魯遠(yuǎn) 冒霞 王超 孫娥 鄭艷 左存武

摘 要 此前從東北山荊子（Malus baccata）中發(fā)現(xiàn)可能參與腐爛病信號響應(yīng)的WAK基因? MbLRK10L1.1，在此基礎(chǔ)上，擬結(jié)合生物信息學(xué)分析、表達(dá)分析和功能驗證研究其在腐爛病抗性中的作用機(jī)制。結(jié)果表明，? MbLRK10L1.1響應(yīng)Valsa mali（Vm）信號，并且在瞬時表達(dá) MbLRK10L1.1后，‘煙富6號果實表面病斑擴(kuò)散速率明顯減小，? FRK1（Flg22-induced Receptor-like Kinase 1）、TaNOX（Triticum aestivum NADPH oxidase）、? EDS1（Enhanced disease susceptibility 1）等相關(guān)抗病基因均有不同程度的上調(diào)表達(dá)。表明? MbLRK10L1.1可通過JA、SA、SAR以及PTI等途徑正調(diào)控果實對腐爛病菌的抗性。

關(guān)鍵詞 腐爛?。╒alsa canker）；WAK基因；瞬時表達(dá)標(biāo)記基因

由黑腐皮殼菌（Valsa mali，Vm）引起的腐爛?。╒alsa canker）是中國乃至亞洲蘋果產(chǎn)區(qū)最為嚴(yán)重的真菌型病害之一，主要危害枝干、果實等組織，導(dǎo)致產(chǎn)量和果實品質(zhì)下降[1]。隨著蘋果種植面積不斷擴(kuò)大，腐爛病成為制約國內(nèi)蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一 [2]。目前提倡將農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治相結(jié)合的綜合防控措施，但大面積推廣受到抗病品種少、易復(fù)發(fā)、勞動力投入成本高等因素的限制[3]。長期以來，抗病育種是有效防控該病害最長久、高效、環(huán)保的措施之一，而鑒定抗病基因可以加快抗病育種進(jìn)程。

細(xì)胞壁相關(guān)類受體激酶（Wall-associated kinases， WAK）是植物的類受體激酶（ Receptor-like kinases， RLKs）中一類重要的亞家族，N末端存在類表皮生長因子型（epidermal growth factorlike， EGF）結(jié)構(gòu)域[4]。WAK部分成員與細(xì)胞壁中的果膠共價結(jié)合，在激發(fā)植物免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用[5]。擬南芥基因組包括5個WAK基因（ WAK1～? WAK5），? AtWAK1是第一個被鑒定的植物WAK，可識別寡聚半乳糖苷，進(jìn)而激活防御反應(yīng)[6]。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）可增加海島棉? GbWAK3的轉(zhuǎn)錄，從而提高棉花對黃萎病菌的抗性[7]。此后，在水稻和煙草中都發(fā)現(xiàn)WAK家族基因的同源基因，其激活免疫反應(yīng)并參與寄主對多種病原物抗性的調(diào)控[8]。

當(dāng)植物激活免疫反應(yīng)時，會產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species， ROS）、激活有絲分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase， MAPK）級聯(lián)、細(xì)胞壁上的胼胝質(zhì)（Callose）沉積以及免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[9]。茉莉酸（Jasmonic acid， JA）和水楊酸（Salicylic acid， SA）作為植物中與防御有關(guān)的重要信號分子，在病原體侵染時，植物細(xì)胞中JA和SA水平的增加，從而誘導(dǎo)相關(guān)抗病基因轉(zhuǎn)錄[10]。由輔因子 NPR1（Nonexpressor of? pathogenesis related genes 1）調(diào)節(jié)的系統(tǒng)獲得抗性（Systemic acquired resistance， SAR）由病菌局部侵染激活，在受侵部位產(chǎn)生系統(tǒng)信號，轉(zhuǎn)運(yùn)到未受侵部位，激活防衛(wèi)反應(yīng)，從而產(chǎn)生對多種病菌的抗病反應(yīng)[11]。在植物觸發(fā)免疫反應(yīng)時，與免疫相關(guān)的標(biāo)記基因（亦稱為Marker基因）的表達(dá)量顯著升高。因此，分析不同代謝通路Marker基因可快速、方便地檢測是否激發(fā)抗性反應(yīng)。

