中釋放并表達;第三,菌影被內(nèi)體攝取后并在溶酶體降解之前逃離內(nèi)體,將 DNA 疫苗釋放進入細胞質(zhì)后表達[12]。Wen等[13]利用菌影這一特性將pEGFP-N1真核質(zhì)粒裝載入沙門菌菌影后轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞,熒光顯微鏡觀察到幾乎所有細胞均表達綠色熒光?；瘜W法是目前制備菌影最常用的方法之一,其中NaOH是最常用的化學物質(zhì),適宜濃度的NaOH可以水解細菌包膜上的部分蛋白,在細菌外殼上形成跨膜孔道結(jié)構(gòu),使菌影的內(nèi)容物排出,NaOH能夠安全地在短時間內(nèi)簡單地以低成本有效生產(chǎn)大量菌影[8,14],目前已經(jīng)成功制備了豬鏈球菌[15]、豬胸膜肺炎放線桿菌[16]、李斯特菌[17]以及金黃色葡萄球菌[18]等多種菌影疫苗,均展示了較好的免疫保護效果。DNA疫苗具有安全穩(wěn)定、易于構(gòu)建、價格低廉等優(yōu)勢[19],Sylla等[20]將PCV2的ORF2基因插入pEGFP-N1質(zhì)粒,制備PCV2 DNA疫苗,免疫小鼠后攻毒,結(jié)果顯示,小鼠的臨床癥狀和病理變化明顯減輕。

當前PCV2和GPS混合感染的情況普遍存在,二聯(lián)苗在一針兩防的同時,還具有減少豬群免疫壓力和應(yīng)激,降低疫病防控成本等優(yōu)勢?；诖?本研究首先制備GPS菌影,再將連有PCV2 ORF2基因的真核質(zhì)粒裝載其中,構(gòu)建PCV2-GPS二聯(lián)菌影疫苗,探究其對小鼠的免疫保護效果,為新型安全有效的PCV2、GPS二聯(lián)商品化疫苗的開發(fā)和應(yīng)用提供生物材料和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株、毒株、質(zhì)粒、細胞系及實驗動物

副豬革拉瑟菌5型SH0165菌株由四川農(nóng)業(yè)大學豬病研究中心保存;大腸桿菌(Trelief 5α Chemically Competent Cell)購自擎科生物;豬圓環(huán)病毒2型CHN SC0413毒株,真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1,小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7細胞)、豬腎細胞(PK-15細胞)、人胚腎細胞(HEK 293 T細胞)由四川農(nóng)業(yè)大學豬病研究中心保存;4周齡雌性無特定病原體(SPF)小鼠(BALB/c)購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)均購自美國BD-Difco公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)購自美國Sigma公司;胎牛血清、新生牛血清購自NEWZERUM;豬PCV2陽性血清,大腸桿菌表達的PCV2 重組Cap蛋白,由實驗室(制備)保存;羊抗豬IgG二抗(HRP 標記),羊抗鼠 IgG 二抗(HRP 標記)購自 Solarbio 科技有限公司;商品化疫苗(PCV2、GPS二聯(lián)滅活疫苗)購自某公司;小鼠IFN-γ、IL-12酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)購自聯(lián)科生物。

1.3 GPS菌影制備與鑒定

將SH0165菌落數(shù)調(diào)整為1×109CFU·mL-1,將起始濃度為10 mg·mL-1的NaOH溶液兩倍梯度稀釋后分別與菌體共孵育24 h,通過涂板活菌計數(shù)和渾濁度觀察測定NaOH對GPS的最低抑菌濃度(MIC);將MIC的NaOH與菌體在37 ℃條件下孵育,每隔10 min取樣,通過涂板活菌計數(shù)檢測每個時間點的活菌數(shù),未檢測到活菌的最短時間為制備菌影的最佳時間;將GPS菌影和未處理的GPS在掃描電子顯微境下觀察形態(tài)學差異,通過瓊脂糖凝膠電泳和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測菌影內(nèi)容物(DNA和蛋白質(zhì))的排出情況。

