鐵皮石斛14-3-3 基因家族鑒定及表達分析

江林琪 趙佳瑩 鄭飛雄 姚馨怡 李效賢 俞振明，2

（1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，杭州 311402；2.浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，杭州 310053）

隨著全球環(huán)境氣候的變化，植物因其固著生長的屬性而無法規(guī)避所受到的環(huán)境脅迫，具有應對低溫、干旱和鹽堿等非生物脅迫的特質(zhì)已逐漸成為影響植物正常生長發(fā)育的關鍵要素［1］。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的名貴滋補中藥材，被譽為“藥界大熊貓”。鐵皮石斛以莖入藥，可益胃生津，滋陰清熱；葉片可制作成食品，具有降脂的療效；花可制作成花草茶，具有降血糖及抗氧化的功效［2］。但由于鐵皮石斛對生存環(huán)境的需求較為嚴苛，極易受到干旱、鹽堿以及極端溫度等逆境脅迫的影響［3-4］，從而損害植物的生長發(fā)育。

14?3?3 蛋 白，又 稱 通 用 調(diào) 節(jié) 因 子（general regulatory factor, GRF），以多基因家族形式廣泛存在于真核生物中且高度保守［5］。14?3?3 蛋白最早發(fā)現(xiàn)于牛腦組織細胞中，因其在二乙氨乙基纖維素層析后的片段數(shù)量及在凝膠電泳中的遷移率而得名。植物14?3?3 蛋白依據(jù)序列同源性分為ε 類（epsilon group）和非ε 類（non?epsilon group），它們通過不同策略與靶蛋白相互作用，參與植物生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導、營養(yǎng)代謝調(diào)控、逆境脅迫應答等諸多調(diào)控過程［6-8］。

隨著基因組測序飛速發(fā)展，大量植物14?3?3 家族成員在基因組層面得以鑒定，例如辣椒（Capsicum annuum）［9］、馬鈴薯（Solanum tuberosum）［10］、黃瓜（Cucumis sativus）［11］、 水 稻（Oryza sativa）［12］、木 薯（Manihot esculenta）［13］、 茶 樹（Camellia sinensis）［14］等，表明植物14?3?3 蛋白在不同物種中廣泛存在，但這些基因在不同組織器官、外源激素及非生物脅迫下存在差異化的表達規(guī)律［15］，這與其氨基酸序列N 端和C 端的高度變異性息息相關。在水稻、大麥（Hordeum vulgare）、高粱（Sorghum bicolor）等禾本科植物中，GRF 家族成員響應脫落 酸（abscisic acid, ABA）、 茉 莉 酸 甲 酯（methyl jasmonate, MeJA）、 赤 霉 素（gibberellin, GA）、 吲哚?3?乙酸（indole?3?acetic acid, IAA）等多種外源激素處理，影響植物的生長發(fā)育及對逆境脅迫的應答過程［16］。擬南芥14?3?3λ 蛋白與蛋白激酶SOS2?like protein kinase 5 互作受鈣信號Ca2+激活調(diào)控并充當分子開關作用，進而被鹽脅迫信號激活，協(xié)同介導質(zhì)膜H+?ATPase 活性來調(diào)控鈉離子Na+穩(wěn)態(tài)，提高擬南芥對鹽脅迫的耐受性［17］。在擬南芥中過量表達蘋果（Malus domestica）MdGRF13 基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因株系中過氧化酶（peroxidase, POD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的活性水平，降低葉片相對電導率及丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，最終增強轉(zhuǎn)基因株系對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受能力［6］。然而截至目前對GRF 家族蛋白的研究主要聚焦于模式植物，鐵皮石斛14?3?3 基因家族及其成員的表達特征尚不清楚。