山荊子（Malus baccata）是北方蘋果產(chǎn)區(qū)廣泛應(yīng)用的砧木之一，對多種生物和非生物脅迫具有較強(qiáng)適應(yīng)能力，對腐爛病亦具較強(qiáng)抗性[12]。前期工作中，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，鑒定出一個可能調(diào)控腐爛病抗性的基因? MbLRK10L1.1。基于此，本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析、瞬時表達(dá)驗證及標(biāo)記基因（Marker基因）表達(dá)分析等多種技術(shù)手段，以期明確? MbLRK10L1.1對腐爛病抗性的作用及可能的作用機(jī)制，為抗病基因的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病菌、材料及細(xì)胞系 腐爛病菌（Valsa mali，Vm）菌株Vm-A-019分離自甘肅靜寧發(fā)病‘富士蘋果樹韌皮組織，經(jīng)單孢分離獲得，對‘長富2號具有強(qiáng)致病力，經(jīng)ITS序列測定確定為Vm。東北山荊子組織材料由國家果樹種質(zhì)興城蘋果圃提供，其懸浮細(xì)胞通過幼嫩葉片誘導(dǎo)后懸浮培養(yǎng)獲得，經(jīng)多次繼代后，細(xì)胞松散、顏色淡黃、活力良好且狀態(tài)穩(wěn)定。生長培養(yǎng)基（MS）為M519（PhytoTech Labs，美國）。

1.1.2 菌株、載體和試劑 大腸桿菌感受態(tài)TreliefTM 5SymbolaA@購買自擎科生物科技有限公司（北京），農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，克隆載體pMDTM19-T均購買自TaKaRa（北京）。表達(dá)載體pFGC5941與pBI121均保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹分子生物學(xué)實驗室。柱式植物RNA out（含DNA酶）試劑盒購買自天恩澤基因科技有限公司（北京）。Evo M-MLV RT-PCR試劑盒、LA-Taq酶、Evo-M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒、Steady Pure質(zhì)粒DNA提取試劑盒、Steady Pure DNA凝膠回收試劑盒、DNA連接試劑盒均購自艾科瑞生物科技有限公司（湖南）。核酸內(nèi)切酶AscⅠ和AvrⅡ購自Thermo scientific公司（美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 山荊子和蘋果WAKs的CDS和蛋白序列均下載自薔薇科基因組在線數(shù)據(jù)庫GDR（Genome Database of Rosaceae species， GDR; https：//www.rosaceae.org/species/malus/all）。擬南芥WAKs蛋白序列下載自擬南芥在線數(shù)據(jù)資源庫（Arabidopsis? information resource， TAIR; http：//www.arabidopsis.org）。利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對，并用進(jìn)化分析軟件MEGA5.0 （http：//www.megasoftware.net/），以鄰接法（Neighb or-joining method）構(gòu)建進(jìn)化樹，執(zhí)行參數(shù)為p-distance模式（p-distance）、部分刪除（Partical deletion）、有根樹設(shè)置1 000次重復(fù)（Bootstrap replicated?? 1 000）。 MbLRK10L1.1的結(jié)構(gòu)域組成、理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測分析分別利用在線軟件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）、ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/）和WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進(jìn)行。啟動子區(qū)域（起始密碼子上游3 000 bp）的順式作用元件（cis-element）在PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中分析。

1.2.2 蘋果腐爛病代謝物收集及細(xì)胞處理 將Vm-A-019菌株接種至PDA（Potato? dextrose agar）培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)72 h后，取10個菌餅接種至100 mL PDB（Potato dextrose broth）培養(yǎng)基，黑暗、靜置培養(yǎng)72 h（每隔12 h震蕩1次），經(jīng)離心和過濾除菌，獲得菌株代謝物原液。利用40目細(xì)胞過濾篩收集小的東北山荊子細(xì)胞團(tuán)，并將500? μL細(xì)胞（密實體積）轉(zhuǎn)入至16 mL MS液體培養(yǎng)基，25? ℃、130 r/min搖床黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)? 48 h后，加入4 mL 菌株代謝物（VmM），分別于0、1、3 和6 h后收集懸浮細(xì)胞，速凍后-80 ℃保存，備用。