1.4 GPS菌影誘導(dǎo)RAW264.7細胞因子的轉(zhuǎn)錄

將RAW264.7細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板中(每孔2 mL,106個細胞)。用GPS活菌和菌影(濃度均為108CFU·mL-1)分別與RAW264.7細胞共孵育,并設(shè)置脂多糖(LPS,濃度為25 μg·mL-1)陽性對照和空白對照,分別于3、6、9 h時收集細胞,按照細胞總RNA提取試劑盒操作說明提取RAW264.7細胞的總RNA,然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參基因,用2-ΔΔCt相對熒光定量PCR方法檢測細胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS)的轉(zhuǎn)錄水平。細胞因子的熒光定量引物信息如表2所示。

表1 熒光定量PCR引物序列和片段大小

表2 小鼠分組與免疫程序

1.5 重組質(zhì)粒pEGFP-ORF2構(gòu)建與過表達鑒定

根據(jù)GenBank公布的PCV2 CHN SC0413毒株全基因組(OP922507)中ORF2序列,設(shè)計同源重組擴增引物(pEGFP-ORF2-F:5′-gagctcaagcttc-gaattcATGACGTATCCAAGGAGGC-3′、pEGFP-ORF2-R:5′-atggtggcgaccggtggatcccgAGGGTTA-AGTGGGGGGTCT-3′),通過PCR擴增ORF2基因片段,pEGFP-N1利用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切,將ORF2基因片段和酶切產(chǎn)物純化后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中,通過PCR、雙酶切及測序進行鑒定,隨后進行去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒并按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明將重組質(zhì)粒pEGFP-ORF2轉(zhuǎn)染至HEK 293 T細胞中,同時設(shè)置空載體pEGFP-N1和未處理細胞作為對照組,2 d后收集細胞利用Western blot檢測并分析蛋白表達情況。

1.6 PCV2-GPS二聯(lián)菌影疫苗制備及免疫

1.6.1 疫苗制備 將菌影與pEGFP-ORF2質(zhì)粒緩沖液混合至終濃度為25 mmol·L-1的CaCl2溶液,充分混勻后,37 ℃震蕩孵育2 h,5 000 r·min-1離心收集沉淀,用PBS清洗3遍后離心重懸,命名為豬圓環(huán)病毒2型-副豬革拉瑟菌二聯(lián)菌影疫苗,隨后將其轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞,轉(zhuǎn)染步驟:待RAW264.7細胞長到細胞瓶底面積的80%時,調(diào)整 RAW264.7 細胞密度至106·mL-1,接種于6孔細胞板,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)12 h。將PCV2-GPS二聯(lián)菌影疫苗(菌影與細胞個數(shù)之比1 000∶1)與 RAW264.7細胞混勻,同時設(shè)置pEGFP-ORF2質(zhì)粒和未處理的RAW264.7細胞作為對照組,37 ℃ 孵育8 h 后,更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)16 h后吸取細胞培養(yǎng)液并加入適量DAPI,對細胞核染色,最后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。

1.6.2 疫苗免疫 將120只4周齡SPF BALB/c雌鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2～3 d后,隨機分為6組,皮下免疫,具體分組和免疫情況見表2。

1.7 間接ELISA檢測PCV2和GPS特異性抗體

將純化的大腸桿菌表達的PCV2 Cap蛋白或GPS全菌體分別用包被液稀釋成濃度為750 ng·100 μL-1或2×107CFU·100 μL-1,加入96孔高吸附酶標板(100 μL·孔-1),37 ℃孵育1 h后4 ℃孵育12 h。洗滌、拍干孔內(nèi)液體,再加入5%的脫脂牛奶(200 μL·孔-1),37 ℃孵育2 h,洗滌、拍干孔內(nèi)液體,用5%的脫脂牛奶對免疫后采集的血清進行稀釋(1∶1 600),加入酶標板中(100 μL·孔-1),同時設(shè)置陰性對照,37 ℃孵育1 h。洗滌、拍干孔內(nèi)液體,將酶標二抗(HRP-羊抗小鼠IgG)按1∶5 000進行稀釋,加到酶標板中(100 μL·孔-1),37 ℃孵育30 min。避光向酶標板加入TMB顯色液,100 μL·孔-1,室溫反應(yīng)15 min后加入ELISA終止液,50 μL·孔-1。最后使用酶標儀測定酶標板各孔的OD450 nm值。

