曹宇生, 梁浩源, 李林濤, 蔣開(kāi)海, 黃天賦, 李廣生, 黃許森

作者單位：1.右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科,百色 533000

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是發(fā)病率第三、死亡率第二的惡性腫瘤[1]。預(yù)計(jì)到2040年,全球CRC新增病例超過(guò)300萬(wàn),每年可造成約160萬(wàn)例患者死亡[2]。CRC的早期診斷和治療都極為困難,患者預(yù)后差,且患病年齡有年輕化的趨勢(shì),給社會(huì)帶來(lái)很大的負(fù)擔(dān)。CRC的發(fā)生與年齡、生活習(xí)慣、遺傳因素、環(huán)境因素等密切相關(guān)[3-5]。林奇綜合征、家族性腺瘤性息肉病會(huì)增加CRC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。有研究顯示,一級(jí)親屬中有CRC病史者,罹患CRC的風(fēng)險(xiǎn)可升高約20%[6]。CRC患者預(yù)后不佳,盡管近年治療方法有所發(fā)展和改進(jìn),但患者的5年總生存率仍不理想[7-8]。miR-3189是一種嵌入GDF15基因內(nèi)含子的新型靈長(zhǎng)類動(dòng)物特異性微小RNA(micro RNA,miRNA)[9]。由miR-3189編碼的前體序列在莖環(huán)內(nèi)包含2個(gè)成熟的miRNA序列,即miR-3189-3p和miR-3189-5p,長(zhǎng)度分別為21個(gè)核苷酸和25個(gè)核苷酸[10]。有研究顯示,miR-3189-3p在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[11-12],但其在CRC中的報(bào)道較少。本文旨在探討miR-3189-3p對(duì)CRC相關(guān)生物活動(dòng)的作用,為CRC的診療方法研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1生物信息學(xué)分析 應(yīng)用CancerMIRNome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.jialab-ucr.org/CancerMIRNome/),點(diǎn)擊“query”,在“search a miRNA”模塊中輸入“miRNA-3189-3p”,在“TCGA pan-cancer”和“TCGA project”模塊分析miRNA-3189-3p在癌組織與正常組織中表達(dá)水平的差異,以及miRNA-3189-3p表達(dá)水平對(duì)CRC患者生存預(yù)后的影響。應(yīng)用ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://starbase.sysu.edu.cn/),點(diǎn)擊“pan-cancer”,在“miRNA differential expression”及“miRNA survival analysis”模塊中進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-3189-3p在CRC組織與正常組織中表達(dá)水平的差異,以及miRNA-3189-3p表達(dá)水平對(duì)CRC患者生存預(yù)后的影響。