1.2.3 基因克隆和載體構(gòu)建 利用軟件Primer Premier 5設(shè)計 MbLRK10L1.1全長序列擴(kuò)增的引物（1.1F：5′-CTGGCGCGCCATGCCTACCCATTTTCTCCTAAAAC-3′；1.1 R：5′- TCCCTAGGTTACGGCGGAGAACGAATAAGT- TTAC- 3′），送至通用生物股份有限公司（安徽）合成。利用柱式植物RNA out（含DNA酶）試劑盒提取山荊子懸浮細(xì)胞的總RNA，經(jīng)Evo M-MLV RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以該cDNA為模板，利用LA-Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：cDNA模板1?? μL；LA-Taq酶 10? μL；上下游引物（均為10? μmol/L）各1? μL；加水至總體積20? μL。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物回收步驟參考Steady Pure DNA凝膠回收試劑盒。將上述膠回收的片段連接到pMDTM19-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TreliefTM 5α。挑取陽性克隆于? 1 mL? LB培養(yǎng)基中[含氨芐青霉素（Amp），100 mg/L]，? 37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)12 h?；罨蟮木核椭辽虾Ｉど锕こ逃邢薰緶y序。將堿基無錯配的菌液擴(kuò)繁后用Steady Pure質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)AscⅠ與Avr Ⅱ酶切獲得 MbLRK10L1.1基因片段。參考DNA連接試劑盒將酶切后的? MbLRK10L1.1基因片段與表達(dá)載體pFGC5941進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒（pFGC5941- MbLRK10L1.1）后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，涂布于LB固體培養(yǎng)基上[含卡納青霉素（Kana）100 mg/L，利福平（Rif）37.5?? mg/L]，28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h后挑取陽性克隆，經(jīng)PCR驗證獲得陽性單克隆農(nóng)桿菌，擴(kuò)繁后-20 ℃保存，備用。

1.2.4 果實瞬時表達(dá)分析 將分別攜帶pFGC5941- MbLRK10L1.1、pFGC5941和pBI121的農(nóng)桿菌菌株活化后，利用農(nóng)桿菌滲入法在‘煙富6號果實（花后180 d）瞬時表達(dá)，方法參考Mao等[13]的報道。將活化后的農(nóng)桿菌菌株用MES-KOH重懸，于4? ℃靜置4 h，用1次性無菌針頭吸取0.2 mL菌液注射進(jìn)蘋果果實，25? ℃培養(yǎng)3 d后用GUS染色液（索萊寶，北京）對注射pBI121菌液的果肉進(jìn)行染色。當(dāng)果肉呈現(xiàn)藍(lán)色，表明基因成功瞬時表達(dá)。之后在注射菌液的部位接種已活化的Vm，于25 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)暗培養(yǎng)，每隔12 h測量1次果實病斑。同時，于Vm處理0、3、6和12 h時收集接種部位的果肉樣品，速凍后-80 ℃保存，用于Marker基因的表達(dá)模式分析。以上試驗設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 基因表達(dá)分析 利用柱式植物RNA out（含DNA酶）試劑盒（北京）提取各樣品總RNA，經(jīng)凝膠電泳質(zhì)量檢測合格后利用的Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ（湖南）合成用于RT-qPCR的cDNA。利用在線軟件Primer 3.0（http：∥primer3.ut.ee/）設(shè)計引物，Actin引物采用Zuo等[14]的報道，抗性反應(yīng)相關(guān)Marker基因引物參考孫娥等[15]的報道（表1）。

1.2.6 統(tǒng)計分析 原始數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2010軟件，利用2-△△CT計算基因的相對表達(dá)量，利用t-test（P<0.05）分析差異顯著性，將處理好的數(shù)據(jù)利用OriginPro 8.0進(jìn)行圖形可? 視化。

