馬立聰,閻小霞,高 芳,董文杰,李迎澤,賈彥彬

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)也稱大腸癌,是常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率均位于常見惡性腫瘤的第五位[1]。結(jié)直腸癌患者發(fā)現(xiàn)時往往已達中晚期,手術(shù)切除是治療結(jié)直腸癌常見的手段之一,但術(shù)后常出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移,5年生存率不足10%[2-3]。因此,早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是防治結(jié)直腸癌的關(guān)鍵,尋找經(jīng)濟有效的結(jié)直腸癌早期診斷的生物標志物對于尋找結(jié)直腸癌高危人群至關(guān)重要。

哺乳動物不育系20樣激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)是Hippo腫瘤抑制通路中的上游分子,前期研究[4]報道,在胃腸道腫瘤中,MST1往往表達降低。研究[5]證明,結(jié)直腸癌的發(fā)病過程與單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)相關(guān)。目前,缺乏對于MST1SNPs與結(jié)直腸癌相關(guān)性的研究,本研究通過病例-對照關(guān)聯(lián)研究的方法,在包頭地區(qū)漢族人群中檢測MST1基因多態(tài)性及其單體型,同時研究其與結(jié)直腸癌發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性,并對疾病進行分層分析,明確MST1SNPs與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,旨在為結(jié)直腸癌早期診斷和治療找到新的突破口。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2018年9月—2019年10月在包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理學確診為結(jié)直腸癌的患者390例(直腸癌:216例,結(jié)腸癌:174例)為病例組,納入標準為:新發(fā)病例,尚未接受過放化療,無其他既往癌癥病史。收集同期于包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院進行正常體檢的人群413例為對照組,納入標準為:無消化系統(tǒng)疾病和遺傳病史。所有患者和體檢人群要求為漢族,無與其他民族通婚史,在包頭市生活5年以上,采用EDTA抗凝管留取2 ml外周血。所有參與者均提供知情同意書,該項目獲包頭醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會審查通過:包醫(yī)倫理人體2021第(007)號。

1.2 SNP的篩選和基因分型SNP的篩選方法已在其他文章中詳細描述[6],簡要來說:根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心-人類單體型圖數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的中國漢族人群遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)進行篩選,篩選范圍包括基因第一個外顯子上游20 kb和最后一個外顯子下游10 kb的序列,以保證包含了基因的調(diào)控序列,要求篩選的SNP在中國漢族人群中的最小等位基因頻率(minor allele requency,MAF)>5%,連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD) 相關(guān)系數(shù)r2>0.8。采用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司,貨號:YDP348-03)提取所有血液樣本的基因組DNA。采用Taqman探針法對篩選出的SNPs進行分型,并隨機選取5%DNA樣本進行重復實驗,基因分型由北京賽默百合生物科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。采用卡方檢驗檢測各SNP的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡,以檢驗本研究所選的樣本在群體中是否具有代表性;秩和檢驗比較年齡因素在病例組和對照組之間的分布差異;卡方檢驗比較性別因素以及單體型頻率在病例組和對照組之間的分布差異;Logistic回歸計算經(jīng)年齡、性別調(diào)整后的比值比(odds ratio,OR)以及95%置信區(qū)間(confidence interval,CI),用以評估四個SNP在共顯性、顯性、超顯性、隱性四種遺傳模型下與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián),以及評估單體型與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián),并對疾病進行分層分析。計算赤池信息準則(akaike information criterion,AIC)和貝葉斯信息準則(Bayesian information criterion,BIC)來評價模型擬合優(yōu)良性,AIC 和 BIC 的值越小,則表示模型對數(shù)據(jù)的擬合度越好此,模型則為最佳模型。采用SHEsis軟件對篩選出的MST1基因的SNP按照其在基因上的位置順序構(gòu)建單體型,并計算經(jīng)標準化的連鎖不平衡系數(shù)D′值和r2值用于評估連鎖不平衡狀態(tài)。當D′=0,r2=0時,處于完全連鎖平衡狀態(tài);當D′=1,r2=1時,處于完全連鎖不平衡狀態(tài)。D′值和r2值越接近1,連鎖不平衡程度越高。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般情況的比較病例組中,男性234人(60.0%),女性156人(40.0%),平均年齡(60.82±10.94)歲。對照組中,男性261例(63.2%),女性152例(36.8%),平均年齡(57.24±10.78)歲。經(jīng)統(tǒng)計分析,各病例組平均年齡較正常人組更高,年齡因素在正常人組和結(jié)直腸癌組(Z=-5.007,P<0.001)、正常人組和結(jié)腸癌亞組(Z=-3.585,P<0.001)以及正常人組和直腸癌亞組(Z=-4.491,P<0.001)間的分布差異均有統(tǒng)計學意義;與正常人比較,結(jié)腸癌組女性患者比例更高,分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.860,P=0.027),正常人組與結(jié)直腸癌組和直腸癌亞組之間的性別分布差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.867、0.266,均P>0.05)。見表1。