為研究GRF 蛋白在鐵皮石斛生長發(fā)育及逆境應答中的生物學功能，本研究基于鐵皮石斛染色體級別的基因組［4］，利用生物信息學方法，對鐵皮石斛14?3?3 基因家族進行全基因組鑒定，并對它們的理化性質(zhì)、保守基序、進化關系、染色體定位，及在不同組織器官、低溫處理、鹽脅迫處理的表達水平進行分析，為進一步研究鐵皮石斛GRF 蛋白的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛（D.officinale）采收自浙江中醫(yī)藥大學富春校區(qū)藥用植物園（E119.89, N30.08），于2022年6 月鐵皮石斛開花期間采收根（根、根尖和氣生根）、莖、葉、花（花蕾、萼片、唇瓣、花粉、合蕊柱）等不同器官，用于分析DoGRF1-DoGRF17 基因在不同組織器官的表達水平。鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)條件與先前報道相一致［18］，6 月齡的組培苗轉(zhuǎn)接至250 mmol/L NaCl 的1/2 MS 培養(yǎng)基中，在25℃，16 h /8 h（光照/黑暗交替），光照強度為100 mmol/(m2·s)的人工氣候室中培養(yǎng)，分別在0、4、12 h 后收集鐵皮石斛的葉和根［19］，用于分析DoGRF1-DoGRF17 基因響應鹽脅迫的表達水平。鐵皮石斛組培苗轉(zhuǎn)移至0℃培養(yǎng)箱，以人工氣候室中樣品為對照，6 h 后收集葉片，用于分析DoGRF1-DoGRF17 基因響應低溫的表達水平。以上樣品經(jīng)液氮速凍后，均保存于?80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛14?3?3 基因家族的挖掘與鑒定 在TAIR 網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org/）下載已公布的13 條擬南芥14?3?3 蛋白序列作為種子序列，在鐵皮石斛基因組［4］中通過BLAST 篩選（E?value ＜1e-5）并挖掘14?3?3 同源序列。通過NCBI?CDD 工具［20］對上述獲取的蛋白序列進一步篩選并獲得候選14?3?3。同時，對候選序列進行保守結(jié)構(gòu)域完整性的鑒定，在Pfam 網(wǎng)站（https://pfam.xfam.org）下載14?3?3 的保守結(jié)構(gòu)域（PF00244），利用HMMER軟件［21］，驗證鐵皮石斛基因組中的14?3?3 候選成員。最終鑒定到17 條14?3?3 家族成員，據(jù)其在染色體上的位置命名為DoGRF1-DoGRF17。

1.2.2 鐵皮石斛14?3?3 家族成員理化性質(zhì)、染色體定位及亞細胞定位預測 利用ExPASy 網(wǎng)站（http://cn.expasy.org/tools）分析鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)和總平均親水指數(shù)等理化性質(zhì)。通過BUSCA在 線 網(wǎng) 站（http://busca.biocomp.unibo.it/） 預 測DoGRF1-DoGRF17 蛋白的亞細胞定位。利用工具SOPMA（https://npsa?prabi.ibcp.fr/） 預 測DoGRF1-DoGRF17 蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用鐵皮石斛基因組注釋文件獲取DoGRF1-DoGRF17 基因在染色體上的位置信息，通過TBtools 軟件［22］將DoGRF1-DoGRF17基因映射到染色體上，可視化基因的染色體定位。

1.2.3 鐵皮石斛14?3?3 家族成員的系統(tǒng)進化樹分析 通過Phytozome 網(wǎng)站（http://www.phytozome.net）下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻、大豆（Glycine max）、非洲菊（Gerbera hybrida）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中已報道的14?3?3 蛋白序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。將鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17 與上述5 種植物的14?3?3 蛋白序列進行多重序列比對，采用MEGA X 軟件［23］的NJ 法構(gòu)建鐵皮石斛DoGRF家族成員的系統(tǒng)進化樹，Boostrap 值設置為1 000，其余默認參數(shù)。

1.2.4 分析鐵皮石斛14?3?3 家族的保守基序及基因結(jié)構(gòu) 通過MEME 在線網(wǎng)站（https://meme?suite.org）分析鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17 序列的保守基序，將motif 查找數(shù)量定為10，通過TBtools 軟件將保守基序結(jié)果進行可視化。

通過鐵皮石斛基因組的注釋文件獲取DoGRF1-DoGRF17 基因外顯子和內(nèi)含子的位置信息，利用GSDS 網(wǎng) 站（http://gsds.gao?lab.org/）繪 制DoGRF1-DoGRF17 基因的結(jié)構(gòu)特征。