1.8 血清殺菌試驗

采集兩次免疫7 d后的小鼠血清,用0.22 μm的濾膜過濾除菌,取100 μL的細菌懸液(滅活血清組細菌數(shù)為8×107CFU,未滅活血清組細菌數(shù)為8×108CFU)分別與各組血清混合,37 ℃孵育1 h,將混合物10倍倍比稀釋后取100 μL涂布于培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù),計算血清殺菌率,血清殺菌率=(1-血清處理后活菌數(shù)/初始活菌數(shù))×100%。

1.9 GPS攻毒保護試驗

二免后第14天,各試驗組和PBS對照組的小鼠均采用致死劑量的SH0165菌株(6×109CFU)進行攻毒,每只小鼠腹腔注射200 μL菌液,攻毒后連續(xù)觀察一周,記錄小鼠的發(fā)病狀況和死亡情況,繪制小鼠的生存曲線。

1.10 PCV2中和抗體檢測

PK-15 細胞按2×104·孔-1鋪于 96 孔板;各組小鼠血清于56 ℃,30 min 滅活后用DMEM培養(yǎng)液從 21連續(xù)稀釋至 29;將稀釋后的血清和病毒液等體積混合(50 μL:50 μL),37 ℃孵育 1 h;將血清和病毒的混合液接種于PK-15 細胞,同時設(shè)置PCV2陽性對照和DMEM空白對照,每組重復(fù) 3個孔,繼續(xù)孵育 2 h;吸去混合液,每孔加入200 μL細胞維持液,繼續(xù)培養(yǎng)72 h;過氧化物酶單層細胞試驗:棄去培養(yǎng)液,PBS洗3遍;加入無水乙醇(100 μL·孔-1),室溫固定30 min,PBST洗3遍;加入 ddH2O和甲醇(體積比為1∶9)(100 μL·孔-1),室溫孵育 10 min,PBST 洗 3遍;加入5%的脫脂牛奶(200 μL·孔-1),室溫封閉 2 h,PBST 洗 3 遍;加入PCV2的豬陽性血清(1∶200)(100 μL·孔-1),4 ℃ 孵育過夜,PBST 洗 3 遍;加入 HRP標記的山羊抗豬IgG(1∶5 000)(100 μL·孔-1),37 ℃孵育 1 h,PBST 洗 3 遍;加入100 μL AEC顯色液作用10～20 min,最后置于光學顯微鏡下計數(shù)紅色陽性細胞。結(jié)果判讀:與只接種 PCV2 陽性對照孔相比,將陽性細胞減少≥50%的血清最高稀釋倍數(shù)判定為該血清的中和抗體滴度。

1.11 小鼠臟器病毒載量檢測

二免后第14天采用2×104.5TCID50的PCV2 CHN SC0413毒株進行腹腔攻毒,于攻毒后7 d采集小鼠的肺和淋巴結(jié),根據(jù)TIANGEN 組織/細胞/血液基因組提取試劑盒說明書提取組織中的核酸,用PCV2特異性引物(F:5′-CATCTTCAACACCCGCCTCT-3′,R:5′-GCAGGGCCAGAATTCAACCTT-3′),通過熒光定量PCR檢測病毒載量,反應(yīng)體系:采用20 μL反應(yīng)體系:10 μL qPCR Master Mix,2 μL 模板,上、下游引物各0.4 μL,DEPC水7.2 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃,10 s;60 ℃,30 s共40個循環(huán);熔解曲線為:95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;95 ℃,15 s。