表1 研究對象一般情況的比較

2.2 SNP篩選和基因分型結(jié)果本研究共篩選出MST1基因4個SNPs,即rs8000,rs2234197,rs2267853,rs6073629。基因分型結(jié)果見表2。分型成功率均大于95%,5%樣本的重復實驗一致率為100%。

表2 基因分型結(jié)果[n(%)]

圖1 MST1 4個SNPs的單體型構(gòu)建圖(以結(jié)直腸癌為結(jié)局變量)

表3 四種遺傳模型下各SNP與結(jié)直腸癌發(fā)病風險的Logistic 回歸分析結(jié)果

表4 MST1單體型與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián)分析

2.4 各SNP及單體型與直腸癌發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果Logistic 回歸分析結(jié)果顯示,MST1SNP rs2234197 AG基因型在共顯性和超顯性遺傳模型下均與直腸癌發(fā)病風險相關(guān)聯(lián)(均P<0.05)。因超顯性遺傳模型AIC和BIC值最小,提示超顯性遺傳模型為最適遺傳模型,與攜帶GG+AA基因型者相比,攜帶AG基因型者直腸癌發(fā)病風險降低[OR(95%CI)=0.657(0.442～0.976)]。見表5。以直腸癌為結(jié)局變量構(gòu)建單體型,并分析單體型與直腸癌發(fā)病風險的關(guān)系。結(jié)果顯示,共構(gòu)建出5個單體型,即AGAG,AGGT,GAGG,GGAG和GGGT,各單體型與直腸癌發(fā)病風險均無關(guān)聯(lián)(均P>0.05)。見表6。rs6073629與rs8000(D′=0.991,r2=0.460)和rs2267853與rs8000(D′=0.936,r2=0.288)之間分別存在強連鎖不平衡,構(gòu)成單體型塊。見圖2。

圖2 MST1 4個SNPs的單體型構(gòu)建圖(以直腸癌為結(jié)局變量)

表5 四種遺傳模型下各SNP與直腸癌發(fā)病風險關(guān)聯(lián)性的Logistic 回歸分析結(jié)果

表6 MST1單體型與直腸癌的關(guān)聯(lián)分析

2.5 各SNP及單體型與結(jié)腸癌發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果Logistic 回歸分析結(jié)果顯示,MST1SNP rs8000在隱性遺傳模型下與結(jié)腸癌發(fā)病風險相關(guān),與攜帶TT+GT基因型者相比,攜帶GG基因型者結(jié)腸癌發(fā)病風險降低[OR(95%CI)=0.425(0.182～0.992)]。見表7。以結(jié)腸癌為結(jié)局變量構(gòu)建單體型,并分析單體型與結(jié)腸癌發(fā)病風險的關(guān)系。結(jié)果顯示,共構(gòu)建出5個單體型,即AGAG,AGGT,GAGG,GGAG和GGGT,各單體型與結(jié)腸癌發(fā)病風險均無關(guān)聯(lián)(均P>0.05)。見表8。rs6073629與rs8000(D′=1.000,r2=0.471)和rs2267853與rs8000(D′=0.931,r2=0.281)之間分別存在強連鎖不平衡,構(gòu)成單體型塊。見圖3。

圖3 MST1 4個SNPs的單體型構(gòu)建圖(以結(jié)腸癌為結(jié)局變量)