1.2.5 分析鐵皮石斛14?3?3 家族基因啟動子的順式作用元件 利用PlantCARE 網(wǎng)站（https://bioinformat?ics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）檢索鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17 基因啟動子前2 000 bp 的順式作用元件，利用TBtools 軟件［22］對逆境響應相關順式作用元件進行可視化。

1.2.6 分析鐵皮石斛14?3?3 家族基因在不同組織器官的表達水平 為研究鐵皮石斛DoGRF 基因家族在不同組織器官的表達模式，從NCBI 下載鐵皮石斛莖、葉、花蕾、萼片、唇瓣、花粉、合蕊柱、根、根尖、氣生根的RNA?seq 數(shù)據(jù)［24］，通過HISAT、StringTie和Ballgown 軟件［25］組裝與評估轉(zhuǎn)錄本，并獲得鐵皮石斛在不同組織器官的表達量，最終利用TBtools軟件［22］可視化DoGRF1-DoGRF17 基因的表達水平。

1.2.7 分析鐵皮石斛14?3?3 家族基因在低溫及鹽脅迫處理下的表達水平 采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（0416?50, 北京華越洋生物科技有限公司）參照說明書分別提取受低溫處理的鐵皮石斛葉，及鹽脅迫處理的根和葉總RNA［26］，通過NanoDrop2000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific,美國馬薩諸塞州）檢測所得總RNA 的濃度和質(zhì)量。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit（RR047A, TaKaRa,中國大連）進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所得的cDNA 分析DoGRF1-DoGRF17 基因在低溫及鹽脅迫處理下的表達水平。

選 擇 鐵 皮 石 斛EF?1α 為 內(nèi) 參 基 因［27］，利 用Primer Premier 5.0 設計DoGRF1-DoGRF17 基因的熒光定量PCR 引物（表1）。將低溫及鹽脅迫處理下鐵皮石斛根或葉的cDNA 質(zhì)量濃度定量為50 ng/μL，按照iTaqTMuniversal SYBR?Green（1725121, Bio?Rad Laboratories, 美國加利福尼亞州）操作說明在ABI 7500 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems, 美國加利福尼亞州）上進行定量PCR 反應。反應體系（10 μL）為iTaqTMuniversal SYBR?Green supermix 5 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各0.5 μL，cDNA 模板1 μL,ddH2O 3 μL。反應程序為95℃預變性30 s，及40 個擴增循環(huán)（95℃變性10 s，60℃退火30 s）。每個處理的樣品含3 個生物學重復。利用2-ΔΔCt法［28］計算鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17 在低溫及鹽脅迫處理下的相對表達量，通過Student’s t?test 比較處理組與對照組間的顯著性。

表1 本實驗所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛14?3?3家族基因的鑒定及理化分析

通過生物信息學方法，在鐵皮石斛基因組中共鑒定到17 個14?3?3 家族成員，根據(jù)這些基因所在的亞家族及染色體上的位置命名為DoGRF1-DoGRF17（表2）。ExPASy 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17 個鐵皮石斛DoGRF 成員的氨基酸數(shù)介于144-299 aa，最大的為DoGRF2；分子量為16.29-34.17 kD，平均分子量為28.77 kD；等電點介于4.73-9.03 之間，平均值為5.84；不穩(wěn)定系數(shù)介于39.17-51.58，脂肪系數(shù)介于91.80?103.33；DoGRF1-DoGRF17蛋白均具有較強的親水性，以DoGRF16 蛋白的親水性最強。亞細胞定位預測顯示，DoGRF13 和DoGRF17 定位于葉綠體，其余15個DoGRF 成員均定位在細胞核上。

表2 鐵皮石斛DoGRF 蛋白的理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical properties of DoGRF proteins in D.officinale