1.12 IFN-γ和IL-12分泌水平檢測

本研究選擇采用IFN-γ和IL-12作為細胞免疫的指標。對二免后7 d分離的各組小鼠血清進行細胞因子IFN-γ和IL-12的測定,參考小鼠細胞因子檢測試劑盒說明書,采用雙抗體夾心ELISA方法測定各免疫組小鼠血清中IFN-γ和IL-12的水平。

1.13 數(shù)據(jù)分析

本研究使用統(tǒng)計軟件SPSS對數(shù)據(jù)進行分析,采用Graphpad Prism 8.1繪圖。數(shù)據(jù)統(tǒng)計為平均值±標準偏差。數(shù)據(jù)分析采用t檢驗分析和單因素方差分析,P<0.05為有統(tǒng)計學意義(差異顯著)。

2 結(jié) 果

2.1 GPS菌影的制備

將109CFU的菌液與NaOH作用后,通過涂板活菌計數(shù)和渾濁度觀察檢測NaOH處理后細菌的存活情況,結(jié)果表明:制備菌影的NaOH最低抑菌濃度為1.25 mg·mL-1,并用該濃度的NaOH作用80 min時未檢測到活菌,即制備菌影的最佳時間為80 min,如圖1所示。

2.2 GPS菌影的鑒定

菌影鑒定結(jié)果顯示,未處理的副豬革拉瑟菌(圖2A)保持完整的桿狀形態(tài);制備的菌影(圖2B)表面形成了跨膜孔道結(jié)構(gòu)(紅色箭頭指向),大部分細菌形態(tài)未發(fā)生明顯改變,保持完整桿狀。檢測菌影基因組排出情況:未處理的GPS基因組保留完整,菌影內(nèi)部基因組逐漸減少,在第80分鐘時基本排盡(圖2C);未處理的GPS上清中無基因組存在,菌影上清檢測到明顯的DNA條帶,由于NaOH對核酸具有裂解作用,上清中的細菌基因組被裂解成了200 bp左右的片段(圖2D)。檢測菌影細胞質(zhì)蛋白排出情況:與未處理的GPS菌體相比,菌影菌體缺乏部分蛋白質(zhì)(紅色箭頭指示活菌與菌影蛋白質(zhì)差異明顯條帶),表明細胞質(zhì)的蛋白成功外排到胞外(圖2E);檢測上清中蛋白質(zhì)的情況(圖2F),未處理的GPS培養(yǎng)上清中未檢測到蛋白質(zhì),而菌影培養(yǎng)的上清中檢測到不同大小的蛋白條帶,表明在NaOH處理后由于細胞質(zhì)與外界培養(yǎng)液之間的滲透壓,細胞質(zhì)中的蛋白外排到上清中。

A.副豬革拉瑟菌掃描電鏡圖;B.副豬革拉瑟菌菌影掃描電鏡圖;C.在第20、40、60和80分鐘提取菌體基因組的電泳圖(1～4.未處理的GPS;5～8.菌影;M.DNA相對分子質(zhì)量標準);D.在第20、40、60和80分鐘提取上清基因組的電泳圖(1～4.未處理的GPS;5～8.菌影;M.DNA相對分子質(zhì)量標準);E.第80分鐘提取菌體總蛋白的SDS-PAGE(1.未處理的GPS;2.菌影;M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準);F.第80分鐘提取上清總蛋白的SDS-PAGE(1.未處理的GPS;2.菌影;M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準)A. Scanning electron micrograph of G.parasuis; B. Scanning electron micrograph of G.parasuis ghosts; C. 1% Agarose gel electrophoretic analysis of bacterial genome extracted at the 20th, 40th, 60th and 80th minute (lanes 1-4. Untreated G.parasuis; lanes 5-8. BGs; M. 5 kb marker ladder); D. 1% Agarose gel electrophoretic analysis of supernatant genome extracted at the 20th, 40th, 60th and 80th minute (lanes 1-4. Untreated G.parasuis; lanes 5-8. BGs; M. 5 kb marker ladder); E. 12% SDS-PAGE analysis of total proteins extracted from culture pellets at 80th minutes; F. 12% SDS-PAGE analysis of total proteins extracted from culture supernatants at the 80th minute. (lane 1. Untreated G.parasuis; lane 2. BGs; M. Protein marker)

