瘤胃源糞臭素降解菌的分離鑒定及其降解特性研究

王璐 劉夢(mèng)雨 張富源 紀(jì)守坤 王云 張英杰 段春輝 劉月琴嚴(yán)慧

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071000）

隨著畜禽集約化生產(chǎn)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)保養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)型升級(jí)的需求，畜禽糞便中臭味物質(zhì)的降解成為了人們廣泛關(guān)注的問題。其中，糞臭素排放量僅次于氨氣和硫化氫，但刺激性氣味更強(qiáng)，嗅閾值更低，不到0.003 mg/m3［1］。糞便堆肥處空氣中的糞臭素含量為0.1-335 μg/m3［2］，均遠(yuǎn)高于其嗅閾值，且糞漿中的糞臭素濃度可能隨時(shí)間的推移而累積［3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，反芻動(dòng)物瘤胃、糞便和豬糞便中的糞臭素濃度分別可達(dá)10 mg/L 與10 mg/kg［4-6］和1-100 mg/kg［7］；另外，糞臭素具有強(qiáng)毒性，可通過瘤胃壁被吸收，極易沉積在肺部，是誘發(fā)反芻動(dòng)物肺水腫和肺氣腫的主要因素［8］，其致突變性也是引發(fā)牛羊肺部癌變的原因之一［9］。由于其親脂性，糞臭素還易被肉羊脂肪組織吸附，是引發(fā)羊肉膻味的因素［10］。此外，糞臭素能抑制細(xì)菌生長，高濃度的糞臭素可損傷細(xì)菌生物膜［11］，這可能是糞臭素降解菌株資源獲取較少的原因之一。因此，在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中，降低糞臭素產(chǎn)生量和排放量對(duì)改善牧場環(huán)境、降低牛羊肺氣腫發(fā)病率、改善羊肉風(fēng)味等方面均有重要意義。

生物降解法防治畜禽臭氣具有低成本、無污染的優(yōu)勢(shì)，迄今為止已有10 余株糞臭素降解細(xì)菌被報(bào)道，來源包括海底沉積物［12］、紅樹林底泥［13］、土壤［14］、糞便［15-16］及污水［17-19］。在前人研究中，張宗源等［19］分離的紅球菌YKSW?6 表現(xiàn)出了最高的糞臭素降解率，14 h 可完全降解100 mg/L 的糞臭素；其次是Fukuoka 等［14］分離的貪銅菌KK10，24 h 可完全降解100 mg/L 的糞臭素，但目前已有菌株均不在飼料添加劑品種目錄中，難以應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)。

反芻動(dòng)物的糞臭素生成與吸收主要在瘤胃中進(jìn)行［5］，推測(cè)反芻動(dòng)物瘤胃中可能存在著糞臭素降解細(xì)菌?；谶@一假設(shè)，本研究從湖羊瘤胃液中富集、分離細(xì)菌并進(jìn)行鑒定，測(cè)定其生長曲線和糞臭素降解效率，以期獲得適用于反芻動(dòng)物的高效的可飼糞臭素降解菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌分離來源 2022 年6 月使用河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物房瘺管羊（湖羊，體重為（49.74±2.51）kg，n=3）采集瘤胃液。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）MSM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）［20］：K2HPO40.8；KH2PO40.2；CaCl20.05；MgCl20.5；FeCl20.01；（NH4）2SO41.0；NaCl 5.0。（2） 富 集培養(yǎng)基：在MSM 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上額外添加終濃度為131.18 mg/L、196.77 mg/L 或262.36 mg/L 的糞臭素。（3）活化培養(yǎng)基：MSM 培養(yǎng)基中補(bǔ)充1 g/L 酵母粉和終濃度100 mg/L 的糞臭素。（4）降解培養(yǎng)基：在MSM 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上額外添加終濃度為100 mg/L 的糞臭素。