2.2 鐵皮石斛14?3?3家族基因的染色體定位分析

根據(jù)鐵皮石斛全基因組注釋結(jié)果，繪制了DoGRF 家族成員的染色體定位圖譜（圖1?A）。結(jié)果顯示，除DoGRF17 未錨定到特定的染色體外，其余16 個DoGRF 成員不均勻地分布在Chr1、Chr5、Chr7、Chr10、Chr12、Chr16 和Chr17 這7 條染色體上，Chr12 染色體上有3 個（DoGRF9、DoGRF10、DoGRF11），Chr16 染色體上也有3 個（DoGRF12、DoGRF13、DoGRF14），Chr1、Chr5、Chr7、Chr10和Chr17 染色體上分別存在2 個不同的成員。

圖1 鐵皮石斛DoGRF 家族成員的染色體定位（A）及復制事件分析（B）Fig.1 Chromosomal localization（A）and replication events（B）of the DoGRF family members in D.officinale

進一步研究了DoGRF 家族基因間的共線性關系（圖1?B），結(jié)果顯示，7 對DoGRF 基因有共線性關系，DoGRF1 和DoGRF5、DoGRF2 和DoGRF6、DoGRF2 和DoGRF8、DoGRF3 和DoGRF16、DoGRF4和DoGRF12、DoGRF6 和DoGRF7、DoGRF13 和DoGRF15 互為串聯(lián)復制基因?qū)Γf明DoGRF 家族成員在進化過程中發(fā)生了染色體片段復制事件。

2.3 鐵皮石斛14?3?3家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過DNAMAN 軟件對17 個鐵皮石斛14?3?3 家族蛋白進行多重序列比對（圖2），結(jié)果顯示，它們具 有 保 守 的14?3?3 結(jié) 構(gòu) 域（LGLALNFSVFYYEI），序列一致性達到55.05%，中間區(qū)域的序列相似度較高，尤其是紅色框內(nèi)的序列，它們均是14?3?3 蛋白的保守核心區(qū)。N 端和C 端的序列變異程度較大，這可能是造成DoGRF 成員存在功能差異的原因。

圖2 鐵皮石斛DoGRF 家族蛋白的多重序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of the DoGRF family proteins in D.officinale

為了分析GRF 蛋白間的系統(tǒng)進化關系，通過MEGA 軟件繪制了鐵皮石斛、水稻、擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿、非洲菊中的73 條GRF 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果顯示，所有14?3?3 蛋白主要分為ε-type group 和non ε-type group 兩大分支，8個 成 員（DoGRF1、DoGRF5、DoGRF6、DoGRF8、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17） 隸屬ε-type group， 其 余 的9 個 成 員（DoGRF2、DoGRF3、DoGRF4、DoGRF7、DoGRF9、DoGRF10、DoGRF11、DoGRF12、DoGRF13） 隸 屬non ε-type group。鐵皮石斛DoGRF 蛋白與單子葉植物水稻GRF 蛋白的親緣關系相對較近，與雙子葉植物擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿、非洲菊中GRF 蛋白的親緣關系相對較遠，推測可能是植物14?3?3 蛋白在單子葉植物與雙子葉植物是平行進化的兩支，形成了相對獨立的類群。

圖3 鐵皮石斛、水稻、擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿、非洲菊GRF 家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of GRF family members in D.officinale, O.sativa, A.thaliana, G.max, M.truncatula and G.hybrida

2.4 鐵皮石斛14?3?3家族成員的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

基于鐵皮石斛全基因組的注釋文件，繪制了DoGRF 家族成員的基因結(jié)構(gòu)（圖4?A），結(jié)果顯 示，6 個 成 員（DoGRF4、DoGRF5、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17）不 含 非 編 碼 區(qū)（untranslated regions, UTR），其余成員均含有3'?UTR和5'?UTR。所有DoGRF 家族成員含2-7 個編碼區(qū)（coding region, CDS），DoGRF10 長度達到71 550 bp，含有5 個CDS 和2 個UTR，而DoGRF14 長度僅為972 bp，含有2 個CDS。

圖4 鐵皮石斛DoGRF 家族成員的基因結(jié)構(gòu)（A）、保守基序（B）及基序標識（C）Fig.4 Gene structure（A）, conserved motifs（B）, and motif logo（C）of DoGRF family members in D.officinale