2.3 GPS菌影誘導(dǎo)RAW264.7細胞因子的轉(zhuǎn)錄

通過熒光定量PCR檢測LPS、GPS和BG分別與RAW264.7細胞共孵育3、6和9 h后細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果如圖3所示,促炎性細胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α,抗炎性細胞因子IL-10以及促炎性細胞因子誘導(dǎo)的iNOS的轉(zhuǎn)錄水平均顯著提高,表明菌影和GPS均能激活巨噬細胞分泌促炎和抗炎細胞因子,菌影能夠產(chǎn)生與活菌相似的先天性免疫激活反應(yīng)。

*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;****. P<0.000 1,P值表示各組與對照組的差異性,ns表示無顯著差異*. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1, P value indicates the difference between experimental groups and control group. ns means no significant difference

2.4 重組質(zhì)粒pEGFP-ORF2的構(gòu)建與過表達鑒定

結(jié)果顯示,將PCV2 ORF2基因片段擴增純化后,在699 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖4A),與pEGFP-N1質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,將鑒定成功的陽性菌液抽取質(zhì)粒后進行雙酶切鑒定,在4 700和699 bp處有兩條清晰條帶(圖4B),將質(zhì)粒送往有康生物科技有限公司進行測序,測序比對結(jié)果正確;pEGFP-ORF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293 T細胞后,WB鑒定結(jié)果如圖4C所示,泳道1在53 ku左右有特異性目的條帶,表明pEGFP-ORF2表達成功。

2.5 PCV2-GPS二聯(lián)菌影疫苗制備與鑒定

結(jié)果如圖5,pEGFP-ORF2裝載入GPS菌影(pEGFP-ORF2→BG)轉(zhuǎn)染后的大部分RAW264.7細胞中觀察到較強綠色熒光信號,少部分細胞內(nèi)熒光強度較弱;而pEGFP-ORF2組和MOCK組中RAW264.7細胞未見綠色熒光,說明菌影裝載的pEGFP-ORF2在RAW264.7細胞中成功表達,表明PCV2-GPS二聯(lián)菌影疫苗構(gòu)建成功。

圖5 RAW264.7細胞綠色熒光觀察(200×)Fig.5 Green fluorescence observation of RAW264.7 cells(200×)

2.6 PCV2和GPS的IgG抗體檢測

每次免疫7 d后的小鼠血清采用間接ELISA方法測定血清中特異性IgG抗體水平。結(jié)果如圖6所示,免疫組GPS的抗體水平與PBS組相比(圖6A),小鼠血清中特異性IgG抗體水平顯著增高,且在二免后呈增長現(xiàn)象,商品化疫苗組、二聯(lián)菌影疫苗組和菌影單苗組三組的水平無顯著差異。免疫組PCV2的抗體水平與PBS組相比(圖6B),商品化疫苗組和二聯(lián)菌影疫苗組測定的Cap蛋白抗體水平顯著提高,而質(zhì)粒單苗組的抗體水平在一免后7 d與PBS組相比沒有顯著差異,在二免后顯著提高。

A.GPS;B.PCV2。*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;****. P<0.000 1,P值表示各組與PBS組的差異性,ns表示無顯著差異A.GPS;B.PCV2.*. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1, P value indicates the difference between experimental groups and PBS group. ns means no significant difference

2.7 血清殺菌試驗

檢測各組小鼠的血清對GPS的殺菌活性,結(jié)果顯示:未滅活血清組(圖7A)中,商品化疫苗組在一免后對GPS的平均殺菌率達到97.70%,二免后達到99.29%,二聯(lián)菌影疫苗組和菌影單苗組一免后對GPS的平均殺菌率分別為74.47%和67.62%,二免后達到91.72%和88.04%,PBS組的陰性血清兩次免疫后對GPS的平均殺菌率分別為25.48%和32.83%。滅活血清組(圖7B)中,商品化疫苗組在一免后對GPS的平均殺菌率達到64.58%,二免后達到87.79%,二聯(lián)菌影疫苗組和菌影單苗組一免后對GPS的平均殺菌率分別為27.92%和29.70%,二免后分別達到70.34%和66.29%,PBS組的陰性血清兩次免疫后對GPS的平均殺菌率分別為12.92%和23.53%。

