李慶會(huì) 李睿 溫曉菊 倪德江 王明樂(lè) 陳玉瓊

收稿日期：2023-12-16 ????????????修訂日期：2024-01-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31972463）

作者簡(jiǎn)介：李慶會(huì)，女，博士研究生，主要從事茶葉安全生產(chǎn)與品質(zhì)調(diào)控方面的研究。*通信作者：chenyq@mail.hzau.edu.cn

摘要：為了篩選氟脅迫條件下茶樹(shù)（Camellia sinensis）葉部用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析的內(nèi)參基因，以課題組前期篩選的低氟茶樹(shù)品種福鼎大白茶和高氟茶樹(shù)品種金觀音為試驗(yàn)材料，利用qRT-PCR技術(shù)結(jié)合geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件，分析氟脅迫條件下（0.42 mmol·L-1 NaF）8個(gè)候選內(nèi)參基因（CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC）在茶樹(shù)不同葉位（新梢和老葉）、不同脅迫時(shí)間（0、1、3、7 d）的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在氟脅迫條件下，茶樹(shù)新梢中最優(yōu)內(nèi)參基因組合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN，老葉中最優(yōu)內(nèi)參基因組合是CsPP2A和CsUBC。利用篩選得到的最優(yōu)內(nèi)參基因組合分析氟輸出蛋白基因（CsFEX）的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CsFEX在兩個(gè)茶樹(shù)品種的新梢和老葉中的表達(dá)趨勢(shì)一致，說(shuō)明篩選的內(nèi)參組合可用于氟脅迫條件下茶樹(shù)新梢和老葉中目的基因的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；氟；內(nèi)參基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1；Q52? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：1000-369X（2024）01-027-10

Selection and Validation of Internal Reference Genes for qRT-PCR Analysis under Fluoride Stress in

Camellia sinensis Leaves

LI Qinghui， LI Rui， WEN Xiaoju， NI Dejiang， WANG Mingle， CHEN Yuqiong*

National Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization of Horticultural Crops， College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China

Abstract： In order to screen the internal reference genes for quantitative real-time PCR analysis in tea leaves under fluoride stress， the low-fluoride cultivar ‘Fuding Dabaicha and the high-fluoride cultivar ‘Jinguanyin were used as experimental materials according to the fluoride evaluation results in these tea cultivars previously. The qRT-PCR technology combined with three Excel-based algorithms （geNorm， NormFinder and BestKeeper） were used to analyze the expression stabilities of eight candidate reference genes （CsACTIN， CsEF-1α， CseIF-4α， CsGAPDH， CsPP2A， CsTBP， CsTIP41 and CsUBC） in tea leaves （shoots and old leaves） under fluoride treatment （0.42 mmol·L-1 NaF） for different time periods （0， 1， 3， 7 d）. The results indicate that under fluoride stress， the optimal combination of reference genes in tea shoots was CsEF-1α， CsTIP41， CsTBP and CsACTIN and the optimal combination of reference genes in old leaves was CsPP2A and CsUBC. Moreover， to further confirm the stability of the selected reference genes， the expression levels of CsFEX in tea shoots and old leaves were analyzed using their corresponding optimal internal reference gene combinations. The expression profiles of CsFEX in tea shoots or old leaves between the two cultivars were consistent， indicating that the combinations of four and two internal reference genes were sufficient for normalizing the target gene expression in tea shoots and old leaves under fluoride stress， respectively.

Keywords： Camellia sinensis， fluoride， reference genes， quantitative real-time PCR， gene expression

氟是自然界中廣泛存在的一種非金屬元素，也是人體必需的微量元素之一。適量攝入氟可以促進(jìn)人體骨骼和牙齒的生長(zhǎng)，有利于人體健康，而長(zhǎng)期大量攝入氟，會(huì)造成氟中毒，出現(xiàn)氟斑牙和氟骨癥等[1]。茶樹(shù)（Camellia sinensis）是一種氟富集植物，對(duì)氟脅迫具有較高的耐受性[2]。茶樹(shù)的葉片是其積累氟的主要器官，新梢中的氟含量低于成熟葉，老葉中氟含量最高[3]。在自然生長(zhǎng)環(huán)境中，雖然茶樹(shù)富集氟，但鮮有茶樹(shù)受到氟毒害的報(bào)道。在水培條件下，一定濃度的氟脅迫會(huì)影響茶葉中茶多酚、氨基酸、兒茶素、芳香化合物等物質(zhì)的合成，不利于茶葉優(yōu)良品質(zhì)的形成；高濃度的氟脅迫會(huì)使茶樹(shù)生長(zhǎng)受阻，甚至死亡[4-5]。茶樹(shù)富集氟受土壤環(huán)境、茶樹(shù)基因型等多種因素影響[6]，因此，有必要研究茶樹(shù)中參與氟代謝的功能及調(diào)控基因，全面了解茶樹(shù)對(duì)氟的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和富集的分子機(jī)制，針對(duì)性地提出茶樹(shù)降氟措施，進(jìn)而提升茶葉飲用安全。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于目標(biāo)基因在轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)和定量研究[7-9]，然而，qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性受RNA質(zhì)量、引物的特異性、內(nèi)參基因的穩(wěn)定性等因素影響[10-11]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在各種條件下都能穩(wěn)定的表達(dá)，但目前常見(jiàn)的內(nèi)參基因在不同條件、不同物種、不同組織或不同發(fā)育階段的表達(dá)并非絕對(duì)穩(wěn)定[12-15]。在研究某些特定條件下的基因表達(dá)時(shí)，內(nèi)參基因選擇不合理會(huì)影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此有必要對(duì)所選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定。

茶樹(shù)中常用的內(nèi)參基因有肌動(dòng)蛋白基因（CsACTIN）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（CsEF-1α）、真核生物翻譯起始因子基因（CseIF-4α）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（CsGAPDH）、蛋白磷酸酶基因（CsPP2A）、TATA-box結(jié)合蛋白基因（CsTBP）、TIP41-like家族蛋白基因（CsTIP41）和泛素蛋白連接酶基因（CsUBC）[16-21]。已有研究表明，在茶樹(shù)不同組織中β-肌動(dòng)蛋白基因（Csβ-actin）的表達(dá)較穩(wěn)定，在不同成熟度茶樹(shù)葉片和愈傷組織中CsGAPDH基因的表達(dá)較穩(wěn)定[22]；冷害、干旱、傷害和鹽脅迫下CsGAPDH在茶樹(shù)幼葉中的表達(dá)穩(wěn)定性較好[23]；不同氮濃度和氮源處理下，CsGAPDH或Csβ-actin的表達(dá)穩(wěn)定性較好，CsGAPDH和Csβ-actin組合的表達(dá)穩(wěn)定性最好[24]。然而，尚未見(jiàn)有關(guān)氟脅迫條件下茶樹(shù)內(nèi)參基因的報(bào)道。

本研究以課題組前期篩選得到的低氟茶樹(shù)品種福鼎大白茶和高氟茶樹(shù)品種金觀音為試驗(yàn)材料，進(jìn)行氟脅迫處理（0.42 mmol·L-1 NaF），系統(tǒng)分析不同處理時(shí)間點(diǎn)（0、1、3、7 d）茶樹(shù)新梢和老葉中的8個(gè)候選內(nèi)參基因（CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC）的表達(dá)穩(wěn)定性，并利用氟輸出蛋白基因（CsFEX）驗(yàn)證所選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，以期篩選出較優(yōu)的內(nèi)參基因，為進(jìn)一步開(kāi)展茶樹(shù)響應(yīng)氟脅迫的分子生物學(xué)研究提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 茶樹(shù)材料及處理

在本課題組對(duì)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)種質(zhì)資源圃中203份茶樹(shù)材料氟含量評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，選擇低氟茶樹(shù)品種福鼎大白茶（ICR-22965）和高氟茶樹(shù)品種金觀音（ICR-23027）作為供試材料。試驗(yàn)所用茶苗為兩年生無(wú)性系扦插苗，于2021年10月購(gòu)于福建省福安市利農(nóng)茶苗專(zhuān)業(yè)合作社。茶苗用清水洗凈根部泥土后培養(yǎng)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)南湖茶園溫室大棚[晝/夜溫度為24 ℃/20 ℃，14 h光照（200 μmol·m-2·s-1），10 h黑暗，相對(duì)濕度為70%]，利用茶樹(shù)營(yíng)養(yǎng)液[25]進(jìn)行培養(yǎng)，每隔7 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，6個(gè)月后對(duì)其進(jìn)行氟脅迫（0.42 mmol·L-1 NaF）處理[26]，分別在第0、1、3、7 d采摘新梢（一芽二葉）和老葉（圖1），液氮速凍后置于–70 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)48個(gè)樣品。

1.2 總RNA的提取與第一鏈cDNA的合成

利用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（華越洋，北京）提取茶樹(shù)各樣品的總RNA，使用Bioanalyzer 2100 System（Agilent，美國(guó)）檢測(cè)RNA的濃度、純度和完整性。利用PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)茶樹(shù)中已報(bào)道的內(nèi)參基因[17，20-21]及其他物種中常用的內(nèi)參基因[27-28]，篩選出CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC等8個(gè)候選內(nèi)參基因。利用Primer PREMIER 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因的特異性定量引物（表1）。利用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（TaKaRa，大連）擴(kuò)增基因的目的片段，使用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit（OMEGA Bio-Tek，美國(guó)）回收產(chǎn)物，將其連接至pTOPO-Blunt Vector（艾德萊，北京）并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆后進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步確認(rèn)目的產(chǎn)物的正確性。引物序列合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序均委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。引物擴(kuò)增效率的計(jì)算參照張秋悅等[15]的方法。

1.4 qRT-PCR分析

參照Bestar? SybrGreen qPCR Mastermix（DBI Bioscience，上海）使用手冊(cè)，利用ABI Step One Plus? Real-Time PCR System（Applied Biosystems，美國(guó)）進(jìn)行qRT-PCR分析。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，Bestar? SybrGreen qPCR Mastermix 10.0 μL，50× ROX Reference Dye 0.4 ?L，ddH2O 7.8 μL。qRT-PCR

反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。通過(guò)熔解曲線(xiàn)檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從65 ℃緩慢升溫至95 ℃，每升溫1 ℃采集5次熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各候選內(nèi)參基因的Ct值分析其在氟脅迫條件下茶樹(shù)新梢和老葉中的表達(dá)情況。

1.5 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估

通過(guò)geNorm（version 3.4）[29]、NormFinder（version 20）[30]和BestKeeper（version 1）[31]統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證

為驗(yàn)證篩選得到的最優(yōu)內(nèi)參基因組合的穩(wěn)定性，利用不同的內(nèi)參基因組合對(duì)目的基因CsFEX的表達(dá)量進(jìn)行歸一化。利用算法[32]計(jì)算CsFEX的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照1.4章節(jié)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因引物的特異性

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，8個(gè)候選內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，說(shuō)明各候選基因的qRT-PCR引物滿(mǎn)足試驗(yàn)基本要求（圖2A）。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物均為目的片段。熔解曲線(xiàn)分析顯示，各基因的熔解曲線(xiàn)峰值重合率較高且只有單一主峰（圖2B～圖2I），表明各候選內(nèi)參基因引物的特異性較好，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.2.1 候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度

利用qRT-PCR分析了茶樹(shù)8個(gè)候選內(nèi)參基因在氟脅迫條件下的表達(dá)豐度。結(jié)果表明，候選內(nèi)參基因的Ct值分布在26.16～30.69，CsUBC的表達(dá)豐度較高，CsPP2A的表達(dá)豐度相對(duì)較低（圖3）。此外，Ct值的變化范圍可以反映基因的表達(dá)穩(wěn)定性，Ct值的變化范圍越小，基因越穩(wěn)定。由圖3可知，CsEF-1α、CsTBP和CsPP2A的表達(dá)穩(wěn)定性較高。

2.2.2 內(nèi)參基因的最佳數(shù)量

為確保qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，有時(shí)需要使用2個(gè)或2個(gè)以上內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行校正。可利用geNorm計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)因子配對(duì)變異值V來(lái)確定最適合內(nèi)參基因的數(shù)量，其中，0.15被普遍接受為臨界值；當(dāng)Vn/n+1＜0.15時(shí)，n個(gè)內(nèi)參基因已達(dá)到校正目的基因表達(dá)量的要求；反之，則需使用n+1個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正。氟脅迫條件下，在茶樹(shù)新梢中，V4/5值（0.129）最先小于0.15，表明在研究氟脅迫條件下，茶樹(shù)新梢中最佳內(nèi)參基因數(shù)是4個(gè)；在老葉中，V2/3值（0.113）小于0.15，表明最佳內(nèi)參基因數(shù)是2個(gè)（圖4）。

2.2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3個(gè)數(shù)據(jù)分析軟件來(lái)分析氟脅迫條件下候選內(nèi)參基因在茶樹(shù)新梢和老葉中的表達(dá)穩(wěn)定性。geNorm軟件分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8個(gè)內(nèi)參基因的M值均低于1.5，表明它們均具有較好的穩(wěn)定性。在新梢中，CsTBP和CsEF-1α表達(dá)穩(wěn)定性最好，其次是CsACTIN和CsGAPDH；在老葉中，CsPP2A和CsGAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最好。NormFinder軟件分析發(fā)現(xiàn)，在新梢中，CsEF-1α、CsTIP41、CsACTIN和CsTBP表達(dá)穩(wěn)定性較好；在老葉中CsTIP41和CsUBC表達(dá)穩(wěn)定性較好。BestKeeper軟件分析顯示，8個(gè)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1，表明它們具有較好的表達(dá)穩(wěn)定性。在新梢中，CseIF-4α、CsTIP41、CsEF-1α和CsTBP表達(dá)穩(wěn)定性較好；在老葉中，CsUBC和CseIF-4α表達(dá)穩(wěn)定性較好?？赡苁怯捎谲浖?duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性算法的不同，造成3種方法在穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果上存在一定差異。綜合分析顯示，新梢中最佳內(nèi)參基因組合為CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN，老葉中最佳內(nèi)參基因組合為CsPP2A和CsUBC（表2）。

2.3 最適內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

CsFEX通過(guò)外排氟離子調(diào)控茶樹(shù)對(duì)高濃度氟的耐受性，其表達(dá)量在高濃度氟條件下顯著升高[26]，因此本研究使用CsFEX來(lái)驗(yàn)證所篩選得到的內(nèi)參基因的可靠性。以穩(wěn)定性較好的CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN作為

茶樹(shù)新梢內(nèi)參基因，CsPP2A和CsUBC作為茶樹(shù)老葉內(nèi)參基因，分析CsFEX在福鼎大白茶和金觀音新梢和老葉中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsFEX在兩個(gè)品種新梢和老葉中的表達(dá)趨勢(shì)一致，表達(dá)量都是先升高后降低，在第3天達(dá)到最高值（圖5），說(shuō)明所篩選的內(nèi)參基因組合可用于檢測(cè)氟脅迫條件下茶樹(shù)新梢和老葉中目的基因的表達(dá)量。

3 討論

近年來(lái)，qRT-PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)分析，而內(nèi)參基因選擇是否合理關(guān)系到qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性[33-35]。因此，研究特定試驗(yàn)條件下基因的表達(dá)量變化時(shí)先對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行篩選具有一定的必要性。

研究發(fā)現(xiàn)，CsTBP和CsTIP41的表達(dá)量在茶樹(shù)葉片發(fā)育過(guò)程中比較穩(wěn)定[12]。本研究中，CsTBP和CsTIP41在茶樹(shù)新梢中的表達(dá)穩(wěn)定性較好，適合作為研究氟脅迫條件下茶樹(shù)新梢中基因表達(dá)的內(nèi)參基因。GAPDH是較常用的內(nèi)參基因之一，在杜梨葉片[15]、秋石斛花芽[28]、山茶不同組織或不同發(fā)育程度的花瓣中表達(dá)穩(wěn)定性較好[36]；在茶樹(shù)的冷害、干旱、鹽脅迫及不同氮濃度和氮源處理下，CsGAPDH的表達(dá)也比較穩(wěn)定[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，8個(gè)候選內(nèi)參基因中，CsGAPDH在茶樹(shù)新梢和老葉中的表達(dá)穩(wěn)定性均不是最好，這說(shuō)明氟脅迫條件下，CsGAPDH并不是最佳的內(nèi)參基因。CsEF-1α和CsACTIN在茶樹(shù)新梢中的表達(dá)穩(wěn)定性較好，在老葉中穩(wěn)定性較差；而在茶樹(shù)老葉中表達(dá)比較穩(wěn)定的CsPP2A和CsUBC在新梢中表達(dá)穩(wěn)定性較差，這說(shuō)明同一內(nèi)參基因并非在所有的情況下都有較穩(wěn)定的表達(dá)。孫美蓮等[22]研究發(fā)現(xiàn)，ACTIN和UBC等適合作為非生物脅迫研究中的內(nèi)參基因。肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞器骨架的重要組成成分，可以通過(guò)減少ACTIN的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，防止細(xì)胞凋亡，從而穩(wěn)定細(xì)胞骨架[37]；UBC是泛素蛋白酶體途徑的重要組分，識(shí)別和清除非生物脅迫下產(chǎn)生的異常蛋白[38]?；诖?，推測(cè)在氟脅迫條件下，為了減少脅迫損傷，植物體可能調(diào)動(dòng)多種基因響應(yīng)逆境脅迫，最終引起這些內(nèi)參基因的表達(dá)量變化。綜上所述，在不同的植物組織和試驗(yàn)條件下，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性存在差異，應(yīng)根據(jù)具體的試驗(yàn)條件選擇較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

本研究使用geNorm、NormFinder和BestKeeper數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氟脅迫條件下，茶樹(shù)新梢中最優(yōu)內(nèi)參基因組合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN，老葉中最優(yōu)內(nèi)參基因組合是CsPP2A和CsUBC，這為后續(xù)開(kāi)展氟脅迫條件下茶樹(shù)相關(guān)基因的研究奠定了基礎(chǔ)。

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