2 結(jié)果與分析

2.1? MbLRK10L1.1生物信息學(xué)分析

對 MbLRK10L1.1的基本參數(shù)分析表明，其氨基酸序列大小為660、分子質(zhì)量為74.92 ku、理論等電點為5.42、位于質(zhì)膜。結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析顯示，? MbLRK10L1.1具有WAK_assoc胞外結(jié)構(gòu)域，完整的跨膜區(qū)和S_TKC激酶結(jié)構(gòu)域，為WAK亞家族成員（圖1-A）。利用山荊子、蘋果和擬南芥中WAKs的蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn) MbLRK10L1.1（基因ID：MABA023866）與蘋果 MD14G1228700、 MD06G1218900，擬南芥 ATLRK10L1.1（基因ID：AT1G18390）親緣關(guān)系最近，命名為 MbLRK10L1.1（圖1-B）。對MbLRK10L1.1、MD14G1228700、MD06G1218900和ATLRK10L1.1的蛋白序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，MbLRK10L1.1與MD14G1228700、MD06G1218900、ATLRK10L1.1的序列相似度分別為94.82%、64.17%、43.72%（圖1-C）。說明 MD14G1228700是 MbLRK10L1.1在蘋果中的同源基因， ATLRK10L1.1是 MbLRK10L1.1在擬南芥中同源基因。 ATLRK10L1.1是編碼擬南芥葉銹病10號抗病位點受體樣蛋白激酶基因[16]，但 MbLRK10L1.1與? ATLRK10L1.1序列相似度較低，推測? MbLRK10L1.1可能存在不同功能。

2.2 MbLRK10L1.1上游啟動子區(qū)域存在響應(yīng)逆境信號的順式作用元件

為進(jìn)一步研究? MbLRK10L1.1的功能，分析了其啟動子區(qū)域（基因上游3 000 bp）存在的順式作用元件（cis-element）。如表2所示，在該基因啟動子區(qū)域含有較多的cis-element，包括9個響應(yīng)脫落酸（ABA）元件、4個響應(yīng)茉莉酸甲酯（MeJA）元件、2個厭氧誘導(dǎo)元件、2個參與玉米醇溶蛋白（Zein）代謝調(diào)節(jié)元件和17個參與光照響應(yīng)元件。

2.3 MbLRK10L1.1組織特異性分析

為研究? MbLRK10L1.1在山荊子不同組織中的表達(dá)模式，通過RT-qPCR分析該基因在不同組織中的表達(dá)模式（圖2）。結(jié)果表明， MbLRK10L1.1在根組織中的表達(dá)量最高，為各組織表達(dá)量平均值的6.6倍，其次為1 a生枝，略高于平均值，在2 a生枝、老根和功能葉中的表達(dá)量最低。

2.4? MbLRK10L1.1響應(yīng)腐爛病信號的表達(dá)分析

從前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取? MbLRK10L1.1在山荊子懸浮細(xì)胞響應(yīng)腐爛病代謝物（VmM）前后的表達(dá)數(shù)據(jù)[17]。對照細(xì)胞中，該基因的FPKM（Fragments? per? kilobase of exon model per? million mapped fragments）值為211，處理1、3和6 h后，分別上調(diào)至398、416和433（圖3-A）。利用RT-qPCR分析相同條件下該基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該基因在響應(yīng)VmM過程中顯著上調(diào)表達(dá)。在處理1、3和6 h后分別上調(diào)表達(dá)至對照的3.2、? 2.7和3.1倍（圖3-B）。表明? MbLRK10L1.1可能參與VmM信號的響應(yīng)。

2.5 載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

以山荊子總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，加入? MbLRK10L1.1基因特異性引物和LA-Taq酶，經(jīng) PCR擴(kuò)增后得到產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小約為2 049 bp（圖4-A），與目的基因片段大小一致。將上述PCR產(chǎn)物回收后與pMDTM19-T連接，經(jīng)酶切（圖4-B）和測序雙重驗證后，回收雙酶切目的片段并構(gòu)建重組質(zhì)粒pFGC5941-MbLRK10L1.1，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，得陽性克?。▓D4-C），大小為? 2 049 bp與預(yù)期相符，表明成功將? MbLRK10L1.1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

2.6 果實瞬時表達(dá)

2.6.1 果實瞬時表達(dá)MbLRK10L1.1基因的表達(dá)量 果實中分別注射攜帶重組質(zhì)粒（pFGC5941- MbLRK10L1.1）、空載體pFGC5941和pBI121的農(nóng)桿菌。于注射72 h后，注射攜帶pBI121載體的農(nóng)桿菌的果實可成功被GUS染色液標(biāo)記至藍(lán)色，表明在該條件下GUS基因成功表達(dá)（圖5-A）。此后，用RT-qPCR測定各處理果實中目標(biāo)基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)注射攜帶重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌的果實中? MbLRK10L1.1的表達(dá)量上升至對照（pFGC5941）的17倍（圖5-B），表明 MbLRK10L1.1在果實中成功瞬時表達(dá)。

2.6.2?? MbLRK10L1.1正調(diào)控蘋果腐爛病 為驗證? MbLRK10L1.1對蘋果腐爛病的調(diào)控作用，在注射部位分別接種Vm，于不同時間點統(tǒng)計病斑直徑。接種24 h時，? MbLRK10L1.1對Vm的調(diào)控作用不顯著，此后 MbLRK10L1.1瞬時表達(dá)果實的病斑直徑小于對照果實。接種36、48、60、72和84 h時，瞬時表達(dá)果實的病斑直徑分別為8.2、9.8、11.3、13.4、18.5 mm，而對照的則分別為8.9、11.6、14.3、17.5、21.6 mm（圖6-C）。于接種72 h拍照記錄， MbLRK10L1.1瞬時表達(dá)部位的病斑（圖6-B）顯著小于對照部位（pFGC5941）（圖6-A）。以上結(jié)果表明， MbLRK10L1.1瞬時表達(dá)增強(qiáng)了蘋果果實對腐爛病的抗性。

2.7 果實瞬時表達(dá)后相關(guān)通路Marker基因表達(dá)量的測定

為進(jìn)一步了解? MbLRK10L1.1調(diào)控腐爛病的機(jī)制，使用RT-qPCR檢測抗性相關(guān)通路Marker基因的表達(dá)模式。如圖7所示，與對照果實相比，接種Vm后，瞬時表達(dá)? MbLRK10L1.1果實中參與PTI、ROS、R蛋白、SA、SAR和JA信號通路的Marker基因? FRK1（Flg22-induced receptor-like kinase 1）、TaNOX （Triticum aestivum NADPH oxidase）、? EDS1（Enhanced disease susceptibility 1）、 PR4（Pathogenesis-Related 4）、 CHN50（LOC107826794）和 LOX1（Lipoxygenase 1）的表達(dá)量都呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)。其中， LOX1（圖7-F）的上調(diào)表達(dá)最為明顯，在Vm處理6和12 h時，分別上調(diào)至對照的1.7和4.6倍。其次?? PR4（圖7-D）和? CHN50（圖7-E）在Vm處理6和12 h時，分別上調(diào)至對照的1.5、3.5倍以及1.4、3.4倍。此外，? FRK1（圖7-A）、TaNOX（圖7-B）和? EDS1（圖7-C）均在Vm處理12 h明顯上調(diào)，分別上調(diào)至對照的1.7、2.1和2.2倍。以上結(jié)果表明， MbLRK10L1.1瞬時表達(dá)后可激活PTI、ROS、R蛋白、SA、SAR和JA等多種抗性相關(guān)的信號通路。

3 討論與結(jié)論

WAKs在植物中的表達(dá)會受到生物和非生物脅迫的影響，并參與細(xì)胞伸長及對鹽堿、重金屬和病原菌等多種逆境信號響應(yīng)[18]。在擬南芥、水稻和番茄等模式植物中研究較為廣泛。例如： OsWAK1與胞壁相關(guān)聯(lián)，受稻瘟病誘導(dǎo)表達(dá)，并且受水楊酸、茉莉酸的誘導(dǎo)[19]。番茄中 SlWAK1能加強(qiáng)植株對番茄假單胞桿菌抗性[20]。但WAKs在蘋果等非模式植物中研究較少。本試驗通過對前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)山荊子WAK家族成員? MbLRK10L1.1能響應(yīng)腐爛病信號，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，果實瞬時表達(dá)以及RT-qPCR等技術(shù)，初步研究? MbLRK10L1.1在Vm處理后的抗病機(jī)制。

