李村富,浦秀麗,李春芳,蔣宏,何俊

(1.中國科學院昆明植物研究所 中國西南野生生物種質(zhì)資源庫,云南 昆明 650201;2.云南省林業(yè)和草原科學院,云南 昆明 650201)

蘭科(Orchidaceae)是被子植物中的最大科之一,全世界記錄約有736屬28 000多種[1],部分物種具有重要的觀賞、藥用、食用、科研和文化等價值,備受人們關注[2-3]。近年來其野生植物資源遭到過度采集,在自然條件下種子萌發(fā)又依賴真菌等因素導致蘭科植物成為植物保育中的“旗艦”類群[4]。在最新頒布的《國家重點保護野生植物名錄》(2021年)收錄的1 101種野生植物中,蘭科植物占比近約1/3[5]。蘭科植物種子小如“粉塵”,大部分物種的果莢內(nèi)有數(shù)量驚人的種子,以種子庫的方式保存蘭科種質(zhì)資源具有占用空間小、花費少、同時能保存大量種類和遺傳多樣性等優(yōu)勢,是蘭科植物保護的理想途徑[6-8]。

種子生活力檢測是建設蘭科植物種子庫等遷地保護工作必不可少的環(huán)節(jié)[8]。目前,蘭科植物種子生活力檢測方法主要有四氮唑法(TTC)、熒光素雙醋酸酯染色法(FDA)、紫外分光光度計法(UVS)、埃文斯藍染色法(Evans blue,EB)、萌發(fā)測定法等[8-10]。其中,TTC法是最常用的種子生活力測試方法之一,因檢測快速常用于一些萌發(fā)耗時長的物種種子生活力測定[8]。然而,某些蘭科物種具有深色或堅硬種皮,甚至同一物種的不同居群存在生態(tài)型的分化等原因均可能導致TTC法檢測的結(jié)果出現(xiàn)差異,例如不同地理來源的美須蘭(原變種)(Calopogontuberosusvar.tuberosus)種子,北方居群的種皮較南方種群厚,滲透性更差,TTC法對南方居群提供了相對準確的生活力評估[11-12]。和TTC法一樣,FDA法也屬于酶促種子生活力檢測方法,但由于一些酶活性在細胞死亡后也有可能持續(xù)存在,從而導致檢測結(jié)果的假陽性[8,13-14]。UVS是在電導率測定法的基礎上改進的方法,實驗操作簡單快捷,但需要與萌發(fā)率聯(lián)合分析,而不能直觀地給出檢測結(jié)果[15]。EB法是基于細胞膜的完整性,阻止細胞外的EB染色劑進入細胞來判斷種子生活力,屬于非酶促種子生活力檢測法[8,16],相較于TTC法和FDA法,EB法不依賴酶活性,結(jié)果更加穩(wěn)定和可靠,卻需要豐富的操作經(jīng)驗[8,17]。萌發(fā)測定法常常需要與其他測定方法聯(lián)用[9],往往耗時較長。地生蘭種子非共生萌發(fā)時間比附生蘭更長[12],檢測結(jié)果又極易受到非共生萌發(fā)操作時滅菌試劑種類和滅菌時間的影響。蘭科種子滅菌過程中滅菌試劑在清除種子表面污染的同時也會滲透種皮并對種胚造成傷害,從而降低種子生活力[8]。不同物種種皮滲透性不同,附生蘭種子往往比地生蘭種子更具滲透性[18],表現(xiàn)出種子滅菌耐受性的差異。篩選一種便捷、高效的蘭花植物種子生活力檢測和滅菌方法對其保存、生活力評估和物種保護都具有重要意義。

