徐 亮, 王雅琪, 喬建梁

作者單位：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科,呼和浩特 010000

原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是原發(fā)于肝細胞或肝內(nèi)膽管細胞的惡性腫瘤,以肝區(qū)疼痛、發(fā)熱、黃疸等為主要臨床表現(xiàn),現(xiàn)已是全球性的健康問題。動物模型具有周期短、干擾因素少等優(yōu)點,是醫(yī)學研究的重要方法之一[1-2]。與PHC相關動物模型包括自發(fā)性、誘發(fā)性和移植性肝癌大鼠模型。誘發(fā)性肝癌大鼠模型具有成本低廉、操作簡單、造模周期短等優(yōu)點,且可誘發(fā)出與人類PHC相似度高的模型,故應用最為廣泛。目前,研究造模大鼠品系、造模藥物種類繁多,造模方法各式各樣,造模周期長短不一,因此,研究者常常會感到困惑[3-5]。鑒于此,筆者查閱了大量關于PHC大鼠造模的相關文獻,本文對實驗大鼠品系、造模方法、藥物種類、藥物劑量、造模周期、造模結(jié)果評價等進行了歸納總結(jié),為研究者了解目前PHC大鼠造模方法提供參考,有助于建立標準化的PHC大鼠模型。

1 資料與方法

1.1研究資料 以“原發(fā)性肝癌”“大鼠模型”為關鍵詞檢索中國知網(wǎng)(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫文獻,檢索時限為1996年1月至2021年12月。共檢索到302篇文獻,除去主題詞偏差文獻、不相關文獻、重復文獻,以及動物造模方法關鍵環(huán)節(jié)缺失、數(shù)據(jù)缺失的文獻,最終納入115篇文獻進行分析,其發(fā)表年份分布見圖1。

圖1 115篇文獻的發(fā)表年份分布圖

1.2研究方法 針對納入的115篇文獻,進行詳細閱讀,對文獻中實驗大鼠種類、誘導劑、造模方法、造模周期、造模成功率及評價方法進行整理、總結(jié)并分析。

2 結(jié)果

2.1實驗大鼠 所納入文獻中,60篇(52.2%)為Wistar大鼠,52篇(45.2%)為Sprague-Dawley(SD)大鼠,2篇(1.7%)為Fisher 344大鼠,1篇(0.9%)文獻未說明所用大鼠品系。98篇(85.2%)文獻所用大鼠性別為雌性,7篇(6.1%)文獻所用大鼠為雄性,6篇(5.2%)文獻所用大鼠為雌、雄參半,另有4篇(3.5%)文獻未具體說明所用大鼠性別。115篇文獻中有106篇(92.2%)對大鼠的體重進行了描述,質(zhì)量為120～180(156.56±8.25)g。55篇(47.8%)文獻對大鼠的年齡進行了描述,年齡為5～8周齡,平均6.5周。8篇僅描述為“成年大鼠”。

2.2造模藥物 所納入文獻中,PHC大鼠造模所用誘導劑主要分為7種。73篇(63.5%)采用二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)配制的水溶液;13篇(11.3%)采用DEN+滅菌食用水混合配制;8篇(7.0%)采用DEN+四氯化碳(CCL4)混合配制;6篇(5.2%)采用DEN+生理鹽水混合配制;3篇(2.6%)采用DEN+標準飼料混合配制;4篇(3.5%)采用二乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene,2-AAF)直接配制;1篇(0.9%)為黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)直接配制;7篇(6.1%)未做系統(tǒng)描述,見表1。

表1 115篇文獻造模藥物使用情況

2.3造模方法 所納入文獻中,PHC大鼠造模方法主要有6種。41篇(35.7%)采用自由飲用法;34篇(29.6%)采用腹腔注射法;7篇(6.1%)采用腹腔注射+自由飲用法;11篇(9.6%)采用灌胃法;7篇(6.1%)采用皮下注射+自由飲用法;3篇(2.6%)采用腹腔注射+灌胃法;其余12篇(10.4%)未說明造模方法,見表2。

表2 115篇文獻造模方法情況

2.4造模評價方法 115篇文獻中,41篇(35.7%)采用主觀評價法來評價造模是否成功,55篇(47.8%)采用客觀評價法,有10篇(8.7%)采用超聲影像學評價法;其余9篇(7.8%)未說明評價方法,見表3。

表3 115篇文獻造模評價方法情況

2.5造模周期及造模成功率 在納入文獻中,采用自由飲用法約需18周可觀察到造模結(jié)果,成功率為87.5%;采用腹腔注射法約需16周可觀察到造模結(jié)果,成功率為90.0%;采用腹腔注射+自由飲用法約需16周可觀察到造模結(jié)果,成功率為60.0%;采用灌胃法約需18周可觀察到造模結(jié)果,成功率達100.0%;采用皮下注射+自由飲用法約需12周可觀察到造模結(jié)果,成功率達100.0%;采用腹腔注射+灌胃法約需18周可觀察到造模結(jié)果,成功率為80.0%,見表4。

