豆渣中多糖超聲輔酶法的提取工藝研究

張佳怡， 郎伍營，2，高薪淞，曹湘韻，趙翰童欣，趙永平

（1.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000；2.商洛學(xué)院商洛市糧食工程技術(shù)研究中心，陜西商洛 726000；3.商洛學(xué)院電子信息與電氣工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

0 引言

豆渣是豆?jié){、豆腐等豆制品在生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的具有一定營養(yǎng)價值的副產(chǎn)品，因存在豆腥味較重、易變質(zhì)，危害生態(tài)環(huán)境等問題很難被充分利用[1]。豆渣多糖作為植物多糖與大多數(shù)植物多糖一樣具有抗氧化功效和抑菌性，是一種天然活性物質(zhì)，主要結(jié)構(gòu)為豆渣多糖中的β-1,4-半乳聚糖結(jié)構(gòu)，同時因可清除自由基具有抗腫瘤功效[2-3]。豆渣中多糖的提取方法有熱水浸提法[4-6]、超聲輔助法、復(fù)合酶法[7]等，3 種方法中熱水浸提法時間過長，超聲輔助法較復(fù)合酶法提取粉質(zhì)較細(xì)膩但提取率低[7]，綜合前三者方法優(yōu)缺點(diǎn)選取超聲輔助復(fù)合酶法提取豆渣多糖，以期尋找到更高效率提取豆渣中多糖的方法，為合理利用豆渣及生產(chǎn)豆渣新產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：東北小粒黃豆，牡丹江小馮電子商務(wù)有限公司提供；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，合肥美博生物科技有限責(zé)任公司提供；酸性蛋白酶、纖維素酶、無水檸檬酸、檸檬酸鈉，均為食品級，河南萬邦化工科技有限公司提供。

儀器：智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上?，槴\試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；TDL-6 型低速冷凍離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品；DF-101D 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、YRE-2000E 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TP-313 型電子天平，丹佛儀器有限公司產(chǎn)品；X-8 型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-2500M型靜音超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；800C 型多功能粉碎機(jī)，永康市紅太陽機(jī)電有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豆渣多糖提取方法

（1）豆渣多糖的提取工藝流程。黃豆→浸泡（12 h）→打磨→過濾→烘干→取豆渣→加蒸餾水→加復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶）→加檸檬酸-檸檬酸鈉調(diào)pH 值至5→置于超聲波清洗器中→在100 ℃滅酶→過濾取濾液→濃縮→乙醇沉淀（12 h）→離心→恒溫干燥→干豆渣多糖。

（2）豆渣的前期制備。將黃豆提前清洗并浸泡12 h，以1∶10（濕黃豆∶蒸餾水）的比例將黃豆放入料理機(jī)內(nèi)打磨，加工完畢后使用濾布過濾，此時濾布上殘留物質(zhì)為豆渣，豆渣收集后于干燥箱內(nèi)60 ℃烘干5 h 至恒質(zhì)量，粉碎，于干燥處保存，備用。

（3）豆渣多糖的提取流程。取豆渣2 g 置于燒杯內(nèi)，取適量纖維素酶和酸性蛋白酶置于燒杯內(nèi)，加入適量蒸餾水，加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值至5。將燒杯置于靜音超聲波清洗器內(nèi)一定時間后取出，再于100 ℃條件下將所得溶液滅酶10 min，使用真空泵抽取濾液，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積1/5得到濃縮液，加入濃縮液3 倍體積無水乙醇于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏靜置12 h 過夜。靜置后將溶液從燒杯內(nèi)移至離心管內(nèi)，使用離心機(jī)離心（以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min），取沉淀物使用乙醇丙酮混合液進(jìn)行抽濾，得到濕豆渣多糖，將濕豆渣置于干燥箱內(nèi)于50 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，最終得到干燥的豆渣多糖。

1.2.2 豆渣提取率測定方法

根據(jù)黃群等人[8]的方法稍微修改，得到葡萄糖濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.537 1X+0.026 2，R2=0.999 8。豆渣多糖提取率的計算公式：

式中：H——豆渣的多糖提取率，%；

C——樣品溶液中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

N——樣品溶液的稀釋倍數(shù)；

V——測定體積，mL；

m——樣品的質(zhì)量，mg。

1.2.3 豆渣多糖單因素試驗(yàn)方法設(shè)計

（1）超聲功率單因素試驗(yàn)設(shè)計。稱量2 g 豆渣，固定料液比1∶25，超聲溫度60 ℃，超聲時間40 min，復(fù)合酶添加量2.5 %，復(fù)合酶比1∶1，分別以超聲功率150，175，200，225，250 W 做單因素試驗(yàn)分析，使用紫外分光光度計測量其吸光度，最終得到相關(guān)數(shù)據(jù)分析超聲功率對提取率的影響。

（2）超聲時間單因素試驗(yàn)設(shè)計。稱量2 g豆渣，固定料液比1∶25，超聲溫度60 ℃，超聲功率150 W，復(fù)合酶添加量2.5%，復(fù)合酶比1∶1，分別以超聲時間10，20，30，40，50 min 做單因素試驗(yàn)分析，使用紫外分光光度計測量其吸光度，最終得到相關(guān)數(shù)據(jù)分析超聲時間對提取率的影響。

（3）超聲溫度單因素試驗(yàn)設(shè)計。稱量2 g 豆渣，固定料液比1∶25，超聲時間40 min，超聲功率150 W，復(fù)合酶添加量2.5%，復(fù)合酶比1∶1，分別以超聲溫度40，50，60，70，80 ℃做單因素試驗(yàn)分析，使用紫外分光光度計測量其吸光度，最終得到相關(guān)數(shù)據(jù)分析超聲溫度對提取率的影響。

（4）料液比單因素試驗(yàn)設(shè)計。稱量2 g 豆渣，固定超聲溫度60 ℃，超聲時間40 min，超聲功率150 W，復(fù)合酶添加量2.5 %，復(fù)合酶比1∶1，分別以料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35做單因素試驗(yàn)分析，使用紫外分光光度計測量其吸光度，最終得到相關(guān)數(shù)據(jù)分析料液比對提取率的影響。

（5）復(fù)合酶添加量單因素試驗(yàn)設(shè)計。稱量2 g 豆渣，固定料液比1∶25，超聲溫度60 ℃，超聲時間40 min，超聲功率150 W，復(fù)合酶比1∶1，分別以復(fù)合酶添加量1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%做單因素試驗(yàn)分析，使用紫外分光光度計測量其吸光度，最終得到相關(guān)數(shù)據(jù)分析復(fù)合酶添加量對提取率的影響。

（6）復(fù)合酶組成比例單因素試驗(yàn)設(shè)計。稱量2 g豆渣，固定料液比1∶25，超聲溫度60 ℃，超聲時間40 min，超聲功率150 w，復(fù)合酶添加量2.5%，分別以復(fù)合酶組成比例1∶1，1∶2，2∶1，1∶3，3∶1（纖維素酶∶酸性蛋白酶）做單因素試驗(yàn)分析，使用紫外分光光度計測量其吸光度，最終得到相關(guān)數(shù)據(jù)分析復(fù)合酶組成比例對提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，挑選其中影響豆渣多糖提取率高的3 個因素，采用L9（34）表做三因素三水平正交試驗(yàn)[9]，根據(jù)正交表得出的極差數(shù)據(jù)分析得出最優(yōu)提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣多糖提取率單因素分析

2.1.1 超聲功率對豆渣多糖提取率的影響

超聲功率對豆渣多糖提取率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對豆渣多糖提取率的影響

由圖1 可知，當(dāng)超聲功率為225 W 時，豆渣多糖提取率最高；低于225 W 時隨著功率提高豆渣多糖提取率升高，可能是因?yàn)殡S著超聲功率的升高，其粉碎物質(zhì)的能力增強(qiáng)，物質(zhì)粉碎程度加重，物質(zhì)析出的量越多；當(dāng)超聲功率大于225 W 時提取率降低，可能是因?yàn)楫?dāng)超聲功率過高時其他雜質(zhì)被溶出，導(dǎo)致多糖提取率降低。

2.1.2 超聲時間對豆渣多糖提取率的影響

超聲時間對豆渣多糖提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對豆渣多糖提取率的影響

由圖2 可知，當(dāng)超聲時間為30 min 時，豆渣多糖提取率最高；低于30 min 時隨著時間增長豆渣多糖提取率增高，可能是因?yàn)殡S著時間增加，更多多糖被析出，使多糖濃度增高；當(dāng)超聲時間大于30 min 后豆渣多糖提取率降低，可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)時間增長，更多的雜質(zhì)溶于蒸餾水內(nèi)，降低多糖純度，導(dǎo)致多糖提取率降低。

2.1.3 超聲溫度對豆渣多糖提取率的影響

超聲溫度對豆渣多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對豆渣多糖提取率的影響

由圖3 可知，當(dāng)超聲波溫度為60 ℃時，豆渣多糖提取率最高；低于60 ℃時隨著溫度升高豆渣提取率升高，可能是由于隨著溫度升高，多糖更容易析出，豆渣多糖提取率增高；當(dāng)超聲溫度高于60 ℃時多糖提取率降低，可能是由于溫度過高導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞。

2.1.4 料液比對豆渣多糖提取率的影響

料液比對豆渣多糖提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對豆渣多糖提取率的影響

由圖4 可知，當(dāng)料液比為1∶25 時，豆渣多糖提取率最高；低于1∶25 時隨著料液比增大，豆渣多糖提取率增高，可能是隨著料液比增高，可溶于蒸餾水內(nèi)的多糖增多，使豆渣多糖提取率升高；當(dāng)料液比高于1∶25 時豆渣多糖提取率降低，可能是因?yàn)閱挝幻娣e提取出的豆渣多糖濃度降低。

2.1.5 復(fù)合酶添加量對豆渣多糖提取率的影響

復(fù)合酶添加量對豆渣多糖提取率的影響見圖5。

圖5 復(fù)合酶添加量對豆渣多糖提取率的影響

由圖5 可知，當(dāng)復(fù)合酶添加量為2.0%時，豆渣多糖提取率最高；低于2.0%時隨著復(fù)合酶添加量的增多，豆渣多糖提取率升高，可能是由于底物與復(fù)合酶充分接觸，酶分解豆渣更加徹底，導(dǎo)致豆渣多糖濃度增大；當(dāng)復(fù)合酶添加量高于2.0%時豆渣多糖提取率降低，可能是由于進(jìn)一步反應(yīng)分解出雜質(zhì)過多。

2.1.6 復(fù)合酶組成比例對豆渣多糖提取率的影響

豆渣多糖復(fù)合酶組成比例對豆渣多糖提取率的影響見表1。

表1 豆渣多糖復(fù)合酶組成比例對豆渣多糖提取率的影響

由表1 可知，復(fù)合酶最佳比例為纖維素酶∶酸性蛋白酶為3∶1，最高提取率為7.838 1%。由結(jié)果可知，纖維素酶占比高的試驗(yàn)組提取率高，酸性蛋白酶的作用較小，原因可能是纖維素酶發(fā)揮作用是水解纖維素，在豆渣中纖維素占比較大，水解纖維素較多，豆渣分解較徹底，豆渣多糖提取率較高。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計及其結(jié)果分析

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計表

根據(jù)單因素結(jié)果，影響因素選擇超聲時間、超聲功率、復(fù)合酶添加量，考查指標(biāo)是紫蘇葉多糖提取率，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)設(shè)計見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交分析試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交分析試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，超聲功率影響最大，其次為超聲時間，最后是復(fù)合酶添加量。3 種因素的極差對比空白項(xiàng)極差，除復(fù)合酶添加量以外，其他2 個因素極差均大于空白項(xiàng)極差證明因素具有可分析性，同時，由K 和K 值可得各因素最優(yōu)水平分別為A1，B2，C1，因此豆渣多糖最優(yōu)提取工藝為A1B2C1，即超聲時間25 min，超聲功率225 W，復(fù)合酶添加量2.0%。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，按最優(yōu)提取工藝進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)3 次。3 次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明優(yōu)化的提取工藝合理可行、穩(wěn)定性好。

豆渣葉多糖提取率正交試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 豆渣葉多糖提取率正交試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果/%

3 結(jié)論

以廢棄物豆渣重新利用為研究點(diǎn)，對豆渣內(nèi)有效成分多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)分析和正交試驗(yàn)分析可得出最佳提取條件為超聲功率225 W，超聲波時間25 min，超聲波溫度60 ℃，料液比1∶25，復(fù)合酶添加量2.0%，復(fù)合酶組成比例（纖維素酶∶酸性蛋白酶）為3∶1，此條件下豆渣多糖提取率為8.869 6%。

豆渣中含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)，但豆渣因多種不利因素難以直接利用，豆渣中含有豐富的易于提取的豆渣多糖，所以研究豆渣間接利用不但具有一定的經(jīng)濟(jì)價值，而且可以減少對環(huán)境的損耗[10]。豆渣多糖提取工藝的研究較多，但提取工藝條件各不相同。李銀峰等人[11]采用酸浸提法提取豆渣中多糖，最佳工藝條件為提取液pH 值3.0，料液比1∶25，提取時間1.5 h 時，提取率可達(dá)4%左右。高晶晶等人[4]使用熱水浸提法提取豆渣中多糖，提取時間為4.2 h，提取溫度為50 ℃，料液比為1∶30（g∶mL），最高提取率為6.29%。以上試驗(yàn)提取時間相對較長，而且提取率低，證明試驗(yàn)采用的工藝對豆渣多糖的提取率具有一定的優(yōu)化性。此外，傅晶依等人[7]研究超聲波輔助提取法和復(fù)合酶解提取法，2 種方法的提取率分別為6.13%和7.72%，2 種方法的提取率皆低于試驗(yàn)使用的超聲波輔酶法，且試驗(yàn)中超聲輔酶法比超聲波提取時間較短。分析其可能原因是超聲波能夠擊破自身組織，易于組織內(nèi)生物活性物質(zhì)析出，再用酶的高效選擇性，獲得的多糖產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定、活性高。為后續(xù)豆渣的廢物利用及新產(chǎn)品的研發(fā)提供了理論支撐。