金耳石斛(Dendrobiumhookerianum)和長瓣萬代蘭(Vandalongitepala)是主要分布于高黎貢山生物多樣性熱點地區(qū)的2種附生蘭。其中,金耳石斛被列為國家Ⅱ級保護野生植物(2021版)[5],瀕危等級為易危(Vulnerable,VU)[19];長瓣萬代蘭為本文作者近年發(fā)現(xiàn)于云南省怒江傈僳族自治州高黎貢山地區(qū)的新紀錄種。石斛屬和萬代蘭屬植物由于在花型、花色、唇瓣上的多樣性,具備重要園藝觀賞價值[20-21]。金耳石斛還具有較高的藥用價值,由于受到長期掠奪式采挖,野生資源遭受嚴重破壞[22]。本研究通過采用TTC法和非共生萌發(fā)測定法相結(jié)合測定各自的種子生活力,比較2種方法的測定結(jié)果,以期篩選出一種便捷、高效的測定附生蘭種子生活力的通用方法,為蘭科植物的收集保存及可持續(xù)利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為金耳石斛和長瓣萬代蘭,見圖1。

圖1 金耳石斛和長瓣萬代蘭的開花植株

金耳石斛(圖1a)為國家重要野生植物種質(zhì)資源庫聯(lián)盟成員于2020年在高黎貢山收集的同一居群剛要開裂的蒴果,長瓣萬代蘭(圖1b)為云南省林業(yè)和草原科學院蔣宏研究員于2019年從高黎貢山收集引種的同一居群植株,種植于云南省林業(yè)和草原科學院溫室,人工異花授粉獲得的蒴果。在實驗室內(nèi)分別取出2個種的多個蒴果中的種子,按種混勻后均勻平鋪到培養(yǎng)皿中的濾紙墊層上,置于盛有飽和氯化鋰(LiCl)溶液的干燥器中,在20℃條件下干燥4 d[7]。

1.2 方法

1.2.1 種子表面滅菌

前期進行預實驗篩選不同滅菌試劑的滅菌時間并設定梯度(金耳石斛:75%酒精滅菌處理2、4、6、8、10 min,0.1% HgCl2滅菌處理4、8、12、16、20 min,2% NaClO滅菌處理4、8、12、16、20 min,1% NaDCC滅菌處理10、20、30、40、60 min。長瓣萬代蘭:75%酒精滅菌處理2、4、6、8、10 min,0.1%HgCl2滅菌處理30、60、90、120、150 s,2% NaClO滅菌處理30、60、90、120、150 s,1% NaDCC滅菌處理10、20、30、40、60 min)。種子滅菌處理期間,純化柱上下顛倒及輕微搖晃,使種子與滅菌溶液充分接觸,結(jié)束后,600～800 rpm離心1 min,去滅菌液,然后無菌水漂洗4～5次,再用1 mL移液槍取600 μL無菌水加入吸附柱中,反復吸打使之呈種子懸浮液,吸取400 μL種子懸浮液播種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基上,接種15個培養(yǎng)皿,試驗重復3次。

1.2.2 種子生活力測定

1.2.2.1 非共生萌發(fā)測定種子生活力

用小藥匙分別取干燥后的金耳石斛和長瓣萬代蘭適量種子裝入無菌DNA純化柱(經(jīng)121℃,滅菌20 min,規(guī)格:吸附柱1 mL,收集管2 mL)中,標記代號,加入600 μL無菌水,浸泡24 h。在超凈工作臺中,600～800 rpm離心1 min,去無菌水,分別加入700 μL 75% 酒精[23]、0.1% HgCl2(升汞)[24]、2% NaClO[12](次氯酸鈉,有效氯10%,天津市風船化學試劑科技有限公司)和1% NaDCC[6](優(yōu)氯凈,上海麥克林生化科技股份有限公司),另設一組全程僅用無菌水處理的干燥后種子作為對照

1.2.2.2 TTC染色法測定種子生活力

將接種后純化柱中剩余的種子600～800 rpm離心1 min,去無菌水,加入800 μL 1% TTC溶液,在溫度30℃,黑暗條件下處理24 h[25],無菌水漂洗5次,加入600 μL無菌水制成種子懸浮液,取200 μL于載玻片上置于蔡司體視顯微鏡(SteREO Discovery.V8)下,隨機挑選3個視野,觀察種子染色情況,有生活力種胚被染成不同程度的紅色,無生活力種子種胚不著色,分別計數(shù)每個視野的種子總數(shù)和有生活力種子總數(shù),并計算種子生活力[8]。

1.2.3 種子萌發(fā)培養(yǎng)

