老年帶狀皰疹急性期METTL3及Gal-3表達(dá)水平對帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛的預(yù)測價值

張玉林 方啟帆 趙永明 吳澤宇 楊穎

帶狀皰疹(herpes zoster, HZ)是水痘-帶狀皰疹病毒感染侵犯神經(jīng)節(jié)和皮膚引起的急性皰疹性皮膚病[1]。HZ治療后雖然皰疹已經(jīng)消失,但感覺神經(jīng)支配區(qū)疼痛可持續(xù)存在,對于持續(xù)3個月以上的疼痛即發(fā)展為帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(postherpetic neuralgia, PHN),嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量[2]。深入研究老年P(guān)HN的疾病機(jī)制,尋找能預(yù)測老年P(guān)HN發(fā)生的血清標(biāo)志物,具有重要意義。甲基轉(zhuǎn)移酶樣因子3(methyltransferase 3,METTL3)基因編碼N6甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化亞單位,參與RNA合成、成熟和翻譯等過程,與炎癥、免疫系統(tǒng)疾病等關(guān)系密切[3]。研究表明,METTL3的表達(dá)下調(diào)能夠增加脊髓神經(jīng)元中甲基胞嘧啶雙加氧酶1 mRNA的水平,導(dǎo)致炎癥疼痛時超敏反應(yīng)的發(fā)生[4]。半乳糖凝集素3(galectin-3,Gal-3)是半乳糖凝集素家族成員,能夠結(jié)合β-半乳糖苷,參與先天免疫、細(xì)胞黏附和T細(xì)胞調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程[5]。研究發(fā)現(xiàn),坐骨神經(jīng)內(nèi)的施旺細(xì)胞中Gal-3的表達(dá)升高能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤,導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[6]。本研究通過研究老年HZ病人在HZ急性期外周血METTL3、Gal-3的表達(dá)水平,探討其對PHN的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取我院自2019年1月至2022年1月期間我院診治的190例老年HZ病人作為HZ組,其中男97例,女93例,年齡60～73歲,平均年齡(65.77±3.17)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)HZ的診斷符合2018年中國醫(yī)師協(xié)會皮膚科醫(yī)師分會制定的《帶狀皰疹中國專家共識》[7];(2)年齡≥60歲,急性起病,病程<7 d;(3)病人和家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并偏頭痛等其他慢性疼痛性疾病;(2)合并獲得性免疫缺陷綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病;(3)合并精神系統(tǒng)疾病;(4)臨床資料不完整或失訪病例。另選取50例健康體檢的健康老年人為對照組,其中男26例,女24例,年齡60～72歲,平均年齡(65.16±3.23)歲,既往均無偏頭痛、自身免疫系統(tǒng)疾病等。HZ組和對照組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過(倫理批號:M2018CK021)。

1.2 研究方法

1.2.1 METTL3、Gal-3表達(dá)檢測:留取HZ組及對照組清晨空腹靜脈血5 mL于EDTA抗凝管中,平均分為2份,一份常溫下2000 r/min離心10 min收集上層,應(yīng)用ELISA法檢測Gal-3蛋白水平,步驟按照實際和說明書進(jìn)行,人Gal-3 ELISA試劑盒購自上海初態(tài)生物科技公司(貨號:CT5545)。微量紫外分光光度計Narodrop 2000購自美國賽默飛公司。另一份采用熒光定量PCR檢測外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中METTL3 mRNA水平。PBMC分離方法:將EDTA抗凝的外周血按照1∶1比例加入1×稀釋洗滌液,輕柔混勻后加入單個核細(xì)胞分離液上方(分離液:稀釋全血=1∶2),1000 r/min室溫離心30 min,吸取白膜層,即PBMC層。利用Trizol法提取PBMC中總RNA。Ficoll稀釋液和分離液購自美國Sigma公司(貨號:CAS26873-85-8)。焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后檢測總RNA濃度和純度,吸光度(OD)260/OD280比值介于1.8～2.1之間。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京索萊寶公司(貨號:RP1100)。應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測METTL3 mRNA的相對表達(dá)量。引物由上海生工公司設(shè)計合成。ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。引物序列,METTL3正向:5’-CCAGCCTCAGCATAGCACCT-3’,反向:5’-ACCCCAAGGGGAGCCATAAC-3’;GAPDH正向:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,反向:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。反應(yīng)程序:95℃ 5 min,95℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72℃延伸30 s,變性退火延伸共35個循環(huán)?？傮w系20μL:SYBR Green Premix 10μL,上下游引物各1μL,cDNA 1μL,雙蒸水7μL。采用2-ΔΔCt法計算METTL3 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.2 資料收集:收集HZ組病人的臨床資料,包括病人性別、年齡、病程、發(fā)病部位(顏面部、軀干四肢部、混合型)、發(fā)病疼痛程度、帶狀皰疹分型(頓挫型或普通型、大皰型、出血型或壞疽型)及是否接受小劑量糖皮質(zhì)激素治療。發(fā)病疼痛程度采用VAS進(jìn)行評估,分值范圍為0～10分,分?jǐn)?shù)越高表示疼痛程度越嚴(yán)重。