1.2主要實(shí)驗(yàn)材料 DMEM高糖培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司);標(biāo)準(zhǔn)級(jí)胎牛血清(賽業(yè)生物科技有限公司);磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(北京索萊寶科技有限公司);Opti-MEMTMI減血清培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),含酚紅(美國(guó)Gibco公司);高效RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司);Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司);hsa-miR-3189-3p mimics、U6的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物(上海生工生物工程有限公司);蛋白上樣緩沖液(loading buffer)(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);miRNA第一鏈cDNA合成(莖環(huán)法)試劑盒(上海生工生物工程有限公司);0.2%結(jié)晶紫染色液(北京索萊寶科技有限公司);4%組織細(xì)胞固定液(北京索萊寶科技有限公司);hsa-miR-3189-3p mimics、miR-3189-3p NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);無(wú)蛋白快速封閉液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗,辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);通用型抗體稀釋液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司)。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(MVS-83,Thermo Scientific);超速離心機(jī)(WX100+,Thermo Scientific)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將人CRC細(xì)胞LOVO從-80 ℃冰箱取出,37 ℃水浴快速解凍,加入3倍體積完全培養(yǎng)液(DMEM高糖培養(yǎng)基與胎牛血清比例為9∶1)重懸,以1 000 r/min離心5 min后,盡量吸去上清液,加完全培養(yǎng)液重懸后接種至T25培養(yǎng)瓶,搖晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞分布均勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待T25培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合度達(dá)到約90%時(shí),按2×105cells/孔接種至6孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)到90%后換Opti-MEMTMI減血清培養(yǎng)基饑餓處理2 h。通過(guò)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將溶解于Opti-MEMTMI減血清培養(yǎng)基的miR-3189-3p mimics和miR-3189-3p NC轉(zhuǎn)染至LOVO細(xì)胞中,分別設(shè)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。轉(zhuǎn)染6 h后,將Opti-MEMTMI減血清培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)液。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測(cè)miRNA-3189-3p表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,采用Trizol法提取總RNA,應(yīng)用miRNA第一鏈cDNA合成(莖環(huán)法)試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR,反應(yīng)體系:2×Power Up SYBR Green Master Mix 10 μL,正向、反向引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7.2 μL。所用引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃ 2 min,1個(gè)循環(huán);變性95 ℃ 15 s,退火/延伸60 ℃,1 min,40個(gè)循環(huán)。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,以U6為內(nèi)參,通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-3189-3p的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5Western blot法檢測(cè)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。按蛋白體積4∶1的比例加入5×loading buffer液,100 ℃金屬加熱儀上變性處理15 min。以每孔30 μg蛋白上樣量進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn),初始電壓為80 V,待條帶至下層膠后電壓調(diào)高至120 V。通過(guò)電轉(zhuǎn)法(200 mA,110 min)將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。用無(wú)蛋白快速封閉液封閉處理PVDF膜2 h,然后用1×TBST液清洗PVDF膜3次,10 min/次。將PVDF膜與N-cadherin、vimentin及GAPDH一抗液(1∶5 000稀釋)在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。用1×TBST液清洗PVDF膜3次,10 min/次。將PVDF膜與二抗液(1∶10 000稀釋)室溫條件下孵育1 h。用1×TBST液清洗PVDF膜3次,10 min/次。應(yīng)用ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行顯影處理。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后,向6孔板內(nèi)加入700 μL 0.25%胰蛋白酶,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min。以1 000 r/min條件離心5 min,重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將劃痕實(shí)驗(yàn)插件放入6孔板孔內(nèi),用鑷子輕輕按壓固定,每孔接種2×105cells后繼續(xù)培養(yǎng)。待劃痕實(shí)驗(yàn)插件小孔中細(xì)胞長(zhǎng)滿后拔除插件,用PBS清洗2次,每孔加1 mL無(wú)血清培養(yǎng)液,鏡下測(cè)量細(xì)胞劃痕寬度并做記錄,24 h后再次記錄劃痕寬度。細(xì)胞遷移比例=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。重復(fù)四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)前1 d,向Transwell小室中加入基質(zhì)膠。轉(zhuǎn)染6 h后,將LOVO細(xì)胞經(jīng)消化、離心、重懸處理,計(jì)數(shù)后以O(shè)pti-MEMTMI減血清培養(yǎng)基配制為2.5×106cells/mL的細(xì)胞懸液。向小室的上室加入200 μL LOVO細(xì)胞懸液,下室加入650 μL完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后吸去上室Opti-MEMTMI減血清培養(yǎng)基,予PBS清洗2次。在小室的上室和下室分別加入200 μL、600 μL 4%組織細(xì)胞固定液,固定30 min。使用棉簽輕輕擦去上室細(xì)胞,PBS沖洗2次,予0.2%結(jié)晶紫染色液染色20 min,在倒置顯微鏡下記錄染色細(xì)胞數(shù)量。重復(fù)四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1生物信息學(xué)分析結(jié)果 CancerMIRNome在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示,與正常組織相比,miR-3189-3p在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)、結(jié)腸腺癌(colon adenocarcinoma,COAD)、胃腺癌(stomach adenocarcinoma,STAD)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP)、膽管癌(cholangio carcinoma,CHOL)、膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BLCA)、乳腺浸潤(rùn)癌(breast invasive carcinoma,BRCA)、腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)、肝細(xì)胞癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)、前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma,PRAD)、甲狀腺癌(thyroid carcinoma,THCA)、子宮體子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)等癌組織中呈高表達(dá)(P<0.05),在嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(pheochromocytomas and paragangliomas,PCPG)組織中呈低表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)圖1?。CRC組織的miR-3189-3p表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.05),見(jiàn)圖1?。miR-3189-3p高表達(dá)CRC患者的生存預(yù)后較低表達(dá)者更好(P<0.05),見(jiàn)圖1?。通過(guò)ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)也驗(yàn)證了上述miR-3189-3p與CRC的相關(guān)結(jié)果,見(jiàn)圖2。

?miR-3189-3p在泛癌組織中存在差異表達(dá),*P<0.05,ns為P>0.05;?CRC組織和正常組織miR-3189-3p表達(dá)水平比較,P=0.002;?miR-3189-3p高表達(dá)與低表達(dá)CRC患者的生存曲線比較

?CRC組織和正常組織miR-3189-3p表達(dá)水平比較,P<0.001;?miR-3189-3p高表達(dá)與低表達(dá)CRC患者的生存曲線比較,P<0.05

2.2實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組miR-3189-3p表達(dá)水平比較 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組miR-3189-3p表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.840,P=0.007),見(jiàn)圖3。提示miR-3189-3p mimics轉(zhuǎn)染成功。

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組miR-3189-3p表達(dá)水平比較圖(*P<0.05)

2.3實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組EMT關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平比較

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組N-cadherin、vimentin相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.142,P=0.006;t=3.292,P=0.046),見(jiàn)圖4。

?Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖;?兩組N-cadherin相對(duì)表達(dá)量比較(*P<0.05);?兩組vimentin相對(duì)表達(dá)量比較(*P<0.05)

2.4實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞遷移能力比較 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移比例小于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.266,P=0.005),見(jiàn)圖5。

?劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖;?兩組細(xì)胞遷移比例比較(*P<0.05)

