李洪瑞,趙志明,張津,門艷闊,張子楊,王進(jìn)茂

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,河北 保定 071000;2.河北省洪崖山國有林場,河北 易縣 074200)

楊樹(Populus)為楊柳科(Salicaceae)楊屬(PopulusL.)多年生落葉喬木,在我國是重要的綠化及工業(yè)用材樹種[1]。目前我國楊樹林總面積達(dá)到了825.49×104hm2,居世界首位[2]。107楊(Populus×euramericana‘74/76’)是北方歐美楊主栽楊樹品種之一。楊樹大規(guī)模單一品種的應(yīng)用導(dǎo)致了日益嚴(yán)重的病蟲害問題,利用基因工程技術(shù)加快楊樹抗蟲新品種研發(fā)進(jìn)程顯得尤為重要。迄今為止,已有近22個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲楊樹品種被培育出來,并被批準(zhǔn)進(jìn)行小規(guī)模田間試驗(yàn)和環(huán)境釋放[3]。轉(zhuǎn)基因生物非預(yù)期效應(yīng)是指由于外源基因整合于基因組,整合行為或整合后的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與翻譯產(chǎn)物會(huì)對(duì)宿主原有的基因表達(dá)造成干擾導(dǎo)致的非目標(biāo)性的性狀改變[4]。張德建等[5-6]在研究轉(zhuǎn)基因741楊與非轉(zhuǎn)基因741楊的材性差異時(shí)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因741楊的密度、部分力學(xué)性質(zhì)和化學(xué)組分含量均與對(duì)照有顯著差異。有研究表明,轉(zhuǎn)Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107楊在株高和胸徑的生長上弱于對(duì)照,植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)和木質(zhì)素合成相關(guān)基因產(chǎn)生了差異表達(dá)[7]。Ning等[8]在對(duì)轉(zhuǎn)基因楊與非轉(zhuǎn)基因楊的形成層組織代謝組學(xué)分析比較中表明,共發(fā)現(xiàn)了197種豐度不同的代謝物,其中包括與生長和脅迫相關(guān)的精氨酸和谷氨酸,與細(xì)胞壁相關(guān)的蔗糖、尿苷二磷酸葡萄糖及其衍生物和與抗蟲相關(guān)的兒茶酚。木材的性質(zhì)是影響楊木應(yīng)用的關(guān)鍵因素,為了探究轉(zhuǎn)基因株系的生產(chǎn)應(yīng)用相關(guān)性狀是否發(fā)生了改變,本研究以轉(zhuǎn)BtCry1Ac基因107楊的兩個(gè)株系(ECA1、ECA2)和野生型株系(WT)為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)其物理及力學(xué)性質(zhì)、化學(xué)組分、纖維形態(tài)四個(gè)方面的差異進(jìn)行研究,旨在表型上評(píng)估ECA1和ECA2在木材質(zhì)量性狀上展現(xiàn)的非預(yù)期效應(yīng),并為轉(zhuǎn)BtCry1Ac基因107楊的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)林栽植地點(diǎn)在衡水市棗強(qiáng)縣林場(37.51337°N、115.72418°E),位于河北省中南部平原,年平均氣溫為12.9 ℃,屬大陸性季風(fēng)氣候。年平均降水量為484.2 mm,平均無霜期為219 d,四季分明,冷暖差異大[9]。采樣所在試驗(yàn)林營建于2015年,試驗(yàn)林均采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),分為5個(gè)處理,均重復(fù)3次,共15個(gè)小區(qū),每小區(qū)30株,東西行距4 m、南北株距3 m。采用苗圃扦插繁殖的當(dāng)年生苗木造林,栽植時(shí)苗高、地徑基本一致,且試驗(yàn)地內(nèi)不進(jìn)行施肥除草等人工撫育。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自栽植于衡水市棗強(qiáng)縣林場的轉(zhuǎn)BtCry1Ac抗蟲基因107楊2個(gè)株系(編號(hào)為ECA1、ECA2)及非轉(zhuǎn)基因野生型株系(WT)的7年生苗木,2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系已被國家林業(yè)和草原局批準(zhǔn)環(huán)境釋放。

化學(xué)組分中抽出物測定所用材料取自3個(gè)株系的胸徑處厚度5 cm的圓盤。將圓盤劈成較為均勻的木片,按照四分法取樣片,放置于粉碎機(jī)中使其粉碎,然后將粉碎的樣木置于40目篩進(jìn)行篩選至完全通過且留于60目篩得到用于進(jìn)行抽出物試驗(yàn)的粉末樣品;測定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素所用的材料為除去抽出物后的材料。