1.2 方法

1.2.1 糞臭素降解菌的富集及分離 通過瘺管采集綿羊瘤胃內(nèi)容物，四層紗布過濾，80℃水浴處理20 min。接種10 mL 水浴后的瘤胃液到100 mL 含有131.18 mg/L 糞臭素的富集培養(yǎng)基中，于140 r/m、30℃振蕩培養(yǎng)2 d；吸取1 mL 富集液加到糞臭素終濃度196.77 mg/L 的富集培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)3 d；吸取1 mL 富集液加到糞臭素終濃度262.36 mg/L的富集培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)4 d。富集培養(yǎng)基的糞臭素濃度每提升65.58 mg/L，細(xì)菌的培養(yǎng)時(shí)間相應(yīng)增加1 d。

富集結(jié)束后，進(jìn)行平板稀釋涂布，稀釋梯度為10-1-10-5，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，挑取單菌落，分區(qū)劃線純化細(xì)菌3-4 次，直至得到單一形態(tài)菌落。

1.2.2 糞臭素降解菌的鑒定 使用通用引物27F（5'?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3'） 和1492R（5'?GGTTACCTTGTTACGACTT?3'） 擴(kuò) 增16S rRNA基因。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：菌液2 μL，上下游引物各1 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃ 10 min；（94℃ 1 min，47℃ 1 min，72℃1.5 min）30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，在NCBI 上比對(duì)測(cè)序結(jié)果，使用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 糞臭素降解菌的生長曲線及降解速率測(cè)定 （1）菌株活化：接種細(xì)菌到40 mL 活化培養(yǎng)基中，于140 r/m、30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)。（2）生長曲線和降解速率測(cè)定：細(xì)菌活化12 h 后，以5%（OD600=0.30）的接種量將菌液接種到降解培養(yǎng)基中，于140 r/m、30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)。在第0、4、8、12、16、24、32、40 和48 小時(shí)采集菌液樣品，測(cè)定菌液的OD600值（生長曲線）和糞臭素濃度（降解曲線）。（3）糞臭素測(cè)定：菌液加入等體積甲醇，5 000 r/min 離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后使用液相色譜法檢測(cè)糞臭素濃度。色譜柱及色譜條件參考已有研究［18］：柱溫為室溫，檢測(cè)波長254 nm，流動(dòng)相為甲醇∶水（9∶1），流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，每個(gè)樣品測(cè)量3 次。（4）糞臭素標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用乙醇溶解糞臭素，配制成高濃度的儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液稀釋為0、1、5、10、15、20、25 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所有液體均使用0.22 μm過濾膜過濾除菌，使用液相色譜法測(cè)定糞臭素含量。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，建立糞臭素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 使用Excel 計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用Graphpad Prism 8 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 瘤胃源糞臭素降解菌的分離

共分離出25 株瘤胃源糞臭素降解菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征將其分為11 個(gè)型，每個(gè)型選取一株菌作為代表菌株，分別命名為MSML1-11，菌株形態(tài)見圖1。

圖1 代表性瘤胃源糞臭素降解菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of representative rumen skatole-degrading bacteria

2.2 16S rRNA基因擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

電泳結(jié)果顯示16S rRNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物均在1 500 bp 左 右。如 圖2 所 示，MSML2、MSML6 與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）IAM 12118T的序列相似性最高，分別為99.8%和99.9%，MSML4、MSML5、MSML7 和MSML10 與阿氏普里斯特氏菌（Priestia aryabhattai）B8W22T的 序 列 相 似 性 均 為99.9%，MSML3 和MSML11 與污染伯克霍爾德氏菌（Burkholderia contaminans）J2956T的序列相似性分別 為99.9% 和99.8%，MSML1、MSML8 和MSML9與成都假單胞菌（Pseudomonas chengduensis）AL 15?21T的序列相似性均為99.9%。

圖2 瘤胃源糞臭素降解菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of rumen skatole-degrading bacteria

2.3 瘤胃源糞臭素降解菌的生長曲線

如圖3?A 所示，根據(jù)生長曲線可將菌株分為三大類：第一大類菌株包括MSML2、MSML4、MSML5、MSML6、MSML7 和MSML10，生長速度最快，OD 值能達(dá)到0.2 左右，0-4 h 為遲緩期，4 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，8-16 h 進(jìn)入平臺(tái)期，其中MSML5 生長速度最快，在8 h 進(jìn)入平臺(tái)期，且菌株終OD 值最高；第二大類菌包括MSML1 和MSML9，生長速度適中，OD 終值也能達(dá)到0.2，0-16 h 為遲緩期，16-40 h 為對(duì)數(shù)期；第三大類菌包括MSML3 和MSML8，前期生長速度緩慢，OD 值僅能達(dá)到0.1，0-8 h 為遲緩期，8-32 h 為對(duì)數(shù)期。

圖3 糞臭素降解菌生長和降解曲線Fig.3 Growth and skatole degradation curves of skatole-degrading isolates

2.4 瘤胃源糞臭素降解菌的糞臭素降解率

糞臭素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間是3.47 min，糞臭素濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 17 359x + 57 152（R2=0.997 5）。

瘤胃源糞臭素降解菌菌株的糞臭素降解曲線見圖3?B，其48 h 糞臭素降解率見圖4。結(jié)果顯示，MSML2 的糞臭素降解率最高，其48 h 糞臭素降解率達(dá)到23.03%；其次為MSML7、MSML8 和MSML10，糞臭素降解率均為20%以上。菌株MSML3 在48 h內(nèi)的糞臭素降解率最低，為13.14%。

圖4 不同菌株48 h 糞臭素降解率Fig.4 Skatole degradation rate by different isolates at 48 h

3 討論

生物降解法除臭具有無污染和成本低的優(yōu)點(diǎn)，已報(bào)道的糞臭素降解菌只有十余株，包括假單胞菌屬、紅假單胞菌屬、貪銅菌屬、不動(dòng)桿菌屬、紅球菌屬和伯克霍爾德菌屬［2,15,18-19］，大部分菌株來源于污水或糞便，且不在飼料添加劑目錄中，能夠用于動(dòng)物養(yǎng)殖除臭的菌株資源十分稀缺。本研究從綿羊瘤胃液中分離獲得11 株糞臭素降解菌，包括2 株枯草芽孢桿菌、4 株阿氏普里斯特氏菌、2 株污染伯克霍爾德氏菌和3 株成都假單胞菌，其中具有糞臭素降解能力的枯草芽孢桿菌、阿氏普里斯特氏菌和成都假單胞菌為本研究首次報(bào)道；枯草芽孢桿菌可作為畜禽飼料添加劑［21-22］，為糞臭素生成的源頭減排提供了菌株資源和新解決思路。

糞臭素對(duì)大多數(shù)微生物具有毒害作用。前人研究表明，30 mg/L 糞臭素即可抑制沙門氏菌和大腸桿菌的生長［23］。對(duì)于糞臭素利用菌也有相似研究結(jié)果，吳玉洪等［18］研究發(fā)現(xiàn)糞臭素降解菌紅球菌RP3 在糞臭素含量為50 mg/L 的條件下菌株的平臺(tái)期OD 值可達(dá)1.0，糞臭素含量提高到250 mg/L 以上時(shí)，菌株的平臺(tái)期OD 值僅約0.3 左右；張宗源等［19］研究發(fā)現(xiàn)糞臭素利用菌紅球菌YKSW?6 在低濃度糞臭素（50 mg/L）條件下平臺(tái)期的菌體濃度顯著高于高濃度糞臭素（150 mg/L）條件下的菌體濃度。這一現(xiàn)象可能是由于糞臭素可通過促進(jìn)內(nèi)源型氧化應(yīng)激影響細(xì)菌生物膜的形成，進(jìn)而影響微生物存活和生長［24］，也提示菌株對(duì)糞臭素耐受性是其糞臭素高效利用的基礎(chǔ)。本研究中使用逐步提升糞臭素濃度的富集培養(yǎng)方案，最終培養(yǎng)基中糞臭素含量提升到262.36 mg/L，且大部分微生物可以在10 h 內(nèi)達(dá)到生長平臺(tái)期，所篩選糞臭素利用微生物天然具有良好的糞臭素耐受能力。

