王霞 劉艷 賈秀秀 方強恩

摘 要 為準確鑒定矩鐮莢苜蓿（Medicago? archiducis-nicolai）及其近緣種花苜蓿（M.ruthenica ）、闊莢苜蓿（M.platycarpos ）和毛莢苜蓿（M.edgeworthii? ），利用DNA條形碼技術(shù)對4個物種的ITS2序列進行注釋、比對、檢驗，計算種內(nèi)種間遺傳距離，鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過RNAfold? web? server預(yù)測4個近緣種的ITS2二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，矩鐮莢苜蓿及其近緣種的ITS2序列長度為220～221 bp，穩(wěn)定性好；種間遺傳距離（0.004 55～0.022 73）明顯大于種內(nèi)遺傳距離（均為0），存在明顯的“Barcoding? Gap”區(qū)域；NJ系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，毛莢苜蓿聚為一支，矩鐮莢苜蓿、花苜蓿和闊莢苜蓿聚為另一支，然后矩鐮莢苜蓿與闊莢苜蓿又各自形成單系；在二級結(jié)構(gòu)中，矩鐮莢苜蓿與闊莢苜蓿、毛莢苜蓿存在明顯差異，但與花苜蓿極為相似，難以區(qū)分。分析表明：除花苜蓿外，以ITS2序列作為條形碼并輔以二級結(jié)構(gòu)，可以達到對矩鐮莢苜蓿、闊莢苜蓿和毛莢苜蓿準確、快速鑒定的目的。

關(guān)鍵詞 矩鐮莢苜蓿；ITS2序列；二級結(jié)構(gòu)；分子鑒定

矩鐮莢苜蓿（Medicago? archiducis-nicolai）是中國特有植物，和近緣種花苜蓿（M.ruthenica）、闊莢苜蓿（M.platycarpos）、毛莢苜蓿（M.edgeworthii ）同屬豆科苜蓿屬闊莢苜蓿組［1-2］。在中國西北高原地區(qū)廣泛分布，營養(yǎng)豐富，抗逆性強，極具馴化利用價值［3-4］。另外，矩鐮莢苜蓿、花苜蓿與毛莢苜蓿還可為藏藥［5-7］。但三者間形態(tài)上十分相似，極易混淆［1，5，8］，常出現(xiàn)“同名異物”現(xiàn)象，導(dǎo)致誤用、混用，給藥材使用造成很大隱患［5，8］。為了科學(xué)有效利用矩鐮莢苜蓿及其近緣種植物資源，有必要對其進行準確分類及鑒定。

傳統(tǒng)物種鑒定方法在易混淆近緣種鑒別方面存在很多局限性［9-11］。DNA條形碼鑒定技術(shù)因不受環(huán)境、樣品、部位、形態(tài)、發(fā)育階段等限制，可以直接從基因水平提供界定依據(jù)，從而彌補了傳統(tǒng)鑒別方法的不足，成為目前物種鑒定的重要手段［12-13］。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer2，ITS2）序列位于5.8S和28S rDNA基因之間，引物通用性強、序列較短、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增成功率和測序成功率高、物種分辨力強，具有易于折疊成二級結(jié)構(gòu)的非編碼 RNA片段，在植物物種鑒定上應(yīng)用廣泛，被推薦為核心DNA條形碼［14-16］。陳士林等［16］創(chuàng)建的中國中藥材DNA條形碼鑒定體系選用ITS2序列為物種鑒定的主體序列。在中國中藥材鑒定中，ITS2序列已經(jīng)作為唯一的核心條形碼寫入第一至四版《中國藥典》［16］。鄭夢迪等［17］、馬麗杰等［18］、劉亞令等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在植物近緣種鑒定中如果加入ITS2二級結(jié)構(gòu)可獲得更多分類信息，能對物種鑒定起到校正、補充和優(yōu)化的效果，因此，以ITS2序列為主二級結(jié)構(gòu)為輔，可以大大提高物種與近緣種的鑒定準確率。

基于以上綜述，本研究在西北主要分布區(qū)采集矩鐮莢苜蓿與3個近緣種材料進行DNA提取、擴增、測序，結(jié)合NCBI獲得ITS2序列，通過MEGA 6.0軟件對序列進行注釋、比對，計算種內(nèi)種間的遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并通過RNAfold web server 預(yù)測ITS2二級結(jié)構(gòu)，以期實現(xiàn)對矩鐮莢苜蓿與近緣種的快速、準確鑒定，為用藥安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材? 料

2020年8月至9月，在甘肅、青海、四川、寧夏4個省區(qū)選擇11個樣點取樣，共采集到14個自然居群的111個樣本，其中矩鐮莢苜蓿10個居群88個樣本，花苜蓿4個居群23個樣本（表1）。各居群間的距離在30 km以上，同一居群內(nèi)個體間的距離在10 m以上。所選試驗材料均為野外采集的新鮮健康葉片，采集后立即用硅膠快速干燥帯回實驗室，存放于-20 ℃冰箱中，以備DNA的提取。各居群的憑證標本存放于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)。另外，從GenBank數(shù)據(jù)庫下載闊莢苜蓿的ITS序列3條（MW241773～MW241775），毛莢苜蓿的ITS序列8條（MW241732～MW241739），用于本次分析的序列共122條。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA提取 選取硅膠干燥的葉片約30 mg，加入液氮研磨粉碎，使用生工生物工程（上海）股份有限公司植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序 ITS2擴增引物由上海生工生物科技有限公司合成。正向引物序列為： 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物序列為：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR擴增、測序引物一致。

PCR 擴增體系：總體積為25 μL，其中上游引物和下游引物各1 μL，PCR? Master? Mix? 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，并用ddH2O補足。擴增程序：95? ℃預(yù)變性 4 min；94? ℃變性 30 s，退火? ?1 min，72? ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；最后 72? ℃延伸 10 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳獲得單一明亮條帶后，送交上海生工生物科技有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 ITS2 序列的獲得 用SeqMan軟件對測序所得序列進行剪切、編輯和比對，并輔以人工校正，刪除低質(zhì)量區(qū)，得到ITS2完整序列。從GenBank上下載花苜蓿、闊莢苜蓿和毛莢苜蓿的ITS序列。應(yīng)用相似性搜索算法（BLAST）檢驗序列的鑒定成功率；將獲得的所有完整序列導(dǎo)入ITS2數(shù)據(jù)庫中（http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/），通過隱馬爾可夫模型（HMMs）［20］注釋的方法去除兩端5.8S和28S區(qū)域，得到標準的ITS2間隔區(qū)序列。最后將序列上傳至Genbank，得到GenBank登錄號。

1.3.2 種內(nèi)、種間遺傳距離計算及Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將所有ITS2序列的Fasta格式導(dǎo)入MEGA 6.0軟件，利用Muscle比對并進行人工手動校正。利用MEGA 6.0軟件對111個樣本序列和11條下載ITS2序列按種進行分組，統(tǒng)計分析其堿基含量及序列特征；基于K2-P（Kimura2-parameter）距離模型計算種內(nèi)種間的遺傳距離；以近緣屬植物草木樨（Melitoyus-officinalis：Z97687）為外類群，構(gòu)建Neighbor-Joining （NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，用bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗各分支置信度，評價分支系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的可靠性。

1.3.3 矩鐮莢苜蓿及其近緣種ITS2序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線網(wǎng)站RNAfold web server對各樣本進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增及測序成功率分析

對矩鐮莢苜蓿及其近緣種花苜蓿的111個樣品的ITS2擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，得到PCR擴增電泳圖（圖1）。圖中條帶較亮，沒有拖尾現(xiàn)象；ITS2完整序列均在 600 bp左右。所有試驗樣本的PCR擴增和測序成功率均達到100%，表明ITS2序列引物及其反應(yīng)條件針對矩鐮莢苜蓿及花苜蓿的擴增效果好，具有很好的穩(wěn)定性。

2.2 種內(nèi)與種間ITS2 序列差異分析

通過隱馬爾可夫模型（HMMs）［20］注釋的方法去除ITS2完整序列兩端5.8S和28S區(qū)域，得到標準的ITS2間隔區(qū)序列；采用相似性搜索算法（BLAST）檢驗，結(jié)果顯示矩鐮莢苜蓿和花苜蓿ITS2 序列與NCBI中已有序列完全一致，序列相似性為100%，表明測序結(jié)果質(zhì)量較好，真實 ?可信。

從表2可以看出，矩鐮莢苜蓿、花苜蓿及毛莢苜蓿的ITS2序列長度均為220 bp，G+C含量分別為 47.3%、46.9%、46.8%，闊莢苜蓿的ITS2序列長度為221 bp，G+C含量為47.5%。通過MEGA 6.0軟件對矩鐮莢苜蓿及其近緣種ITS2序列進行比對分析，得到種內(nèi)差異信息位點（表2）。結(jié)果顯示，供試的矩鐮莢苜蓿88個樣本與23個花苜蓿之間無差異位點，下載的闊莢苜蓿、毛莢苜蓿內(nèi)部也無差異。

種間差異顯示（表3），矩鐮莢苜蓿與花苜蓿相比，二者只有1個差異位點（141位點的C/T差異）；與闊莢苜蓿存在2個差異位點（43和141位點）；與毛莢苜蓿有5個差異位點（10、85、141、166、208位點）?；ㄜ俎Ｅc毛莢苜蓿相比有4個差異位點（10、85、166、208位點）。闊莢苜蓿與毛莢苜蓿有5個差異位點（10、43、85、166、208位點）。闊莢苜蓿在165位點處有一個插入/缺失位點。

2.3 種內(nèi)與種間遺傳距離分析及barcoding? Gap ?檢驗

基于MEGA 6.0軟件中K2-P（Kimura 2-parameter）距離模型，計算矩鐮莢苜蓿及其近緣種的種內(nèi)種間遺傳距離，結(jié)果顯示（表4），矩鐮莢苜蓿及其近緣種的種內(nèi)遺傳距離均為0；不同物種間相比，毛莢苜蓿與矩鐮莢苜蓿、闊莢苜蓿遺傳距離最大（0.022 73），其次是毛莢苜蓿與花苜蓿 ?（0.018 18），矩鐮莢苜蓿與闊莢苜蓿遺傳距離較小（0.009 09），花苜蓿與矩鐮莢苜蓿、闊莢苜蓿的遺傳距離最?。?.004 55）。從種間、種內(nèi)遺傳距離分布圖可以看出（圖2），矩鐮莢苜蓿及其近緣種的種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離，表明種內(nèi)和種間存在明顯的“Barcoding? Gap”區(qū)域。

2.4 ITS2序列NJ（neighbor-joining）系統(tǒng)進化樹鑒別

利用ITS2序列構(gòu)建矩鐮莢苜蓿及其近緣種的鄰接法（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)進化樹（圖3）。結(jié)果顯示，NJ系統(tǒng)進化樹中各分支的支持率都在50%以上。其中毛莢苜蓿聚為一支，與矩鐮莢苜蓿、花苜蓿、闊莢苜蓿明顯分開。矩鐮莢苜蓿、闊莢苜蓿與花苜蓿聚為另一支，矩鐮莢苜蓿與闊莢苜蓿又各自聚成單系；但花苜蓿成梳子狀拓撲結(jié)構(gòu)，不形成獨立的分支，無法與矩鐮莢苜蓿、闊莢苜蓿分開。

2.5 ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過RNAfold web server網(wǎng)站預(yù)測得到矩鐮莢苜蓿及其近緣種ITS2二級結(jié)構(gòu)（圖3），從圖中可以看出，這4個近緣種的二級結(jié)構(gòu)較為相似，均符合被子植物一環(huán)（主環(huán)：Mainloop） 四臂（4個螺旋區(qū)：helix） 的特征［17］。每個螺旋上又有大小、數(shù)目、形態(tài)不同的莖環(huán)（loop）結(jié)構(gòu)。比較4個近緣種的ITS2二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，各物種在4個螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目、大小均有明顯差異。毛莢苜蓿二級結(jié)構(gòu)最為特殊，臂Ⅰ與臂Ⅱ之間有1個大小不同的突環(huán)，臂Ⅰ與臂Ⅳ間多一個突環(huán)；矩鐮莢苜蓿、花苜蓿和闊莢苜蓿在臂Ⅰ中都有1個發(fā)卡環(huán)和2個內(nèi)環(huán)，而毛莢苜蓿只有1個發(fā)卡環(huán)和 1個內(nèi)環(huán)，并且闊莢苜?？拷l(fā)卡環(huán)的內(nèi)環(huán)明顯小于矩鐮莢苜蓿和花苜蓿的內(nèi)環(huán)；比較臂Ⅲ結(jié)構(gòu)可以看出，闊莢苜蓿在臂Ⅲ有3個內(nèi)環(huán)，而矩鐮莢苜蓿、花苜蓿、毛莢苜蓿都有2個。

因此，根據(jù)ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)可以直觀地將矩鐮莢苜蓿與近緣種毛莢苜蓿、闊莢苜蓿區(qū)分開。但矩鐮莢苜蓿與花苜蓿ITS2序列二級結(jié)構(gòu)極為相似，仍然無法將二者區(qū)分開。

3 討? 論

序列穩(wěn)定性指不同產(chǎn)地、不同批次的樣品都能穩(wěn)定地獲得DNA條形碼序列［21］。穩(wěn)定性是DNA條形碼篩選的重要條件。在國際DNA條形碼鑒定聯(lián)盟組織（CBOL）推薦的7條候選條形碼序列（rbcL、trnH-psbA、matK、rpoC1，ycf5、ITS和ITS2）中［22］，ITS2序列具有非常好的穩(wěn)定性［22-23］。這與本研究結(jié)果完全一致。本試驗中，ITS2序列擴增成功率和測序成功率均達到100%（圖1），在不同海拔、產(chǎn)地的樣本中并沒有產(chǎn)生新的單倍型，ITS2序列十分穩(wěn)定。

除穩(wěn)定性之外，ITS2序列因具有引物通用性強、序列較短、擴增成功率和測序成功率高、物種分辨力強等諸多優(yōu)點［24］，一直被植物分子系統(tǒng)學(xué)研究所重視。尤其是近十年來，隨著DNA條形碼技術(shù)在中藥材易混偽品甄別中廣泛應(yīng)用，中國學(xué)者在藥用植物ITS2序列分析方面開展了大量工作。Chen等［22］、Yao等［23］通過大樣本中藥材近緣種鑒定分析，發(fā)現(xiàn)ITS2在種水平的分辨率能達到92.7%。據(jù)此，Chen等［22］在2011年創(chuàng)建了中藥材DNA條形碼鑒定體系，推薦ITS2 序列作為物種鑒定的核心條形碼，形成了中國特色的藥材鑒別技術(shù)。自2015年這一技術(shù)寫入《中國藥典》以來，基于ITS2序列的分子鑒定技術(shù)在中藥材易混偽品、近緣物種鑒定中起到了非常好的應(yīng)用效果。參考前人研究的方法［21-22］，本研究結(jié)果顯示，矩鐮莢苜蓿及其近緣種的ITS2序列長度為220～221 bp，4個物種種內(nèi)遺傳距離都為0，種間遺傳距離為0.004 55～0.022 73，種內(nèi)遺傳距離（0）小于種間最小K-2P遺傳距離（0.004 55）（表5），即種內(nèi)和種間存在明顯的“BarcodingGap”區(qū)域［25］（圖2）。分析矩鐮莢苜蓿及其近緣種NJ樹得出，毛莢苜蓿聚為一支，與矩鐮莢苜蓿、花苜蓿、闊莢苜蓿明顯分開；矩鐮莢苜蓿、闊莢苜蓿與花苜蓿聚為另一支，矩鐮莢苜蓿與闊莢苜蓿又各自聚成單系，但花苜蓿沒有形成獨立的分支，無法與矩鐮莢苜蓿、闊莢苜蓿分開（圖3）?？梢?，利用ITS2序列可以準確鑒定出矩鐮莢苜蓿、闊莢苜蓿和毛莢苜蓿，但不能區(qū)分花苜蓿與矩鐮莢苜蓿、闊莢苜蓿。

ITS2具有相對保守的二級結(jié)構(gòu)［12］，能對一級結(jié)構(gòu)信息進行驗證與補充，起到校正優(yōu)化的作用［12，17-18］。中國學(xué)者劉亞令等［19］對兩種藥用黃芪（Astragalus spp.）、楊美青等［14］對防己（Stephaniatetrandra）及其混偽品的研究得出，加入二級結(jié)構(gòu)可以提供物種分類鑒定的額外信息，成功鑒定出基于一級結(jié)構(gòu)無法界定出的近緣種。為了提高ITS2序列在矩鐮莢苜蓿及其近緣種中的鑒定效果，本研究也預(yù)測分析了4個近緣種的二級結(jié)構(gòu)。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，矩鐮莢苜蓿、花苜蓿都與闊莢苜蓿、毛莢苜蓿的二級結(jié)構(gòu)在環(huán)的數(shù)量和大小方面存在較大的差異（圖4）。矩鐮莢苜蓿、花苜蓿和闊莢苜蓿在臂Ⅰ中都有1個發(fā)卡環(huán)和2個內(nèi)環(huán)，而毛莢苜蓿只有1個發(fā)卡環(huán)和 1個內(nèi)環(huán)；闊莢苜蓿靠近發(fā)卡環(huán)的內(nèi)環(huán)明顯小于矩鐮莢苜蓿和花苜蓿的內(nèi)環(huán)；闊莢苜蓿在臂Ⅲ有3個內(nèi)環(huán)，而矩鐮莢苜蓿、花苜蓿、毛莢苜蓿都有2個。二級結(jié)構(gòu)為矩鐮莢苜蓿及其近緣種的鑒定提供了更加豐富的分類信息。通過二級結(jié)構(gòu)，可以很直觀地將矩鐮莢苜蓿與闊莢苜蓿、毛莢苜蓿區(qū)分開，也可以將花苜蓿與闊莢苜蓿、毛莢苜蓿區(qū)分開，但是，矩鐮莢苜蓿與花苜蓿具有基本一致的二級結(jié)構(gòu)，僅在臂Ⅲ有C/T差異位點（圖4），憑借二級結(jié)構(gòu)難以將二者區(qū)分。

前人研究表明，矩鐮莢苜蓿與花苜蓿在苜蓿屬闊莢苜蓿組中的親緣關(guān)系是最近的［25-27］。吳小培等［7］和Chen等［25］ 分別在花苜蓿、矩鐮莢苜蓿種間遺傳結(jié)構(gòu)和中國苜蓿屬系統(tǒng)發(fā)育研究中均認為，矩鐮莢苜蓿與花苜?？赡艽嬖诓煌耆淖V系分化或存在雜交漸滲。在本研究中，依據(jù)ITS2序列和二級結(jié)構(gòu)仍無法將矩鐮莢苜蓿與花苜蓿區(qū)分來，可見，二者存在十分復(fù)雜的種間關(guān)系。為了對矩鐮莢苜蓿及其花苜蓿進行準確的分類鑒定，還需結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、借助更多基因序列進行試驗研究。

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Molecular Identification of Medicago archiducis-nicolai? and Its Related

Species Based on ITS2 Sequence and Its Secondary Structure

Abstract In order to accurately identify Medicago archiducis-nicolai and its relative species，M.ruthenica，M.platycarpos and? M.edgeworthii，the ITS2 sequences of four species were annotated，compared and examined by DNA barcoding，and the genetic distances of intra-and inter-species were calculated，the neighbor-joining phylogenetic tree was constructed，the ITS2 secondary structures of four related species were predicted by RNA? fold? web server. The results showed that the length of ITS2 sequence of four species was between 220-221 bp and showed good stability. The genetic distance of inter-species （0.004 55-0.022 73） was significantly larger than that of the intra-species （0），and there was an obvious barcoding gap region. The NJ phylogenetic tree showed that M.edgeworthii clustered into one branch，and Medicago archiducis-nicolai，M.ruthenica and M.platycarpos clustered into another branch，then Medicago archiducis-nicolai and M.platycarpos formed monophyletic，respectively. The ITS2 secondary structure of Medicago archiducis-nicolai was obviously different from that of M.platycarpos and M.edgeworthii，but it was very similar to that of M.ruthenica，and difficult to distinguish. The analysis showed that ITS2 sequence as a barcode and supplemented with secondary structure can be accurately and rapidly used for the identification of M.archiducis-nicolai，M.platycarpos and M.edgeworthii exception for M.ruthenica.

Key words Medicago archiducis-nicolai; ITS2 sequence; Secondary structure; Molecular identification