物理及力學(xué)性質(zhì)測定所用材料取自3個(gè)株系的胸徑處往上1 m的木段。將圓木段鋸成規(guī)定厚的木板,室內(nèi)放置進(jìn)行自然干燥,將木材的含水率調(diào)至12%左右,然后將木板加工成試驗(yàn)需要的無疵小試樣進(jìn)行木材物理力學(xué)性質(zhì)的測定。

制備纖維形態(tài)測定的材料需采用富蘭克林離析法進(jìn)行木材的離析,離析后即可進(jìn)行纖維形態(tài)測定。

1.3 各指標(biāo)測定方法

化學(xué)組分中,纖維素與半纖維素按照GB/T 2677.10—1995測定[10],木質(zhì)素按照GB/T 2677.8—1994測定[11],苯醇抽出物按照GB/T 2677.6—1994測定[12],灰分按照GB/T 742—2018測定[13],1%氫氧化鈉抽出物按照GB/T 2677.5—1993測定[14]。

物理及力學(xué)性質(zhì)中,沖擊韌性按照GB/T 1940—2009測定[15],抗彎強(qiáng)度按照GB/T 1936.1—2009測定[16],抗彎彈性模量按照GB/T 1936.2—2009測定[17],順紋抗壓強(qiáng)度按照GB/T 1935—2009測定[18],干縮性按照GB/T 1932—2009測定[19],木材密度按照GB/T 1933—2009測定[20]。

纖維形態(tài)測定采用富蘭克林離析法[21],將處理好的試驗(yàn)材料進(jìn)行木材的離析,番紅染色后置于顯微鏡上觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析,SPSS 24.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05),Origin2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 木材化學(xué)組分差異分析

由表1可知,ECA1和ECA2與WT的纖維素、灰分、苯醇抽出物及1%NaOH抽出物組分含量存在顯著性差異(P<0.05),其余性質(zhì)差異不顯著。在ECA1和ECA2與WT的化學(xué)組分含量比較中發(fā)現(xiàn),ECA1和ECA2的纖維素、灰分、苯醇抽出物及1%NaOH抽出物組分含量均明顯低于WT,ECA1和ECA2的纖維素、灰分、苯醇抽出物及1%NaOH抽出物組分含量的均值分別為WT的94.41%、86.08%、87.82%、89.15%。由此可知,ECA1和ECA2與WT在化學(xué)組分含量上差異最大的為灰分,其余依次為為苯醇抽出物、1%NaOH抽出物、纖維素。

表1 不同株系107楊化學(xué)組分含量

2.2 木材力學(xué)性質(zhì)差異分析

通過表2可知,ECA1和ECA2與WT在沖擊韌性、抗彎強(qiáng)度、抗彎彈性模量和順紋抗壓強(qiáng)度方面存在顯著性差異(P<0.05),ECA1與ECA2間無顯著差異,且ECA1和ECA2的各項(xiàng)指標(biāo)均高于WT。WT、ECA1、ECA2木材的沖擊韌性分別為63.65、68.87、68.62 KJ/m2,ECA1和ECA2木材的沖擊韌性比WT分別提高了7.58%、7.24%。沿木材順紋方向施加壓力,木材能承受的最大能力即為木材順紋抗壓強(qiáng)度,WT的順紋抗壓強(qiáng)度為40.83 MPa,ECA1和ECA2的順紋抗壓強(qiáng)度分別為44.50、43.70 MPa,兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系順紋抗壓強(qiáng)度較WT分別提高8.25%、6.57%。木材抗彎強(qiáng)度和抗彎彈性模量在木梁設(shè)計(jì)家具彎曲等方面可提供重要的參考價(jià)值,WT的抗彎強(qiáng)度和抗彎彈性模量分別為81.51 MPa、9 177 MPa,兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系抗彎強(qiáng)度和抗彎彈性模量平均值為84.97 MPa、9 556 MPa,轉(zhuǎn)基因株系的抗彎強(qiáng)度和抗彎彈性模量分別較WT提高4.07%、3.97%。ECA1和ECA2的木材強(qiáng)度在總體上優(yōu)于WT。

表2 不同株系107楊力學(xué)性質(zhì)

2.3 木材物理性質(zhì)差異分析

木材密度是木材物理性質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo),木材密度又分為氣干、全干和基本密度。ECA1和ECA2的氣干密度、全干密度與WT均存在顯著性差異(P<0.05);ECA2的基本密度與WT存在顯著性差異(P<0.05),ECA1的基本密度與WT和ECA2無顯著性差異(表3)。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的氣干、全干和基本密度比WT的提高了3.10%、3.09%、2.63%。根據(jù)氣干密度的大小又可以將木材分為很輕(<0.350 g/cm3)、輕(0.351～0.550 g/cm3)、中(0.551～0.750 g/cm3)、重(0.751～0.950 g/cm3)、很重(>0.951 g/cm3)5個(gè)等級(jí)[22]。根據(jù)氣干密度大小可將3個(gè)株系的木材劃分為II級(jí)(輕)。