表4 115篇文獻造模周期及造模成功率情況

3 討論

3.1本研究通過對1996—2021年發(fā)表的關于PHC大鼠造模的相關文獻進行檢索,并對納入文獻中的大鼠品系、誘癌藥物、造模方法、造模周期以及評價方法等進行整理、總結(jié)、分析,發(fā)現(xiàn)PHC大鼠造模研究仍存在以下不足:(1)造模大鼠種類。研究者更傾向于選用Wistar大鼠和SD大鼠[6],但對于大鼠的性別、體質(zhì)量,各文獻無統(tǒng)一標準,且研究者大多選用年齡較小,體質(zhì)量在120～180 g的大鼠,而不少文獻對大鼠的年齡和體質(zhì)量更無具體描述[7-8]。這些因素是否會對造模成功有影響,暫無相關數(shù)據(jù)支持。(2)誘導劑。構建PHC大鼠模型所選取的誘導劑與造模方法密切相關,不同種類的誘導劑,甚至是同一誘導劑的相同濃度下,不同給藥時間仍會導致造模成功率存在差異。王金娥和姜慧杰[9]以0.01% DEN按照不同給藥時間構建PHC模型,當予0.01% DEN飲用水飲用12周,則可誘導出用于肝硬化-肝癌影像學研究的PHC大鼠模型,可觀察到肝臟癌前病變演變的過程;當予0.01% DEN飲用水飲用14周,則可誘導出用于MR增強觀察肝硬化-癌變情況的PHC大鼠模型;當予0.01% DEN飲用水飲用15周,則可穩(wěn)定誘導出與人類肝癌發(fā)展過程相似的PHC模型,且此方法造模后期腫瘤體積較大,對肝癌的早期影像診斷以及腫瘤徑線的測量都具有重要意義。(3)造模方法。本研究納入文獻以DEN自由飲用法與DEN腹腔注射法使用居多,此類方法操作方便,成本低,誘癌成功率較高。值得注意的是,皮下注射+自由飲用法以及灌胃法誘癌成功率高達100.0%。皮下注射+自由飲用法由于皮下注射CCL4濃度不同,會導致其作用部位不同,且由于CCL4具有易揮發(fā)性,故在實驗室中使用不多。而灌胃法由于造模周期長,長期灌胃對大鼠機體有一定損害,易導致口腔和消化道感染等,在實驗研究中亦使用較少。皮下注射+自由飲用法使用CCL4聯(lián)合DEN誘癌,操作難度較低,造模周期短,模型穩(wěn)定性高,可重復性強,是廣泛使用的造模方法。灌胃法較自由飲用法具有給藥易控制、死亡率低、誘癌率高等優(yōu)點,建議作為藥物干預和療效分析的造模方法。(4)造模評價。在納入的文獻中,主要采用了主觀評價法和客觀評價法對造模結(jié)果進行評價。主觀評價法[10-11]:隨著實驗進行,實驗大鼠會逐漸出現(xiàn)毛色晦暗、精神萎靡、活動減少、食欲減退、消化不良、體質(zhì)量下降等表現(xiàn)。在造模過程中觀察實驗大鼠相關癥狀出現(xiàn)時間并稱取其肝臟的重量,癥狀出現(xiàn)的時間越早,肝臟的重量越重,則造模成功率越高。該評價方法操作簡單、層次清晰,但一些具體細節(jié)尚未能統(tǒng)一標準,包括無具體的觀察時間點及所需觀察時長等。關于病理學評價,陳波和何生[12]通過CCL4+DEN法誘癌,在給藥后12周左右解剖大鼠腹部,可見其肝臟明顯腫大,肝臟表面可見約0.3 cm大小的結(jié)節(jié);通過取肝臟組織制作病理切片,證實為肝硬化-肝癌。該評價方法層次清晰、邏輯分明,可信度高,但操作較繁瑣,所需時間較長,成本較高。關于超聲影像學評價方法,有研究通過大鼠肝臟超聲進行觀察,腹部脫毛后予凝膠外涂,通過腹壁獲取肝臟及鄰近結(jié)構的冠狀面和矢狀面圖像,可探及腫瘤,表現(xiàn)為圓形或類似圓形的低回聲結(jié)節(jié),未見包膜,邊界清楚,有明顯的聲暈,內(nèi)部回聲略不均勻,當腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)壞死時,可表現(xiàn)低回聲或無回聲[13-15]。該評價方法可動態(tài)研究大鼠肝癌模型的形成過程,可以在圖像中顯示大鼠模型肝癌病變的程度以及范圍,對于肝癌的早期研究具有一定幫助。但該評價方法對操作者要求較高,需具備一定的影像學理論基礎及操作經(jīng)驗。

3.2各文獻評價方法的觀察時間點、時長以及大鼠出現(xiàn)癥狀程度目前無統(tǒng)一標準,筆者建議可采用主觀、客觀聯(lián)合評價的方法來對造模結(jié)果進行評價,即在誘發(fā)大鼠肝癌模型前期(10周之內(nèi))主要采用主觀評價,間斷性對實驗大鼠進行稱重,觀察它們的食欲、毛發(fā)、活動以及對外界的刺激等[16];而在造模后第3、6、9周隨機挑選大鼠,處死后觀察肝臟大小、外形、表面顏色、質(zhì)地以及病灶情況等以進行客觀評價[17-18]。在造模10周后聯(lián)合影像學方法進行輔助評價,早期可觀察到病灶,并顯示病灶的部位及大小。在造模晚期(16～18周)開始處死大鼠,取其肝臟觀察病變部位并通過病理檢查確證PHC大鼠模型的構建結(jié)果[19-21]。

綜上所述,對于PHC大鼠造模,研究者采用不同的大鼠種類、誘導劑及造模方法,會出現(xiàn)不同的臨床癥狀及病理學特點,造模成功率亦有所差異,可根據(jù)研究需求來選擇合適的PHC大鼠造模方法。