2.5實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞侵襲能力比較 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲數(shù)量少于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.792,P=0.003),見(jiàn)圖6。

?Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖;?兩組細(xì)胞侵襲數(shù)量比較(*P<0.05)

3 討論

3.1研究表明,CRC的發(fā)生發(fā)展與飲食、遺傳等因素有關(guān)[13]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的新發(fā)病例得以被發(fā)現(xiàn),我國(guó)的CRC患病率正逐年增高[14]。因此,在CRC的治療上對(duì)改善患者生存預(yù)后及生活質(zhì)量等方面提出了更高的要求。miRNA是一種短分子RNA,長(zhǎng)度一般為19～25個(gè)核苷酸,單個(gè)miRNA可以靶向多個(gè)mRNA,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),影響其功能[15]。miRNA在癌癥的早期篩查中也有一定作用[16]。有研究指出miR-3189-3p是67GDF15基因嵌入產(chǎn)生的主要miRNA[17]。在星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,miR-3189-3p的表達(dá)下調(diào),miR-3189-3p過(guò)表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[10,18]。此外,miR-3189在膽管癌和口腔癌中顯示出潛在的診斷應(yīng)用價(jià)值[19-20]。也有研究發(fā)現(xiàn),miR-3189-3p可抑制胃癌細(xì)胞的糖酵解過(guò)程,并能通過(guò)調(diào)節(jié)絲切蛋白2(cofilin 2,CFL2)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[11]。真核細(xì)胞始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1,4EBP1)通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)翻譯的抑制劑,其在癌癥中常過(guò)度表達(dá)[21-22],而miR-3189-3p可通過(guò)調(diào)控4EBP1來(lái)介導(dǎo)骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因同源物(myelocytomatosis viral oncogene homolog,v-MYC)的翻譯,抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[12]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最具侵襲性的腦腫瘤之一,miR-3189-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中呈低表達(dá),并可通過(guò)調(diào)控E2F家族轉(zhuǎn)錄因子-1(E2F transcription factor-1,E2F-1)的表達(dá)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[10]。miR-3189-3p不僅在癌癥中發(fā)揮重要作用,對(duì)骨關(guān)節(jié)炎也有一定影響。有研究發(fā)現(xiàn),circ_0110251緩解了軟骨細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解,而miR-3189-3p過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)此作用[23]。

3.2EMT是一種上皮細(xì)胞在各種因素的作用下,上皮特征向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變,并表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)行為的細(xì)胞過(guò)程[24]。EMT常見(jiàn)于各種腫瘤細(xì)胞的病理活動(dòng)中,參與腫瘤的發(fā)生,并影響著腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等行為,且與腫瘤耐藥也有一定關(guān)聯(lián)[25]。miRNA在EMT相關(guān)癌癥轉(zhuǎn)移中也起到調(diào)節(jié)作用[26]。參與Wnt-β-連環(huán)蛋白通路的miR-504可通過(guò)下調(diào)卷曲類受體7(frizzled homolog 7,FZD7)表達(dá)來(lái)抑制多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲、遷移以及EMT等行為[27]。有研究表明,miR-4319能夠通過(guò)靶向叉頭框Q1(forkhead box Q1,FOXQ1)基因來(lái)抑制肝細(xì)胞癌的增殖、EMT和腫瘤干性[28]。miR-145可靶向多個(gè)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn)其作用與CRC的EMT呈負(fù)向關(guān)系。此外,鋅指轉(zhuǎn)錄因子1(snail homolog 1,Snail 1)可以通過(guò)抑制miR-145的表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對(duì)放療產(chǎn)生抗性[29]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)來(lái)源于癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast,CAF)的外泌體,其包含的miR-625-3p可通過(guò)抑制CUGBP和ETR-3樣因子2(CUGBP and ETR-3-like factor 2,CELF2)/WW域的氧化還原酶基因(WW domain containing oxidoreductase,WWOX)通路促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移、侵襲、EMT以及化療耐藥[30]。

3.3本研究基于CancerMIRNome在線數(shù)據(jù)庫(kù)和ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)miR-3189-3p在多種腫瘤中存在表達(dá)異常,且CRC組織中miR-3189-3p表達(dá)水平高于正常組織,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),miR-3189-3p高表達(dá)CRC患者的生存預(yù)后情況較低表達(dá)者更好。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,過(guò)表達(dá)miR-3189-3p的LOVO細(xì)胞,其遷移和侵襲能力減弱,且對(duì)EMT存在一定的影響。提示miR-3189-3p對(duì)CRC的發(fā)生發(fā)展有重要作用,并影響患者的生存預(yù)后。關(guān)于miR-3189-3p在CRC中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)值得進(jìn)一步探討。

綜上所述,miR-3189-3p對(duì)CRC細(xì)胞的遷移、侵襲以及EMT有一定影響,并與患者的生存預(yù)后相關(guān)聯(lián),研究結(jié)果為CRC的診療技術(shù)開(kāi)發(fā)提供了參考。