表3 各株系物理性質(zhì)

ECA1和ECA2的氣干干縮和全干干縮與WT存在顯著性差異(P<0.05),且均為轉(zhuǎn)基因株系小于WT(表3)。ECA1與ECA2的徑向氣干、弦向氣干、體積氣干的干縮率的平均值分別為2.66%、5.53%、8.53%,WT的徑向氣干、弦向氣干、體積氣干的干縮率分別為2.89%、5.87%、9.07%,ECA1、ECA2的徑向氣干、弦向氣干、體積氣干的干縮率均值分別比WT小7.96%、5.79%、5.95%。木材干縮率是評(píng)價(jià)木材穩(wěn)定性的重要指標(biāo),干縮率越小木材越不容易出現(xiàn)開裂等情況,說明木材更加的穩(wěn)定[23]。ECA1和ECA2的氣干干縮和全干干縮均小于WT,因此表明ECA1和ECA2的木材的穩(wěn)定性高于WT。

2.4 木材纖維形態(tài)差異分析

通過對(duì)3個(gè)株系纖維長度進(jìn)行方差分析,ECA1和ECA2與WT存在顯著顯異(P<0.05),表現(xiàn)為ECA1和ECA2小于WT,ECA1、ECA2之間纖維長度無顯著性差異;WT、ECA1、ECA2三個(gè)株系的纖維寬度無顯著差異(圖1)。由圖1a可知WT的纖維長度范圍為(754.17～1 529.17) μm,ECA1和ECA2的纖維長度范圍分別為(641.67～1 408.33) μm和(612.51～1 383.33) μm,可以看出WT的最短纖維長度和最長纖維長度均大于轉(zhuǎn)基因株系。WT的平均纖維長度為1 166.11 μm,而ECA1纖維長度為1 021.53 μm,ECA2纖維長度為1 045.28 μm,ECA1和ECA2的纖維長度分別為WT纖維長度的87.60%、89.64%。通過圖1c可得WT的纖維長寬比最高為51.23,與WT相比,轉(zhuǎn)基因株系長寬比略有降低,分別為48.95、49.37。

圖1 不同株系107楊纖維形態(tài)

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

(1)BtCry1Ac基因的轉(zhuǎn)入對(duì)107楊木材化學(xué)組分的影響

木材化學(xué)組分含量對(duì)木材材性有重要影響,是影響木材加工利用的重要因素,尤其影響其在造紙方面的應(yīng)用[24]。在本研究中,纖維素、灰分、苯醇抽出物、1%NaOH抽出物含量和纖維長度差異顯著,表現(xiàn)為ECA1和ECA2小于WT。ZHANG等[25]對(duì)11年生轉(zhuǎn)BtCry1Ac基因黑楊(Populusnigra)的5個(gè)無性系進(jìn)行了生長和材性性狀分析,發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因株系相比,轉(zhuǎn)基因株系的纖維素含量降低,木質(zhì)素含量增加,與本研究結(jié)果一致。張德建等[6]以轉(zhuǎn)抗蟲基因741楊和非轉(zhuǎn)基因741楊為研究材料,對(duì)其木材的化學(xué)組分含量進(jìn)行了測定與分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因741楊纖維素含量小于非轉(zhuǎn)基因741楊,而抽出物含量變化與此相反,纖維素含量與本研究結(jié)果一致,抽出物含量與本研究結(jié)果不一致。導(dǎo)致該研究與本研究有差異的原因可能是不同種楊樹受體轉(zhuǎn)入不同的外源基因造成的,也有可能是插入位點(diǎn)不同或外源基因的拷貝數(shù)不同或整合時(shí)使固有基因發(fā)生了斷裂、激活或沉默[26-27]。

(2)BtCry1Ac基因的轉(zhuǎn)入對(duì)107楊木材物理及力學(xué)性質(zhì)的影響

木材的物理及力學(xué)性質(zhì)與木材穩(wěn)定性、木材強(qiáng)度以及木材品質(zhì)關(guān)系緊密[28]。對(duì)3個(gè)株系物理及力學(xué)性質(zhì)的各指標(biāo)進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn),ECA1和ECA2的沖擊韌性、抗彎強(qiáng)度、抗彎彈性模量、順紋抗壓強(qiáng)度、氣干密度和全干密度均顯著高于WT,說明ECA1和ECA2在外界壓力下抵抗彈性變形的能力強(qiáng)于WT。張德建等[5]對(duì)轉(zhuǎn)基因741楊木材的物理及力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定并與非轉(zhuǎn)基因741楊進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因741楊的密度、力學(xué)性質(zhì)均高于非轉(zhuǎn)基因741楊,且全干密度、沖擊韌性、抗彎強(qiáng)度、抗彎彈性模量和順紋抗壓強(qiáng)度差異顯著,研究結(jié)果與本文相符。本研究中3個(gè)無性系的基本密度分布于0.35～0.41 g/cm3范圍內(nèi),王嘉楠等[29]經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)I-69楊不同部位的平均基本密度在0.36～0.40 g/cm3之間;于東陽等[30]以10個(gè)楊樹新雜種無性系為材料進(jìn)行木材的基本密度測定,發(fā)現(xiàn)10個(gè)無性系的整株基本密度在0.26～0.33 g/cm3之間,與本研究結(jié)果基本一致。

抗彎強(qiáng)度與順紋抗壓強(qiáng)度之和為木材綜合強(qiáng)度值,木材綜合強(qiáng)度與基本密度比值為木材綜合品質(zhì)系數(shù)。根據(jù)木材綜合強(qiáng)度與木材綜合品質(zhì)系數(shù)劃分標(biāo)準(zhǔn)和計(jì)算方法[22],ECA1、ECA2和WT的木材綜合強(qiáng)度分別為129.47、128.64、122.34 MPa,均在111～170 MPa之間,屬于中等強(qiáng)度;ECA1、ECA2和WT的木材的綜合品質(zhì)系數(shù)分別為298 318、294 416、289 905 Pa,均超過226 380 Pa,屬于高等級(jí)材;因此,3個(gè)株系的木材綜合強(qiáng)度屬于中等強(qiáng)度,木材屬于高等級(jí)材。木材的差異干縮為弦徑向干縮率之比,一般用于評(píng)價(jià)易變形程度[31]。本研究中ECA1和ECA2與WT的差異干縮分別為2.07、2.09和2.03,均大于2,劃分為大[32],說明ECA1、ECA2、WT在干燥加工中木材容易出現(xiàn)開裂的情況?？傮w而言,BtCry1Ac基因的轉(zhuǎn)入使107楊的木材強(qiáng)度得到了提高,但木材穩(wěn)定性依舊較差,在加工過程中易開裂。

(3)BtCry1Ac基因的轉(zhuǎn)入對(duì)107楊纖維形態(tài)的影響

木材的纖維形態(tài)是影響造紙質(zhì)量的重要因子,纖維長寬比越大,纖維就擁有更大的彈性、柔韌性、撕裂強(qiáng)度,形成的紙張質(zhì)量就越好[33-34]。ECA1和ECA2的纖維長度、纖維寬度和纖維長寬比較WT均有不同程度的降低,其中纖維長度差異顯著。朱文旭[35]對(duì)5個(gè)轉(zhuǎn)多基因庫安托楊(Populus×euramericana‘Guariento’)無性系和1個(gè)非轉(zhuǎn)基因無性系的纖維形態(tài)進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)轉(zhuǎn)基因無性系的纖維長度、纖維長寬比較非轉(zhuǎn)基因株系均有不同程度的降低,與本研究結(jié)果一致。中級(jí)長度纖維的長度范圍是910～1 600 μm,且長寬比高于40[36],3個(gè)株系的纖維長度和纖維長寬比均滿足中級(jí)長度纖維的標(biāo)準(zhǔn)。纖維長寬比在30以下的纖維不適合造紙,長寬比大于56的纖維是優(yōu)良的造紙材料[37],3個(gè)株系的纖維長寬比均在48.95以上;因此,可以認(rèn)為ECA1、ECA2和WT的木材是較適合造紙的原材料,但轉(zhuǎn)基因株系較差些。

3.2 結(jié)論

轉(zhuǎn)入BtCry1Ac基因后,107楊木材的化學(xué)組分含量、物理和力學(xué)性質(zhì)及纖維形態(tài)相關(guān)的多項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)較WT發(fā)生了顯著的非預(yù)期性變化。轉(zhuǎn)基因株系的綜合強(qiáng)度好于野生型,屬于中等強(qiáng)度木材,但因差異干縮值高,木材易于開裂;轉(zhuǎn)基因株系纖維素、灰分含量、纖維長度、纖維寬度、纖維長寬比均低于野生型,因此與野生型相比轉(zhuǎn)基因107楊表現(xiàn)出較低的造紙適應(yīng)性。楊樹為長生命周期樹種,基于市場對(duì)楊樹大徑材的需求,應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)BtCry1Ac基因107楊大徑材形成進(jìn)行持續(xù)觀測,為轉(zhuǎn)BtCry1Ac基因楊樹的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。