病原微生物侵害初期，位于細(xì)胞膜上的模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）通過識別外源病原物/損傷相關(guān)分子模式（Pathogen/damage-associated molecular pattern， PAMP/DAMP）而觸發(fā)基礎(chǔ)免疫反應(yīng)，也稱PAMP觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI）[21]。? EDS1作為一種重要的防衛(wèi)基因，在植物觸發(fā)PTI反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)活性氧爆發(fā)、SA和JA通路的信號傳導(dǎo)[22]。? FRK1作用于MPK3（Mitogen-activated protein kinases 3 ）的下游，在PAMP/DAMP處理后的早期時間點被誘導(dǎo)[23]。在植物PTI反應(yīng)初期，植物體內(nèi)的ROS含量升高，NADPH氧化酶（NADPH oxidase， NOX）作為植物ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵酶之一，其家族成員的轉(zhuǎn)錄增加，在植物抗逆響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[24]。在本試驗中，瞬時表達(dá)? MbLRK10L1.1可以一定程度上激活? EDS1、? FRK1以及TaNOX的表達(dá)，表明? MbLRK10L1.1可以通過激活植物的PTI反應(yīng)抵御腐爛病菌的? 侵染。

SA和JA在植物防御中起著極其重要的作用，是植物防御反應(yīng)中重要的信號分子，但二者存在不同的機(jī)制。目前已經(jīng)在許多植物中發(fā)現(xiàn)JA和SA之間存在相互拮抗作用。研究表明，SA信號途徑主要調(diào)控植物抵御寄生菌的侵染，JA信號途徑則主要介導(dǎo)腐生菌的侵染[25]。苯內(nèi)氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Phenylalaninammo-nialyase，PAL）是SA合成過程中的關(guān)鍵酶之一，在煙草中過量表達(dá)PAL后植株體內(nèi)SA含量升高的同時JA含量卻下降[26]。JA信號通路也能夠抑制SA信號通路。在臭氧誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中，JA能通過抑制SA的生物合成從而減弱由SA引起的細(xì)胞死亡[27]。但當(dāng)SA和JA的濃度不同，這種拮抗作用也會轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同作用，例如：對煙草幼苗施加SA和JA的混合液后，誘導(dǎo)的SA相關(guān)基因的表達(dá)量會比單獨施加SA的高[28]。本試驗表明，在Vm處理后，? MbLRK10L1.1既能激活JA信號通路基因的表達(dá)，也能激活SA信號通路基因的表達(dá)。表明? MbLRK10L1.1可通過參與JA和SA通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抵御腐爛病的侵染。

綜上，在Vm處理下能激活 MbLRK10L1.1的表達(dá)，并且瞬時表達(dá)? MbLRK10L1.1能增強(qiáng)蘋果果實對腐爛病的抵抗，同時也激活PTI、JA和SA等相關(guān)抗性通路。

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Gene? MbLRK10L1.1 Positively Regulates Valsa Canker? in Malus baccata

Abstract Valsa canker? caused by Valsa mali （Vm） is a prevalent fungal disease affecting the apple industry.Wall-associated kinases （WAKs） play an important role in cell proliferation，growth and development，pathogen resistance and other physiological responses in plants.In the previous work，we?? identified the WAK genes， MbLRK10L1.1，from Malus baccata，which is potentially associated with the response to Vm infection.On this basis，this study integrated bioinformatics analysis，expression?? analysis and functional validation to elucidate the molecular mechanism underlying the involvement of?? MbLRK10L1.1? in the response to Vm.The results showed that? MbLRK10L1.1 responded to the Vm signaling，and overexpression of? MbLRK10L1.1? significantly reduced the rate of lesion spread on the fruit surface.The upregulation of disease resistance-related genes such as? FRK1（Flg22-induced Receptor-like Kinase 1），TaNOX （Triticum aestivum NADPH Oxidase），? EDS1（Enhanced Disease Susceptibility 1） and others were observed.The above results indicated that the gene （ MbLRK10L1.1） could positively regulate the resistance of apple to the Valsa? canker through JA，SA，SAR，and PTI pathways.

Key words Valsa canker; WAK gene; Transient expression; Marker gene