鐵皮石斛DoGRF 家族成員中鑒定到8 個保守基序（圖4?B-C），結(jié)果顯示，所有成員均存在motif 2（含KMKGDY 序列）和6，非ε 類DoGRF 成員含有7 個保守基序，ε 類DoGRF 成員含有2-7 個保守基序，聚類在同一分支上的DoGRF 成員具有類似的保守基序，motif 8 僅分布在DoGRF15、DoGRF16 和DoGRF17 中。

2.5 鐵皮石斛14?3?3家族成員的二級結(jié)構(gòu)分析

通過SOMPA 軟件分析了DoGRF 家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)（表3），結(jié)果顯示，DoGRF 家族成員均有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和隨機卷曲4 種二級結(jié)構(gòu)類型，所占比例大小依次為α-螺旋（平均51.02%）、隨機卷曲（平均31.05%）、延伸鏈（平均12.63%）和β-折疊（平均5.29%）。DoGRF6 的α-螺旋占比（67.43%）最大，DoGRF13 的延伸鏈占比（16.28%）最大，DoGRF14 的隨機卷曲（38.46%）和β-折疊（10.65%）占比最大。

表3 鐵皮石斛DoGRF 成員的蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Table 3 Analysis of secondary structure of DoGRF proteins in D.officinale

2.6 鐵皮石斛14?3?3家族基因的啟動子順式作用元件分析

利用PlantCARE 網(wǎng)站分析了鐵皮石斛DoGRF 家族基因啟動子上的順式作用元件及其響應激素和非生物脅迫的功能，獲得9 個順式作用元件（水楊酸響應、光照響應、生長素響應、低溫響應、茉莉酸響應、赤霉素響應、干旱誘導、脫落酸響應、防御與脅迫）并將其可視化（圖5）。結(jié)果顯示，DoGRF1和DoGRF17 啟動子上存在上述9 種順式作用元件，而DoGRF14 啟動子上僅含1 種順式作用元件（光照響應）。94.1%的DoGRF 成員的啟動子上含有光照響應元件（DoGRF4 除外），76.5%的DoGRF 成員的啟動子上含有茉莉酸響應元件（DoGRF4、DoGRF6、DoGRF10、DoGRF14 除外）。此外，還有10 個、9個、11 個DoGRF 成員的啟動子上分別含有低溫響應、脫落酸響應和水楊酸響應元件，暗示大多數(shù)DoGRF家族成員能夠響應植物激素的處理，并受環(huán)境脅迫應答的誘導。

圖5 鐵皮石斛DoGRF 家族基因啟動子的順式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-regulatory elements on the promoters of DoGRF family genes in D.officinale

2.7 鐵皮石斛14?3?3家族基因的組織表達特性分析

為了明晰鐵皮石斛DoGRF 成員在不同組織中的表達特征，通過已公布轉(zhuǎn)錄組［22］分析了17 個DoGRF 家族基因在鐵皮石斛花蕾（flower bud）、萼片（sepal）、 唇 瓣（labellum）、 花 粉（pollinium）、合 蕊 柱（gynostemium）、 莖（stem）、 葉（leaf）、根（root）、綠色根尖（green root tip）、白色氣生根（white part root）中的表達量，結(jié)果（圖6）顯示，DoGRF 家族成員在所有組織中均有表達，但具有組織表達特異性且成員間的表達水平存在差異，有5個 基 因（DoGRF6、DoGRF7、DoGRF8、DoGRF9、DoGRF11）在莖中的表達量最高，有2 個基因（DoGRF2、DoGRF5）在根中的表達量最高，其余10 個DoGRF 基 因（DoGRF1、DoGRF3、DoGRF4、DoGRF10、DoGRF12、DoGRF13、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17）均在花粉中的表達量最高，暗示它們在花器官發(fā)育中可能起重要的作用。

圖6 鐵皮石斛DoGRF 家族基因的組織特異性表達分析Fig.6 Tissue specific expression analysis of DoGRF family genes in D.officinale