目前已報(bào)道的不同糞臭素降解菌降解效率差異較大，且與糞臭素濃度密切相關(guān)。Ma 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，糞臭素初始濃度為150 mg/L 時(shí)，伯克氏菌IDO3在40 h 的糞臭素降解率為100%，當(dāng)糞臭素濃度提升到180 mg/L 時(shí)，其對(duì)糞臭素的降解率幾乎為0%；沼 澤 紅 假 單 胞 菌 WKU?KDNS3 在21 d 內(nèi) 對(duì)13.18 mg/L 的糞臭素降解率為93%［26］；淡色芽孢桿菌X3對(duì)10 mg/L 糞臭素的24 h 降解率為44%［27］。前人也對(duì)潛在可飼用益生菌的糞臭素降解能力進(jìn)行了測(cè)定，但其糞臭素降解能力均較低，如乳酸菌在48 h 時(shí)的糞臭素降解率為5%-15%［15］，短乳桿菌在24 h 內(nèi)對(duì)1 mg/L 的糞臭素降解率為17%［28］。本研究分離到的菌株48 h 內(nèi)對(duì)100 mg/L 的糞臭素降解率為13%-23%，其中可飼用枯草芽孢桿菌（MSML2）在48 h內(nèi)的糞臭素降解率達(dá)到23.03%。同時(shí)本研究所使用糞臭素初始濃度高于肉羊瘤胃中的常見糞臭素濃度［4-5,29］，且在可飼用微生物中糞臭素降解能力最高，在畜牧生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用潛力。

目前對(duì)于不同菌株對(duì)糞臭素的降解途徑尚不完全清楚［4］。Gu 等［12］發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原條件下糞臭素的C2 被氧化，吡咯環(huán)斷開生成鄰氨基苯乙酸；Yin等［13］研究表明在有氧條件下，糞臭素的C3 被氧化，從而提出鄰氨基苯甲酸降解途徑。銅綠假單胞菌 Gs和惡臭假單胞菌 LPC24 降解糞臭素的代謝產(chǎn)物分別為吲哚?3?羧酸、3?羥基-吲哚啉和3?甲氧基吲哚、甲酰氨基苯乙酮和2?氨基苯乙酮［13,30］，Li 等［30］通過分析糞臭素的降解產(chǎn)物，推測(cè)糞臭素的降解途徑為：糞臭素-3?甲基氧化吲哚-甲酰氨基苯乙酮-2?氨基乙酰苯途徑。Fukuoka 等［14］共鑒定出14 種降解產(chǎn)物，提出另一個(gè)糞臭素降解途徑——吲哚?3?羧酸和苯環(huán)加氧途徑。多項(xiàng)研究也證實(shí)在糞臭素降解時(shí)鄰苯二酚雙加氧酶的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)［31-33］，因而推測(cè)鄰苯二酚途徑可能廣泛存在于糞臭素菌中并發(fā)揮作用。這些研究結(jié)果提示，不同菌株可能通過不同途徑或多種途徑共同實(shí)現(xiàn)糞臭素降解。在后續(xù)工作中，對(duì)比不同菌株糞臭素降解能力，進(jìn)一步解析提高糞臭素降解效率的基因調(diào)控機(jī)制，通過遺傳或進(jìn)化手段對(duì)可飼用的枯草芽孢桿菌的糞臭素降解能力進(jìn)行改造，獲取糞臭素降解能力優(yōu)化的可飼菌株，對(duì)通過飼喂微生物的方式降低養(yǎng)殖臭氣排放具有重要意義。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功從綿羊瘤胃液中分離獲得了11 株糞臭素降解代表菌株，其中2 株為枯草芽孢桿菌，4 株為阿氏普里斯特氏菌，2 株為污染伯克霍爾德氏菌，3 株為成都假單胞菌?？娠曈每莶菅挎邨U菌MSML2 的糞臭素降解率最高，48 h 內(nèi)對(duì)100 mg/L 糞臭素降解率可達(dá)23.03%。