A. 未滅活血清;B. 滅活血清。*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;****. P<0.000 1,P值表示各組與PBS組的差異性A. Uninactivated serum; B. Inactivated serum. *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1, P value indicates the difference between experimental groups and PBS group

2.8 GPS攻毒保護試驗

采用致死劑量的SH0165菌株腹腔攻毒,小鼠生存曲線如圖8,PBS組所有小鼠均在12 h內(nèi)死亡,病程短,發(fā)病急;商品化疫苗組存活率為90%(9/10),二聯(lián)菌影疫苗組和菌影單苗組的小鼠存活率均為70%(7/10)。

圖8 小鼠的生存曲線Fig.8 The Survival rate of mice

2.9 PCV2中和抗體檢測

分別檢測各組小鼠首免后第7天和二免后第7、第14天血清中 PCV2 中和抗體水平,結(jié)果見圖9:首免后第7 天、二免后第7天中和抗體水平為商品化疫苗組和二聯(lián)菌影疫苗組最高且沒有顯著差異,均大于質(zhì)粒單苗組,而PBS組未檢測到PCV2中和抗體,二免后第14天中和抗體水平從高到低依次為商品化疫苗組、二聯(lián)菌影疫苗組、質(zhì)粒單苗組,PBS組未檢測到PCV2中和抗體。

不同字母(a、b和c)代表相同時間點各組間差異顯著(P<0.05),ND表示沒有檢測到中和抗體Different letters (a, b and c) represent statistically significant differences between the indicated groups at the same time point (P<0.05). ND indicates that neutralization antibody is not detected

2.10 小鼠臟器病毒載量檢測

PCV2攻毒小鼠后在第7 d采集小鼠的淋巴結(jié)、肺,檢測各組小鼠組織臟器中的病毒載量,結(jié)果如圖10所示,商品化疫苗組和二聯(lián)菌影疫苗組小鼠淋巴結(jié)和肺病毒載量與PBS組相比均顯著降低。

A.淋巴結(jié);B.肺。*. P<0.05;**. P<0.01;P值表示各組與空白組的差異性,ns表示無顯著差異A.Lymphnode;B.Lung. *. P<0.05; **. P<0.01; P value indicates the difference between experimental groups and blank group. ns means no significant difference

2.11 IFN-γ和IL-12分泌水平檢測

測定各組小鼠血清中IFN-γ和IL-12的水平,結(jié)果見圖11,二聯(lián)菌影疫苗組小鼠血清中分泌了高水平的IFN-γ,商品化疫苗組小鼠血清中IL-12水平較高,其它組與空白組小鼠相比,沒有顯著性差異,表明PCV2-GPS二聯(lián)菌影疫苗能夠通過Th1型免疫反應(yīng)分泌IFN-γ來激活細胞免疫,且與商品化疫苗激活的細胞免疫的機制存在差異。

*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;P值表示各組與PBS組的差異性*. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; P value indicates the difference between experimental groups and PBS group

3 討 論

隨著現(xiàn)代養(yǎng)豬場的規(guī)?；图s化,PCV2和GPS?；旌细腥?對二者的防控壓力巨大,目前,關(guān)于PCV2和GPS聯(lián)合疫苗的研究報道較少,隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展,減抗限抗政策的實施,因此為了減少豬群免疫壓力、促進豬的生長發(fā)育健康、提升豬場養(yǎng)殖效益,研發(fā)新型安全高效的PCV2、GPS聯(lián)合疫苗具有重要意義。