表7 四種遺傳模型下各SNP與結(jié)腸癌發(fā)病風險關(guān)聯(lián)性Logistic 回歸分析結(jié)果

表8 MST1 單體型與結(jié)腸癌的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程復雜,是性別、年齡、飲食、吸煙、環(huán)境和遺傳等多因素作用的結(jié)果[7],目前,MST1與腫瘤的關(guān)系已被少量報道[8-10]。在胃腸道腫瘤中,MST1表達減少,下調(diào)了對下游大腫瘤抑制激酶1/2以及效應因子Yes相關(guān)蛋白/PDZ結(jié)合域轉(zhuǎn)錄共刺激因子的磷酸化作用,導致組織過度生長和腫瘤的發(fā)生[11]。腸道增生性腺瘤是結(jié)直腸癌癌前病變的最常見形式,Qin et al[12]通過特異性條件敲除小鼠的MST1基因發(fā)現(xiàn),實驗小鼠腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂,未分化細胞膨脹,可見異常增生的上皮細胞和腺瘤形成。Wu et al[13]研究發(fā)現(xiàn),重組的MST1能夠抑制人結(jié)直腸癌細胞系SW480的增殖,并誘導其凋亡。遺傳因素是影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的主要因素,并且有明確的文獻[7]報道,基因的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)病相關(guān)。Gong et al[5]發(fā)現(xiàn)KBTBD11基因SNP rs11777210與其附近的MYCSNP rs6983267之間存在交互作用,并且與攜帶 rs6983267 TT-rs11777210 TT基因型人群相比,攜帶rs6983267 GG-rs11777210 CC 基因型者結(jié)直腸癌易感性提高2.83倍。

本研究對MST1基因SNP與結(jié)直腸癌發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性進行了研究,并對疾病進行分層分析。在對疾病分層前,并未發(fā)現(xiàn)MST1各SNP與結(jié)直腸癌發(fā)病風險相關(guān)。隨后,本研究將結(jié)直腸癌分層為直腸癌和結(jié)腸癌,分析結(jié)果顯示,當以直腸癌為結(jié)局變量時,SNP rs2234197與直腸癌發(fā)病風險相關(guān),與攜帶GG+AA基因型者相比,攜帶AG基因型者直腸癌發(fā)病風險降低,提示rs2234197 AG基因型或許是直腸癌的保護性因素。目前有關(guān)該SNP與疾病的關(guān)聯(lián)研究尚無報道,本研究的實驗結(jié)果為其他學者對該SNP的進一步研究提供依據(jù)。當以結(jié)腸癌為結(jié)局變量時,本研究發(fā)現(xiàn)SNP rs8000與結(jié)腸癌發(fā)病風險相關(guān),與攜帶TT+GT 基因型者相比,攜帶GG基因型者結(jié)腸癌發(fā)病風險降低,提示rs8000 GG基因型可能是結(jié)腸癌的保護性因素。關(guān)于rs8000的研究報道非常有限,目前僅有Shen et al[14]研究了rs8000與肝細胞癌的關(guān)聯(lián)性,但并未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在關(guān)聯(lián),這提示MST1SNP rs8000在不同消化系統(tǒng)腫瘤中所起的作用可能不同。分層分析結(jié)果說明同一SNP在不同部位的腸癌中的作用可能不同。

總之,本研究通過篩選MST1基因潛在致病的SNP位點,并分析了SNPs與結(jié)直腸癌、直腸癌及結(jié)腸癌發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)了MST1基因SNP rs2234197 AG基因型和SNP rs8000 GG基因型可能分別是直腸癌和結(jié)腸癌的保護性因素,該發(fā)現(xiàn)可能為結(jié)直腸癌患者的診治提供依據(jù)。本研究尚存在一些不足之處。第一,本研究基于基因水平,所研究的SNP是否影響其編碼的蛋白MST1的表達水平和功能,并影響Hippo信號通路中位于其下游的分子的表達和功能,進一步導致了疾病的發(fā)生發(fā)展尚不清楚,未來需要進一步通過體內(nèi)和體外實驗驗證本文中所研究的SNP位點的功能。第二,研究樣本納入量較小,且納入人群僅為漢族,因此還需擴大樣本量在不同的人群中進一步證實本研究的發(fā)現(xiàn)。第三,雖然已嚴格限制樣本的納入條件,但病例組和對照組的樣本來源于不同的醫(yī)院,這可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚。