羅芷涵,劉朋飛,于 軍, 齊 鶴, 陳小光,樓兵干,*

(1.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310058; 2.塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843399; 3.巴音郭楞蒙古自治州林業(yè)和草原局,新疆 庫爾勒 841000; 4.庫爾勒市園林局,新疆 庫爾勒 841000)

國槐[Styphnolobiumjaponicum(L.) Schott]是蝶形花科(Fabaceae)的一種落葉喬木,是常用的園林綠化樹種,也是經(jīng)濟(jì)林兼用樹種。該樹原產(chǎn)于我國北方,現(xiàn)今在我國大部分地區(qū)均有分布,是北京、石家莊、大同、西安、蘭州等城市的市樹[1],也是新疆,尤其是南疆,如庫爾勒、焉耆、博湖、阿克蘇、阿拉爾等地的主要綠化樹種。

近年來,在新疆的庫爾勒市、阿克蘇市、阿拉爾市等多地的綠化、行道國槐上發(fā)生一種新病害——國槐枝枯病,其株發(fā)病率高達(dá)50%～70%。由于病樹多、病情嚴(yán)重,大量國槐樹出現(xiàn)枝條枯死,甚至全株枯死的現(xiàn)象,當(dāng)?shù)叵喈?dāng)數(shù)量的國槐已無法發(fā)揮行道遮蔽、水土保持、防沙固沙等多方面的作用,該病害已嚴(yán)重影響到南疆的城市綠化。因此,明確造成國槐枝枯病的病因、找到防控措施迫在眉睫。查詢國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),未見任何類似病害的描述與報(bào)道。為了明確引起南疆國槐枝枯病的病原菌,更好地指導(dǎo)病害的防控工作,本文著重就新疆地區(qū)國槐枝枯病的癥狀、病原鑒定及病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2019—2022年連續(xù)在庫爾勒、阿克蘇、阿拉爾等地采集具有發(fā)黃枯死等癥狀的國槐枝條,裝入干凈樣本袋中,帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L。改良營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基):蛋白胨10 g,蔗糖30 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L。甘薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SPDA培養(yǎng)基):甘薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水 1 L。玉米粒瓊脂培養(yǎng)基(CMA培養(yǎng)基):玉米粒60 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L。固體查氏培養(yǎng)基(Czapek培養(yǎng)基):MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41 g,KCl 0.5 g,NaNO32 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,蔗糖25 g,瓊脂 20 g,蒸餾水 1 L。燕麥片瓊脂培養(yǎng)基(OA培養(yǎng)基):燕麥片 30 g,瓊脂 15 g,蒸餾水1 L。水瓊脂培養(yǎng)基(WA培養(yǎng)基):瓊脂粉15 g,蒸餾水1 L?；九囵B(yǎng)基(CM培養(yǎng)基):NaNO36 g,KCl 0.52 g,MgSO4·7H2O 0.52 g,KH2PO41.52 g,葡萄糖 10 g,蛋白胨2 g,酵母提取物1 g,酪蛋白氨基酸1 g,1 000×微量元素 1 mL,1 000×維生素1 mL,蒸餾水 1 L,具體配制方法參考《植病研究方法》[2]。

1.3 國槐枝枯病的病害調(diào)查

從2019年到2022年,在每年的春季、夏季、秋季對庫爾勒市、博湖縣、焉耆縣和阿克蘇市、阿拉爾市的國槐枝枯病的危害癥狀、株發(fā)病率進(jìn)行觀察與調(diào)查,拍照記錄病害癥狀,并計(jì)算株發(fā)病率。

1.4 病原菌的分離與純化

采用組織分離法,用滅菌解剖刀剪取具有典型癥狀的國槐枝條病健交界處,使用75%乙醇消毒30 s、1%次氯酸鈉消毒5 min后用無菌水沖洗晾干,用無菌刀片切成5 mm×5 mm的小塊,在每個(gè)PDA平板上均勻放置3塊,置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待長出菌落后,挑取菌落邊緣進(jìn)行多次純化,直到菌落形態(tài)完全一致。純化的菌落轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基斜面上,4 ℃保存。采用真菌單孢分離法,采集肉眼可見黑色分生孢子的病枝條,按上述方法沖洗晾干后,用無菌水將枝條上的分生孢子沖洗到滅菌三角瓶中,不斷稀釋孢子懸浮液直至濃度為每10 μL一個(gè)孢子。將懸浮液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),待生長出單一菌落后,挑取菌落進(jìn)行多次純化,并保存。

1.5 病原菌致病性測定

通過上述方法分離得到GH01、GH02、GH03、GH04、GH05、GH06、GH07、GH08、 GH09、 GH10、 GH11、 GH12、 GH13、 GH14、 GH15和 GH16等16株菌,選擇代表性菌株GH01進(jìn)行致病性測定。將菌株GH01在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d,用打孔器(直徑5 mm)在菌落邊緣打出菌餅,用滅菌手術(shù)刀在國槐當(dāng)年生嫩枝上劃一小傷口,將菌絲面朝內(nèi)貼到傷口處,用保鮮膜固定,接無菌PDA培養(yǎng)基做空白對照,定時(shí)觀察記錄拍照,等出現(xiàn)癥狀時(shí),再進(jìn)行病原菌分離純化。將菌株GH01在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d,用無菌水將分生孢子稀釋成1×109mL-1,用滅菌接種針在國槐當(dāng)年生嫩枝上進(jìn)行噴霧接種,同時(shí)噴霧無菌水作空白對照。定時(shí)觀察記錄拍照,等出現(xiàn)癥狀時(shí),再進(jìn)行病原菌分離純化。

1.6 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將分離純化的16株菌分別接于PDA平板上,置于28 ℃、12 h光暗交替培養(yǎng)。在培養(yǎng)2 d和7 d時(shí),觀察記錄菌絲形態(tài)、顏色,通過光學(xué)顯微鏡觀察并記錄菌絲及分生孢子的形態(tài)和大小,參考Alizadeh等[3]與Pavlic等[4]的研究對分生孢子的各種形態(tài)進(jìn)行觀察與描述。

1.7 rDNA ITS序列與2個(gè)看家基因的多重序列系統(tǒng)發(fā)育分析

采用基因組DNA快速抽提法[5]提取16株菌的基因組DNA,并于-20 ℃保存?zhèn)溆?。對rDNA ITS序列和 2個(gè)看家基因(EF1-α、LSU)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物見表1。PCR擴(kuò)增體系為: 10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μL,10 mmol·L-1dNTP 1 μL,10 μmol·L-1正反引物各1 μL,病原基因組DNA 2 μL,5 U·mL-1Taq酶0.5 μL,加ddH2O至總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 預(yù)變性2 min:94 ℃變性30 s,按不同擴(kuò)增序列設(shè)置不同退火程序(rDNAITS,55 ℃退火50 s;EF1-α,56 ℃退火50 s;LSU,55 ℃退火1 min),72 ℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,將產(chǎn)物送杭州擎科生物股份有限公司測序。序列經(jīng)BLAST比對分析后,提交至GenBank獲得登錄號。應(yīng)用MEGA 11.0軟件,采取鄰接法利用16個(gè)供試菌株與10個(gè)參考菌株(表2)[3,6-13]各序列的串聯(lián)基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap重復(fù)檢驗(yàn)1 000次。

表1 擴(kuò)增引物序列Table 1 Primers for amplification of gene fragments

表2 系統(tǒng)進(jìn)化分析中使用的菌株及其GenBank登錄號Table 2 Botryosphaeriaceae isolates used in the phylogenetic analyses with its GenBank accession number

1.8 病原菌的生物學(xué)特性研究

選取代表性菌株GH01進(jìn)行生物學(xué)特性的測定。將菌株GH01在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃、12 h光暗交替條件培養(yǎng)2 d后,以無菌打孔器打取菌落周圍直徑5 mm的菌餅用于以下實(shí)驗(yàn)。

(1)培養(yǎng)基種類對病原菌生長、產(chǎn)孢的影響:將菌餅分別置于不同的培養(yǎng)基上,于28 ℃、12 h光暗交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,之后采用十字交叉法量取其直徑并計(jì)算生長速率,觀察并記錄菌落生長的狀況與形態(tài),7 d后無菌水洗下平板表面產(chǎn)生的孢子并利用擦鏡紙過濾,使用血球計(jì)數(shù)板鏡檢統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢數(shù)量。每個(gè)處理重復(fù)3次。(2)溫度對病原菌菌落生長、產(chǎn)孢的影響:將新鮮菌餅置于PDA平板中間,分別置于5 、10、15、20、25、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同上方法測量菌落大小及產(chǎn)孢數(shù)量。每個(gè)處理重復(fù)3次。(3)濕度對病原菌分生孢子萌發(fā)的影響。采用小容器空氣濕度法[2],設(shè)置10%、35%、50%、75%和90%共5種相對濕度。用滅菌涂布棒蘸取 106mL-1的分生孢子液,均勻涂抹在含有水瓊脂培養(yǎng)基的滅菌載玻片上,快速風(fēng)干后,放置于不同濕度的干燥器中,25 ℃恒溫培養(yǎng)6 h后鏡檢觀察孢子萌發(fā)狀況,并統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。每個(gè)處理重復(fù)3次。(4)pH對病原菌生長、產(chǎn)孢的影響:用0.5 mmol·L-1的氫氧化鈉溶液與稀鹽酸對PDA培養(yǎng)基的pH值進(jìn)行調(diào)整,分別配置pH值為3.5、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基。將直徑為5 mm的菌餅置于具有不同pH值的培養(yǎng)基上,28 ℃ 光暗交替條件下培養(yǎng),定期觀察菌落形態(tài);7 d后在血球計(jì)數(shù)板上鏡檢產(chǎn)孢數(shù)量。同時(shí),配制上述pH值的PDB培養(yǎng)基,將直徑5 mm菌餅置于其中,25 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)。3 d后過濾菌液, 菌絲用蒸餾水沖洗數(shù)次, 60 ℃ 烘干稱重。每個(gè)處理重復(fù)3次。(5)病原菌生長及產(chǎn)孢對碳、氮源的利用:以固體查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ),以等質(zhì)量的阿拉伯糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、甘露糖、木糖、山梨糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、半乳糖等碳源代替配方中的蔗糖,制備不同碳源的培養(yǎng)基;以含氮量相同的牛肉膏、硫酸銨、精氨酸、硝酸鉀、蛋白胨、草酸銨、苯丙氨酸、硝酸銨、氯化銨、甘氨酸、尿素等氮源,代替配方中的硝酸鈉配制不同氮源培養(yǎng)基。以不加任何碳或氮源的培養(yǎng)基為對照,將菌株GH01菌餅接入各培養(yǎng)基中,同上方法測量菌落大小及產(chǎn)孢數(shù)量。同時(shí),配制上述配方的液體培養(yǎng)基,分別將菌餅置于其中,25 ℃, 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d;培養(yǎng)結(jié)束后過濾菌液, 菌絲用蒸餾水沖洗數(shù)次, 60 ℃烘干稱重。每個(gè)處理各重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 國槐枝枯病的癥狀與危害

國槐枝枯病自2018年于庫爾勒地區(qū)發(fā)現(xiàn)。本研究團(tuán)隊(duì)從2019年到2022年,在每年的春季、夏季和秋季,對南疆各地的國槐進(jìn)行病害調(diào)查。發(fā)現(xiàn)除庫爾勒地區(qū)外,博湖縣、焉耆縣和阿克蘇市、阿拉爾市等地的國槐也同樣出現(xiàn)了枝枯、葉落甚至整樹枯死的行道國槐。我們對此進(jìn)行了調(diào)查,并對枝枯病癥狀進(jìn)行了詳細(xì)的觀察,發(fā)現(xiàn)國槐枝枯病發(fā)生普遍,株發(fā)病率為50%～70%,危害嚴(yán)重。

該病害最易且最初侵染的是國槐的春梢嫩枝。初期,發(fā)病部位會呈現(xiàn)水漬狀(圖1-A),此后病斑逐漸擴(kuò)展(圖1-B),發(fā)病后枝條表皮會由綠色變?yōu)楹诤稚粱野咨?并形成清晰的病組織與健康組織分界,褪綠部分表面出現(xiàn)明顯的黑色點(diǎn)狀物質(zhì)(即病原菌的分生孢子器)(圖1-C);此外,病原菌也侵染二年生、多年生的枝條,大枝上表現(xiàn)出病斑,表皮皺縮凹陷,呈現(xiàn)灰白色,病健交界表現(xiàn)為暗紅至黑色。隨著病情的發(fā)展,被侵染枝條將逐漸干枯,枝條上的葉變黃直至落葉(圖1-D);在病程后期,大枝表面出現(xiàn)肉眼可見黑色小突起,同時(shí)表皮下能夠發(fā)現(xiàn)大量黑色分生孢子(圖1-E、F)。國槐枝枯病在國槐整個(gè)生長季都能發(fā)生,輕則造成病株花序、果實(shí)和小枝條枯死,重則導(dǎo)致病株大枝枯死繼而整樹枯死(圖1-G、H)。病原菌在早春侵染,會導(dǎo)致不開花、不結(jié)莢,嫩梢枯死;夏季侵染則豆莢空癟,無法形成具有生活力的種子。國槐枝枯病的發(fā)生對治沙防沙及園林綠化造成嚴(yán)重影響。

A～C,春梢嫩枝發(fā)病癥狀;D,發(fā)病枝條枝枯、葉落;E,多年生枝條樹皮表面的黑色突起;F,樹皮下形成的大量分生孢子;G,多樹枝條發(fā)病干枯;H,全株即將枯死。A-C,Symptoms on current-year twigs ; D, Branches dieback, leaves falling off; E, Visible black protrusions on epidermis surface ; F, Black conidia formed under the epidermis; G, Most of the shoots are diseased and dry; H, Trees about to die completely.圖1 國槐枝枯病的癥狀Fig.1 Infection symptoms of branch dieback on S. japonicum

2.2 病原菌的分離及致病性測定

對采集的國槐發(fā)病枝條通過組織和單胞分離,共得到16株形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)特征一致的菌株,通過組織分離獲得GH01、GH02和GH03等3株菌,通過單孢分離獲得GH04、GH05、GH06、GH07、GH08、 GH09、 GH10、 GH11、 GH12、 GH13、 GH14、 GH15和GH16等13株菌。選擇代表性菌株GH01進(jìn)行菌絲塊接種,接種后4 d即可見接種的嫩枝傷口周圍出現(xiàn)水浸狀(圖2),傷口變黑且病斑沿枝條向兩端延伸;接種一個(gè)月后,出現(xiàn)與自然發(fā)病一樣的癥狀。從接種的發(fā)病枝條處分離到與接種菌株相同形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征的真菌,明確該菌株為造成國槐枝枯病的病原菌。采用菌株GH01的孢子液接種7 d后,接種部位枝條出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn),而后病斑逐漸擴(kuò)大,呈橢圓形,病斑邊緣黑色,中央枯黃。

A,噴分生孢子液;B,噴無菌水對照;C,菌絲塊傷口接種;D,空白PDA培養(yǎng)基對照。A, Sprayed conidial; B, Sprayed sterile water; C, Mycelial inoculation; D, PDA medium control.圖2 分生孢子與菌絲塊在國槐嫩枝上的接種結(jié)果Fig.2 Results of pathogenicity test of conidia and mycelial plugs on S. japonicum branch

2.3 國槐枝枯病原菌鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)學(xué)特征

將分離得到的16株菌分別置于PDA平板上培養(yǎng),各菌株形態(tài)學(xué)特征一致。菌株生長速度快,2 d即可長滿90 mm的平板。菌落初期呈白色,氣生菌絲發(fā)達(dá),呈細(xì)絨毛狀且部分直立(圖3-A);培養(yǎng)3 d后,菌落逐漸變黑,7 d后菌落呈現(xiàn)出正面墨綠色、背面黑色的形態(tài)(圖3-B)。在光學(xué)顯微鏡下觀察,病原菌會產(chǎn)生鏈狀節(jié)孢子(arthroconidia),隨后節(jié)孢子變圓,呈現(xiàn)暗褐色,無隔膜或僅有一個(gè)隔膜。不成熟的節(jié)孢子會斷裂形成短鏈(圖3-D)。在平板培養(yǎng)過程中,未見其分生孢子器。在發(fā)病后期的枝條上分離得到了大量分生孢子,它們形態(tài)多樣,包括無隔孢子[(2.0～5.0) μm×(1.5～4.5) μm]、單隔孢子[(6.5～9.3) μm×(5.0～5.5) μm]、多隔孢子[(9.0～10.6 )μm×(3.5～5.5 )μm]及格磚狀孢子[(12.0～16.0 )μm×(11.4～16.0) μm]。從分布數(shù)量上看,多數(shù)孢子為無隔孢子,其次為單隔孢子,多隔孢子及格磚狀孢子數(shù)量較少。以上形態(tài)學(xué)特征,與Alizadeh[2]和Pavlic等[3]對Neoscytalidiumnovaehollandiae(現(xiàn)名N.dimidiatum)的形態(tài)特征相符合。

A,PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d;B,PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d;C,菌絲;D,節(jié)孢子;E～F,無隔孢子與單隔孢子;G,雙隔孢子;H,格磚狀孢子。A, Cultured with PDA medium for 2 d; B, Cultured with PDA medium for 7 d; C, Mycelium; D, Arthrospore; E-F, Septospore and single septospore ;G, Double septospore; H, Lattice spore.圖3 病原菌的形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Morphology characters of isolates pathogen

2.3.2 病原菌rDNAITS及2對看家基因的序列特征

對供試16株菌株的rDNAITS與EF1-α及LSU這2對看家基因的序列進(jìn)行擴(kuò)增、測序與BLAST比對,發(fā)現(xiàn)這16個(gè)菌株在rDNAITS序列及LSU基因位點(diǎn)上與多個(gè)N.dimidiatum(原名N.novaehollandiae)菌株有100%的相似性,EF1-α與多個(gè)上述真菌的相似性達(dá)到99%。這說明從南疆發(fā)病國槐枝條上分離得到的菌株為新暗色柱節(jié)孢N.dimidiatum。將這些序列遞交至GenBank數(shù)據(jù)庫獲得GenBank登錄號(各菌株ITS序列及2對看家基因序列對應(yīng)的GenBank號見表3)。利用MEGA 11.0版軟件對供試菌株以及已登錄GenBank的葡萄座腔菌目代表性菌株基于ITS-EF1α-LSU的序列構(gòu)建聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。進(jìn)化樹采用鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建。根據(jù)串級序列系統(tǒng)發(fā)育樹,可以看到16株供試菌株與3個(gè)N.novaehollandiae(現(xiàn)名N.dimidiatum)菌株以較高的自舉置信度位于同一分支上(圖4)。結(jié)合Blast比對結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,可以認(rèn)為從發(fā)病國槐枝條上分離得到的致病菌株與新暗色柱節(jié)孢N.dimidiatum的遺傳距離最小。結(jié)合致病性測定及形態(tài)學(xué)特征,確定引起國槐枝枯病的病原菌為新暗色柱節(jié)孢(N.dimidiatum)。

圖4 基于ITS-EF1α-LSU基因序列構(gòu)建的國槐枝枯病原菌16個(gè)菌株與其他葡萄座腔菌目菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of S. japonica pathogens and other Botryosphaeriales strains based on combined ITS-EF1α-LSU sequences

表3 培養(yǎng)基對國槐枝枯病原菌GH01菌絲生長及產(chǎn)孢的影響Table 3 Effects of different culture media on mycelial growth and sporulation of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

2.4 國槐枝枯病病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

培養(yǎng)基種類對菌株GH01菌絲生長與分生孢子形成的影響具有一定差異。對菌絲生長有促進(jìn)作用的培養(yǎng)基不一定能夠促進(jìn)病原菌的分生孢子形成,同時(shí),利于產(chǎn)孢的培養(yǎng)基也不一定能夠促進(jìn)菌絲生長。綜合判斷,PDA培養(yǎng)基最適宜國槐枝枯病原菌的菌絲生長及分生孢子的形成,而WA培養(yǎng)基則最不利于病原菌的生長與產(chǎn)孢(表3)。在不同培養(yǎng)基上生長的病原菌落形態(tài)也有差異,在NA培養(yǎng)基上生長的菌絲較為致密,而其他供試培養(yǎng)基上生長的菌絲則相對稀疏。

2.4.2 溫度對病原菌生長及產(chǎn)孢的影響

不同溫度對菌株GH01菌絲生長及分生孢子形成的影響存在一定差異。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,國槐枝枯病原菌在溫度≤5 ℃時(shí),既不能進(jìn)行正常的菌絲生長又無法產(chǎn)生分生孢子;當(dāng)溫度處于10～40 ℃時(shí),病原菌可完成菌絲生長及分生孢子形成;當(dāng)溫度為34 ℃時(shí),菌絲生長速率及產(chǎn)孢數(shù)量達(dá)到最大值并顯著高于其他溫度(圖5)。

同色塊數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。Same color blocks marked without the same lowercase letters indicate signficant (P<0.05) difference.圖5 溫度對國槐枝枯病原菌GH01菌絲生長及產(chǎn)孢的影響Fig.5 Effects of different temperature on mycelial growth and sporulation of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

2.4.3 相對濕度對病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

菌株GH01在相對濕度10%～90%的條件下均能夠萌發(fā)(圖6),但在不同相對濕度下分生孢子的萌發(fā)率存在一定差異。在相對濕度10%的條件下,病原菌的6 h孢子萌發(fā)率最高;在相對濕度75%與90%的處理下其萌發(fā)率無顯著性差異。

數(shù)據(jù)點(diǎn)上無相同小寫字母的表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。Dots marked without the same lowercase letters indicate signficant (P<0.05) difference.圖6 相對濕度對國槐枝枯病原菌GH01分生孢子萌發(fā)的影響Fig.6 Effects of different relative humidity on spores’ germination of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

2.4.4 pH對病原菌生長及產(chǎn)孢的影響

菌株GH01在pH值3.5～11的范圍內(nèi)菌絲均能夠生長,當(dāng)pH為5時(shí),菌絲的干重最大,菌球分布均勻,密度最佳。在供試的pH值范圍內(nèi),病原菌也都能夠形成分生孢子,當(dāng)pH值為7-9時(shí),其產(chǎn)孢量最大。綜合來看,偏酸性環(huán)境利于國槐枝枯病原菌的菌絲生長;而中性偏堿的環(huán)境利于該病原菌分生孢子的形成(圖7)。

同一折線數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母的表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。Data in the same line without the same lowercase letters indicate signficant (P<0.05) difference.圖7 pH對國槐枝枯病原菌GH01菌絲生長及產(chǎn)孢的影響Fig.7 Effects of different pH value on mycelial growth and sporulation of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

2.4.5 不同碳、氮源對病原菌生長及產(chǎn)孢的影響

不同碳氮源對菌株GH01的生長及病原菌分生孢子的形成影響具有一定的差異。供試碳源中,木糖、甘油、山梨糖的菌絲生長速率不顯著高于無碳源的對照培養(yǎng)基,即這4種碳源無法被國槐枝枯病原菌絲生長所利用。在各不同碳源培養(yǎng)基上生長的菌絲干質(zhì)量與其生長速率大致呈正相關(guān)(表4)。從病原菌的產(chǎn)孢數(shù)量來看,所有供試碳源均無法被病原菌產(chǎn)孢所利用。

在供試氮源中,除牛肉膏外菌株在其余氮源培養(yǎng)基上的生長速率均小于對照組,但由于菌絲疏密程度不同,其在蛋白胨、精氨酸等多種氮源培養(yǎng)基中生長的菌絲其干質(zhì)量高于對照組;此外蛋白胨、苯丙氨酸、草酸銨及牛肉膏也可以較好地為病原菌的產(chǎn)孢所利用(表5)。

表5 不同氮源對國槐枝枯病原菌GH01菌絲生長及產(chǎn)孢的影響Table 5 Effects of different N sources on mycelial growth and sporulation of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

3 討論

通過對國槐枝枯病菌的形態(tài)學(xué)特征觀察及rDNA ITS序列與EF1α、LSU這2對看家基因的序列系統(tǒng)發(fā)育分析,明確引起南疆地區(qū)國槐枝枯病的病原菌為新暗色柱節(jié)孢(N.dimidiatum)。據(jù)我們所知,這是一種之前未見報(bào)道的新病害。病原菌新暗色柱節(jié)孢是Crous等[14]在研究葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)的18個(gè)屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時(shí)重新整合建立的新種組合,近年,真菌分類學(xué)界又對該菌種的分類學(xué)地位進(jìn)行了新的界定,將原Neoscytalidium屬的3種植物病原菌N.hyalinum、N.novaehollandiae、N.orchidacearum都囊括在了新暗色柱節(jié)孢N.dimidiatum中[15]。本次分離得到的病原菌N.novaehollandiae也因此被界定為新暗色柱節(jié)孢。根據(jù)前人的研究報(bào)道,病原菌新暗色柱節(jié)孢(N.dimidiatum)的寄主范圍廣泛。它能侵染危害松樹[3]和桑樹[16],且梨樹[17]、蘋果樹[18]、山楂樹[19]、葡萄[20]和杏樹[21]也是新暗色柱節(jié)孢的易感寄主,這些寄主廣泛分布于南疆和北疆。除了這些寄主外,南疆還廣泛分布有柳樹、杏樹、核桃樹、沙棗樹和其他種類的槐樹,據(jù)我們初步觀察,柳樹、黃金槐也有類似的癥狀引起大量枝條枯死。若南疆的梨樹、蘋果樹、杏樹、核桃樹、山楂樹也會被該菌侵染,其危害巨大,因此非常有必要開展進(jìn)一步的研究。據(jù)報(bào)道,該病原菌的快速傳播已造成土耳其、伊朗等地的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2,20-21]。南疆地區(qū)的氣候條件與上述國家及地區(qū)十分相近,存在病害嚴(yán)重發(fā)生的可能。 在病原物潛在寄主范圍廣、氣候條件適宜的南疆,明確新暗色柱節(jié)孢所引起病害的致病及流行機(jī)制、寄主范圍、病害的防治措施等,對于支持該地區(qū)的果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展、減少經(jīng)濟(jì)損失十分重要。上述問題有待進(jìn)一步研究解決。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn),造成新疆南疆地區(qū)大量行道國槐枝枯、葉落甚至枯死的病原菌為新暗色柱節(jié)孢(N.dimidiatum),該病原菌在10 ～ 40 ℃均可以生長,最適生長溫度為34 ℃,相對濕度較低時(shí),分生孢子的萌發(fā)和生長速度更快。該菌株最適碳源為甘露糖,而對木糖、山梨糖的利用效果較差;最適氮源為牛肉膏、蛋白胨,而對硝態(tài)氮的利用效果較差,對尿素的利用效果最差。在實(shí)際生產(chǎn)過程中,應(yīng)加強(qiáng)苗木的管護(hù)、及時(shí)清除銷毀病枝病樹,嚴(yán)防病害的傳染以減少其造成經(jīng)濟(jì)及生態(tài)損失。