金耳石斛種子萌發(fā)培養(yǎng)基采用MS+0.5 mg/L NAA +20 g/L蔗糖+10% 椰子汁+8 g/瓊脂[10](1182KG001,600-1 300 g/cm2,BioFroxx,下同),長瓣萬代蘭種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2 MS+ 20 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+1 g/L活性炭[26],pH值5.8～6.0。置于光照強度1 600～2 000 Lx,光照時間12 h/d,溫度23±2℃條件下培養(yǎng)。

1.3 數(shù)理統(tǒng)計

將培養(yǎng)7～10 d后的培養(yǎng)皿置于蔡司體視顯微鏡下隨機選取3個視眼,種子種胚吸脹膨大記為萌發(fā)[27-28],計算種子萌發(fā)率。污染材料也計入萌發(fā)數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

數(shù)據(jù)處理所需公式:

污染率(%)=污染培養(yǎng)皿數(shù)/接種培養(yǎng)皿總數(shù)×100%

染色率(%)=著色種子數(shù)/統(tǒng)計種子總數(shù)×100%

萌發(fā)率(%)=萌發(fā)種子數(shù)/統(tǒng)計種子總數(shù)×100%

采用Excel 2021軟件進行數(shù)據(jù)整理,SPSS 27.0.1軟件對接種污染率、種子TTC染色率和萌發(fā)率作單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 非共生萌發(fā)測定種子生活力

2.1.1 75%酒精對種子萌發(fā)率的影響

以無菌水處理的對照組金耳石斛和長瓣萬代蘭污染率分別為42.22%和40%,萌發(fā)率為97.34%和89.34%。種子經(jīng)75%酒精滅菌2、4、6、8、10 min后的萌發(fā)率見表1。滅菌2 min后,金耳石斛和長瓣萬代蘭種子都達到較好的滅菌效果,隨著滅菌時間的增加,經(jīng)方差分析金耳石斛種子萌發(fā)率與對照相比沒有顯著性差異。長瓣萬代蘭處理2 min后,種子萌發(fā)率為35.21%與對照相比極顯著下降,處理10 min時,降到4%以下。滅菌試劑對長瓣萬代蘭種胚造成了傷害,影響種子萌發(fā)率。

2.1.2 0.1% HgCl2對種子萌發(fā)率的影響

金耳石斛種子在0.1% HgCl2條件下滅菌0、4、8、12、16、20 min后的萌發(fā)率見表1。種子滅菌處理16 min內(nèi)與對照相比萌發(fā)率沒有顯著性差異,處理20 min后,種子萌發(fā)率有顯著下降,但種子萌發(fā)率仍然在90%以上。萌發(fā)試驗中金耳石斛用0.1% HgCl2滅菌時間應控制在16 min以內(nèi)。長瓣萬代蘭在滅菌處理30～150 s后,種子最高萌發(fā)率只有1.66%,滅菌試劑可能對種胚造成了極大傷害,長瓣萬代蘭不適合用0.1% HgCl2作為滅菌試劑。

2.1.3 2% NaClO對種子萌發(fā)率的影響

用2% NaClO對金耳石斛和長瓣萬代蘭種子進行滅菌,萌發(fā)率結(jié)果見表1。金耳石斛處理20 min后,萌發(fā)率為96.49%,經(jīng)方差分析與對照相比沒有顯著性差異,維持著較高的萌發(fā)率。長瓣萬代蘭處理30 s時,種子萌發(fā)率為80.26%,隨著處理時間的延長,種子萌發(fā)率極顯著下降,處理150 s后,降到3%以下。長瓣萬代蘭處理30 s后存在4.45%左右的污染率,處理60 s后才有較好的滅菌效果,但與對照相比萌發(fā)率已極顯著下降。

2.1.4 1% NaDCC對種子萌發(fā)率的影響

由表1可知,金耳石斛和長瓣萬代蘭處理10 min后污染率為0,且隨著滅菌時間的增加,金耳石斛各處理間種子萌發(fā)率也沒有顯著性差異,處理60 min后,種子萌發(fā)率為94.51%。長瓣萬代蘭滅菌處理40 min時種子萌發(fā)率沒有顯著性差異,處理60 min后,與對照相比有顯著性下降,為80.30%。1% NaDCC對種子的萌發(fā)率影響較小,維持較高的萌發(fā)率。隨著滅菌時間延長,1% NaDCC滅菌試劑對長瓣萬代蘭的種皮可能具有腐蝕作用,種皮顏色由原來的棕黃變?yōu)橥该?圖2)。1%NaDCC滅菌處理后兩種附生蘭種子都有較好的表面滅菌效果,且對種胚的傷害小,維持著較高的萌發(fā)率,也許可以作為種子在萌發(fā)法測定種子生活力時的通用滅菌試劑。