本研究選擇NaOH制備GPS菌影疫苗,相較于傳統(tǒng)的甲醛滅活,NaOH滅活更加溫和,抗原保持更完整,安全性也更高,是制備菌影的最佳化合物之一[21]。副豬革拉瑟菌5型是國內(nèi)主要流行的血清型[22],因此選擇5型高毒力菌株SH0165作為疫苗株,同時SH0165作為常用的模式菌株,對其毒力和免疫原性的研究非常廣泛,已知SH0165菌株的多種外膜蛋白對小鼠或仔豬均能產(chǎn)生較好的保護作用[23-24],而菌影保留了完整的細菌外膜,且沒有細菌內(nèi)部無效抗原的干擾,能夠誘導(dǎo)更高水平的中和抗體。DNA疫苗能夠引發(fā)細胞毒性T細胞應(yīng)答,還可以激活B細胞產(chǎn)生抗體,誘導(dǎo)機體的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答[25]。本研究采用皮下免疫,通過菌影遞送DNA疫苗的方式,使其不會受到皮下DNA酶的影響,使DNA疫苗在機體內(nèi)緩慢釋放,持續(xù)刺激機體的免疫應(yīng)答。佐劑是疫苗重要的組成部分,常用的豬用疫苗佐劑包括油性佐劑和水佐劑等[26],本研究未使用佐劑,因為菌影具有佐劑特性,將菌影作為pEGFP-ORF2核酸疫苗的載體,不僅彌補了DNA疫苗免疫效果差的缺陷,同時也降低了疫苗成本。

在評價二聯(lián)菌影疫苗針對PCV2的免疫保護效果中,免疫PCV2-GPS二聯(lián)菌影疫苗的小鼠PCV2血清IgG抗體水平和中和抗體水平都優(yōu)于單獨免疫pEGFP-ORF2質(zhì)粒,攻毒后的病毒載量也低于PBS攻毒組,說明菌影作為pEGFP-ORF2的載體增強了其免疫保護效果,但免疫效果略低于商品化疫苗,分析其原因:1.通過基因序列比對分析,商品化疫苗的PCV2疫苗株SH株與本研究的PCV2 CHN SC0413分離株基因序列略有差異,其中全基因序列差異性有0.8%,ORF2基因序列差異性有1.1%,兩者在基因上的微弱差異可能是導(dǎo)致二聯(lián)菌影疫苗保護效果略低于商品化疫苗的原因;2.二者是不同類型的疫苗(商品化為滅活苗,本研究為核酸疫苗),選擇免疫劑量的標準不同,使其在體內(nèi)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)程度不同,導(dǎo)致最后呈現(xiàn)的保護效果略有差異。免疫二聯(lián)菌影疫苗的小鼠血清中IFN-γ的水平顯著上調(diào),IFN-γ是疫苗誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的重要因子,也在誘導(dǎo)抗病毒免疫中起著重要作用[27]。而商品化疫苗組IL-12顯著上調(diào),IFN-γ沒有顯著變化,說明二聯(lián)菌影疫苗通過Th1型免疫反應(yīng)分泌IFN-γ來激活細胞免疫,且與商品化疫苗激活的細胞免疫的機制存在差異。在評價針對GPS的免疫保護效果中,二聯(lián)菌影疫苗的免疫效果稍遜于商品化疫苗,因為二聯(lián)菌影疫苗未使用佐劑,而商品化疫苗采用了水佐劑,佐劑增強了商品化疫苗的免疫保護效果,因此在采用5型高毒力菌株攻毒后,商品化疫苗為小鼠提供了更好的保護?？偟膩碚f,PCV2-GPS二聯(lián)菌影疫苗對感染PCV2和GPS的小鼠能夠提供較好的免疫保護,但在豬體上的免疫保護作用還有待驗證,因此本研究后續(xù)會持續(xù)優(yōu)化該疫苗的制備工藝、免疫方式等因素,并在豬體上開展相關(guān)試驗的研究。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建PCV2-GPS二聯(lián)菌影疫苗,并用此苗在BALB/c小鼠模型上進行免疫和攻毒保護試驗,證明該苗顯著激活了小鼠對PCV2和GPS的體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng),且能夠抑制PCV2在小鼠體內(nèi)的增殖,對感染GPS的小鼠達到較好的保護效果。