2.8 鐵皮石斛14?3?3家族基因在非生物脅迫下的表達模式分析

基于大多數(shù)DoGRF 家族成員的啟動子上含有逆境響應元件（圖5），分析了DoGRF 家族基因在非生物脅迫（低溫和鹽脅迫）下的表達水平，結(jié)果（圖7）顯示，共有10 個基因（DoGRF1、DoGRF3、DoGRF5、DoGRF6、DoGRF8、DoGRF9、DoGRF12、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17）在鐵皮石斛葉低溫處理后呈現(xiàn)下調(diào)表達；其余7 個基因（DoGRF2、DoGRF4、DoGRF7、DoGRF10、DoGRF11、DoGRF13、DoGRF14）在鐵皮石斛葉低溫處理后呈現(xiàn)上調(diào)表達。

圖7 鐵皮石斛DoGRF 家族基因在低溫處理下的表達水平Fig.7 Expressions of DoGRF family genes under low-temperature stress in D.officinale

此外，分析了鐵皮石斛葉片和根中DoGRF 家族基因響應鹽脅迫處理的表達水平，結(jié)果（圖8）顯示，鹽脅迫處理下，DoGRF12、DoGRF15、DoGRF17在葉片中的表達量沒有顯著性差異，DoGRF5、DoGRF6、DoGRF9 在根系中的表達量沒有顯著性差異。在葉片中，共有4 類基因表達的模式：7 個基因（DoGRF1、DoGRF2、DoGRF5、DoGRF8、DoGRF9、DoGRF10、DoGRF16）呈現(xiàn)不斷上調(diào)表達；2 個基因（DoGRF6、DoGRF14）呈現(xiàn)不斷下調(diào)表達；3 個基因（DoGRF7、DoGRF11、DoGRF13）呈現(xiàn)先減少后增加的表達趨勢；2 個基因（DoGRF3、DoGRF4）呈現(xiàn)先增加后減少的表達趨勢。在根中，鹽脅迫處 理 后6 個 基 因（DoGRF1、DoGRF7、DoGRF8、DoGRF10、DoGRF11、DoGRF12）的表達量明顯降低，8 個基因（DoGRF2、DoGRF3、DoGRF4、DoGRF13、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17） 的 表達量明顯增加。

3 討論

鐵皮石斛染色體級別基因組的發(fā)布為抗逆基因挖掘及其進化提供了重要的遺傳信息［4］。真核生物中高度保守的14?3?3（GRF）家族蛋白通過磷酸化修飾調(diào)控靶蛋白活性，在植物生長發(fā)育、代謝產(chǎn)物合成和環(huán)境脅迫應答中發(fā)揮關鍵作用［5］。本研究共在鐵皮石斛基因組中鑒定到17 個DoGRF 家族成員，比擬南芥（13 個）［9］、水稻（8 個）［12］、辣椒（15個）［9］、番茄（Solanum lycopersicum; 12 個）［29］、二穗短柄草（Brachypodium distachyon; 12 個）［15］中的數(shù)量多，比大豆（18 個）［11］、蘋果（18 個）［30］中的數(shù)量少，表明鐵皮石斛中的14?3?3 家族有所擴張，這可能與鐵皮石斛普遍適應低溫、干旱、強光照等逆境的需求相關。此外，DoGRF17 未錨定到染色體上，其余16 個DoGRF 成員不均勻定位在7 條染色體上，每條染色體上含有2-3 個成員，并且存在7對串聯(lián)復制基因具有同源進化關系，包括串聯(lián)和節(jié)段復制，表明鐵皮石斛DoGRF 基因家族的擴增可能是由基因復制事件造成的［14］。

鐵皮石斛17 個DoGRF 成員均具有14?3?3 家族的保守功能域（PF00244），氨基酸平均數(shù)為256，分子量平均數(shù)為28.77 kD，pI 平均值為5.84，這與其他物種中GRF 蛋白分子量約30 kD，且為酸性蛋白質(zhì)氨基酸（pI ＜ 7.0）相一致［11-13］，表明GRF 家族蛋白在植物中相對保守。DoGRF 家族蛋白均是親水蛋白，暗示它們在響應環(huán)境脅迫應答中發(fā)揮重要的作用，二級結(jié)構(gòu)以具有剛性的α-螺旋為主（平均占比51.02%），為蛋白質(zhì)的構(gòu)象提供支撐力［7］。