圖2 金耳石斛和長瓣萬代蘭種子經(jīng)過1% NaDCC滅菌后TTC染色和萌發(fā)情況

2.2 TTC染色法測定種子生活力

由表1可知,由無菌水處理的對照組金耳石斛和長瓣萬代蘭種子TTC染色率分別為96.49%和88.65%,萌發(fā)率為97.34%和89.34%,2種附生蘭萌發(fā)率均高于染色率,誤差較小為0.85%和0.69%。種子經(jīng)過不同滅菌處理后再進行TTC染色,與相應的萌發(fā)率比較,其穩(wěn)定性存在較大差異。75%酒精處理過程中,金耳石斛的染色率和萌發(fā)率誤差較小,在0.33%～2.74%之間,長瓣萬代蘭誤差在3.67%～29.48%,種子染色率整體偏高;0.1% HgCl2處理中,金耳石斛的染色率和萌發(fā)率誤差小于1.6%,長瓣萬代蘭染色率為0,染色率和萌發(fā)率誤差在1.66%以內(nèi);2% NaClO處理中,金耳石斛的染色率和萌發(fā)率誤差小于1.44%,長瓣萬代蘭誤差在2.85%～28.58%,種子染色率整體偏低;1% NaDCC處理中,金耳石斛的染色率和萌發(fā)率誤差在0.92%～3.53%,長瓣萬代蘭誤差從20.32%到60.18%,種子染色率整體偏低。金耳石斛種子滅菌處理后與對照相比TTC染色法測得的種子生活力均較穩(wěn)定,相應的萌發(fā)率誤差在3.53%之內(nèi),變化幅度小,結(jié)果可靠,可用于金耳石斛種子生活力評估。長瓣萬代蘭對照組染色率和萌發(fā)率之間誤差小較穩(wěn)定,滅菌處理后TTC染色法測得的種子生活力不穩(wěn)定,存在較大誤差,種子染色率整體偏低,表明滅菌試劑影響了長瓣萬代蘭種子TTC染色的穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

種子生活力的測定有多種方法,其中萌發(fā)試驗是首要方法[12]。萌發(fā)率常常作為其他活力測定方法的參照標準[16,29]。蘭科植物種子萌發(fā)率測定包括共生和非共生萌發(fā)2種途徑,但在萌發(fā)前都需要對種子進行滅菌。由于物種不同、果莢開裂與否、以及種皮結(jié)構的差異導致種皮的滲透性不同,種子的滅菌處理方法各不相同[7,12,18]。

本試驗通過對金耳石斛和長瓣萬代蘭種子進行不同滅菌方法處理后播種,統(tǒng)計和比較了不同滅菌試劑處理對種子萌發(fā)率的影響。結(jié)果表明,金耳石斛種子經(jīng)過75%酒精、0.1% HgCl2、2% NaClO、1% NaDCC計4種滅菌處理后整體都維持著較高的萌發(fā)率,僅在0.1% HgCl2處理20 min后種子萌發(fā)率顯著下降,但仍然有94.68%,與同屬的兜唇石斛(Dendrobiumaphyllum)[27]、齒瓣石斛(D.devonianum)[30]和華石斛(D.sinense)[10]結(jié)果相似,分別在1% NaClO、5% NaClO處理10、15、30 min后,都維持著較高的生活力。多種石斛屬植物的種子在不同滅菌試劑及滅菌時間上整體顯示出較好的耐受性,可能是滅菌耐受型種子。而與之相反,長瓣萬代蘭種子表現(xiàn)出不耐受性,75%酒精處理10 min后種子萌發(fā)率降到4%以下,0.1% HgCl2處理30 s后降到2%以下,在2% NaClO溶液處理150 s后降到3%以下,與附生蘭多穗蘭(Polystachyaconcreta)在0.3% NaClO滅菌5 min,種子萌發(fā)率降到了5%以下,0.5% NaClO滅菌3 min種子生活力喪失[31]的研究結(jié)果類似,對滅菌試劑比較敏感,可能是滅菌不耐受型種子。相較而言,金耳石斛的種子氣腔要大于長瓣萬代蘭種子,由于種皮與種胚之間存在氣腔可能阻礙液體流入,長瓣萬代蘭幾乎沒有氣腔,種皮緊貼種胚,溶液快速與種胚接觸[9,32],滅菌試劑可能對種胚造成傷害,從而影響種子的萌發(fā)率。

蘭科種子屬于粉塵類種子,大小(種子長度)在0.05～6 mm之間[33-34],不宜用傳統(tǒng)的解剖染色分析法進行活力檢測。利用TTC染色法檢測蘭科種子生活力,已成功的運用到了附生蘭和一些地生蘭科植物[6,35-36],具有簡單、快捷、易上手等優(yōu)點。在本試驗中,種子經(jīng)過不同滅菌試劑處理后再進行TTC染色,與相應的萌發(fā)率比較,其穩(wěn)定性存在差異。金耳石斛染色率和萌發(fā)率之間穩(wěn)定性較好,誤差為0.16%～3.53%,變化幅度小;長瓣萬代蘭存在較大誤差,在1% NaDCC處理后TTC染色率和萌發(fā)率之間最高達60.18%,說明滅菌處理對TTC試劑的染色效果影響較明顯(圖2),這與Pradhan等[8]研究結(jié)果一致。長瓣萬代蘭種子經(jīng)過75%酒精處理后,染色率高于萌發(fā)率,原因可能是TTC法屬于酶促檢測法,依賴于脫氫酶的活力,然而一些酶可能在細胞死亡后也持續(xù)存在于種子中,產(chǎn)生假陽性的活力檢測結(jié)果[13-14,17],而在次氯酸鹽處理中,可能由于種皮結(jié)構、滲透性等差異導致滅菌試劑的殘留干擾了TTC脫氫生成甲瓚[12],減少在種胚細胞內(nèi)的積累,染色率偏低。金耳石斛的種子為“石斛屬型”,種子呈稍長鋸屑狀,種皮細胞的垂周壁豎直,覆蓋細胞間隙,整個種子表面密被疣狀至鱗片狀沉積物,可能有一定的疏水性。長瓣萬代蘭的種子為“萬代蘭屬型”,種子呈鋸屑狀,種皮細胞的垂周壁豎直堅硬,細胞間隙凹陷,種子表面光滑,偶有疣狀凸起[34]。兩者種子形態(tài)相似,但種皮細胞間隙連接緊密程度以及是否具疣狀凸起等沉積物細微結(jié)構也可能導致了滅菌耐受性的差異。盡管TTC染色法已經(jīng)成功運用到一些附生蘭生活力的測定[12],為進一步確保染色率的準確性,類似長瓣萬代蘭等“萬代蘭屬型”滅菌不耐受性種子的TTC染色最好在滅菌處理前進行,而“石斛屬型”種子在滅菌前后皆可。

3.2 結(jié)論

綜上所述,金耳石斛和長瓣萬代蘭種子分別經(jīng)過75%酒精、0.1% HgCl2、2% NaClO、1% NaDCC滅菌處理后進行種子生活力檢測,2種附生蘭種子由于在種子氣腔、種皮細胞間隙連接緊密程度以及是否具疣狀凸起等沉積物細微結(jié)構上的不同,可能導致了對滅菌試劑耐受性存在差異,金耳石斛耐受性較好,屬于滅菌耐受型種子,長瓣萬代蘭屬于滅菌不耐受型種子。1% NaDCC對兩種附生蘭種子萌發(fā)率的影響最小,處理10～40 min后萌發(fā)率沒有顯著性差異,是本試驗中2種附生蘭種子的最佳滅菌處理方法,可能可以作為未來大批量蘭科植物種子滅菌較為通用的滅菌試劑,但還需要在更多的不同生活型物種中進行驗證。