根據(jù)系統(tǒng)進化分析，DoGRF 家族成員分為ε-type和non ε-type 兩大亞族，與單子葉水稻親緣關系相對較近，與雙子葉擬南芥、大豆親緣關系相對較遠，與早期植物GRF 蛋白進化為兩支的觀點相一致［8］。單子葉與雙子葉植物中的GRF 成員在進化上相對獨立且保守，具有不同的路徑和進化趨勢，進而呈現(xiàn)2 個相對獨立的平行進化類群［13］。GRF 家族蛋白序列中間的motif 2 和motif 6 在DoGRF 家族中高度保守，N 端和C 端的變異性較大，C?端α7-α9 螺旋上的疏水殘基通過非磷酸化識別序列與靶蛋白直接互作。N?端12-30 氨基酸殘基對蛋白二聚體形成及配體偶聯(lián)起著關鍵的作用，進而影響與受體膜的識別，是導致GRF 蛋白功能多樣性和復雜性的基礎［5-7］。

鐵皮石斛DoGRF 家族基因的表達具有組織特異性，在鐵皮石斛花蕾、萼片、唇瓣、花粉、合蕊柱、莖、葉、根、綠色根尖、白色氣生根中呈現(xiàn)差異性的表達，10 個基因在花中表達最高，其次是莖（5 個）和根（2個），推測DoGRF 基因在調(diào)控不同組織的生長發(fā)育中發(fā)生了功能的分化。

啟動子區(qū)域存在大量的順式作用元件，對基因的轉(zhuǎn)錄和表達具有顯著影響。多種非生物（高鹽、低溫、干旱）逆境能誘導14?3?3 基因的表達，其啟動子上游的順式元件對其表達量起著至關重要影響［15-16］。鐵皮石斛DoGRF 家族基因啟動子區(qū)域富集了大量脫落酸、茉莉酸等激素響應元件，及低溫、干旱誘導等逆境響應元件。各個成員包含的元件數(shù)量與種類也存在差異，推測鐵皮石斛DoGRF 家族基因的表達可能與激素誘導及抗逆應答有關，與辣椒［9］、茶樹［14］、蘋果［30］等GRF 蛋白響應非生物脅迫相一致。

實驗結(jié)果表明，多類非生物脅迫（如低溫、鹽脅迫）可誘導不同DoGRF 基因的表達，低溫處理促進7 個DoGRF 基因顯著上調(diào)表達，鹽脅迫處理促進葉中7 個DoGRF 基因顯著上調(diào)表達，根中8 個DoGRF 基因顯著上調(diào)表達。GRF 蛋白響應低溫應答的研究主要聚焦在擬南芥中，受體激酶CRPK1 負調(diào)控植物的低溫耐受性，可被低溫激活并磷酸化14?3?3λ 蛋白，促使14?3?3λ 蛋白由細胞質(zhì)進入細胞核，與CBF3 蛋白互作致其泛素化降解，進而不利于植物耐受低溫脅迫［31］。在鹽脅迫誘導下，水稻幼苗及愈傷組織中GRF 蛋白的表達水平明顯增加［12］。過表達OsGF14b 基因促進水稻耐鹽性顯著增加，敲除該基因使其對鹽脅迫相當敏感，并且鹽脅迫有利于OsGF14b 與OsPLC1 互作，抑制OsPLC1 的泛素化降解，促進三磷酸肌醇和二酰甘油的生成，激活胞內(nèi)Ca2+信號從而提高水稻的耐鹽性［32］。有趣的是，鐵皮石斛DoGRF2 基因同時被低溫和鹽脅迫處理誘導表達，這與該基因的啟動子區(qū)域鑒定到的低溫響應、防御與脅迫元件相吻合［7-8］，具體的分子機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究在鐵皮石斛中共鑒定出17 個14?3?3（GRF）家族基因，編碼144-299 個氨基酸，分為ε類和非ε 類，分布在7 條染色體上，含高度保守的motif 2 和motif 6，N 端和C 端變異性較大。該家族基因啟動子上富集大量的激素和逆境應答相關的順式元件。DoGRF 家族基因在各個組織均有表達，具有組織特異性，并在低溫及鹽脅迫下存在差異表達，暗示它們廣泛參與非生物脅迫。