1.2.3 治療和隨訪分組:所有HZ病人均接受足量抗病毒藥物治療,伐昔洛韋片0.3 g/次,2次/d,連用10 d。隨訪3個月,以門診方式隨訪,當(dāng)病人局部皮疹消退,疼痛持續(xù)≥3個月,同時符合美國神經(jīng)病協(xié)會制定的PHN診斷標(biāo)準(zhǔn)[8],則診斷為PHN。根據(jù)HZ組病人隨訪3個月時是否發(fā)生PHN分為PHN組(n=44)和NPHN組(未發(fā)生PHN,n=146)。

2 結(jié)果

2.1 HZ組與對照組METTL3 mRNA、Gal-3水平比較 HZ組病人外周血PBMC中METTL3 mRNA相對表達(dá)量為(1.44±0.24),低于對照組(2.35±0.41),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.198,P<0.001)。HZ組病人血清Gal-3水平為(2.16±0.31)μg/L,高于對照組(1.02±0.27)μg/L,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=23.734,P<0.001)。

2.2 PHN組病人METTL3、Gal-3表達(dá)與VAS評分的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示,PHN組病人METTL3 mRNA與VAS評分呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.612,P<0.001),Gal-3蛋白與VAS評分呈明顯正相關(guān)(r=0.604,P<0.001)。PHN組病人METTL3 mRNA與Gal-3蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.616,P<0.001)。

2.3 影響PHN發(fā)生的單因素分析 PHN組病人在HZ急性期的VAS評分、病程及血清Gal-3水平高于NPHN組,而PBMC中METTL3 mRNA表達(dá)水平低于NPHN組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 PHN組和NPHN組病人臨床資料的比較

2.4 多因素Logistic回歸分析影響老年P(guān)HN的因素 以是否發(fā)生PHN為因變量,將表1中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo),包括METTL3 mRNA、Gal-3蛋白、VAS評分及病程為自變量,納入多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示病程、Gal-3蛋白水平是影響老年P(guān)HN發(fā)生的獨(dú)立風(fēng)險因素,METTL3 mRNA是保護(hù)因素。見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析影響老年P(guān)HN的因素

2.5 METTL3 mRNA、Gal-3蛋白對老年P(guān)HN的預(yù)測價值 METTL3 mRNA、Gal-3蛋白兩者聯(lián)合預(yù)測老年P(guān)HN的AUC為0.924,高于METTL3 mRNA、Gal-3 蛋白單項檢測(AUC=0.812、0.859),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.312,3.363,均P<0.01)。見表3。

表3 METTL3 mRNA、Gal-3蛋白對老年P(guān)HN的預(yù)測價值

3 討論

PHN是一種神經(jīng)病理性疼痛,表現(xiàn)為刀割樣、針刺樣及感覺異常等。PHN的發(fā)病率隨年齡的增加逐漸升高,60～65歲的老年HZ病人PHN的發(fā)病率約為20%,80歲以上老年病人的發(fā)病率達(dá)30%以上[9]。目前PHN的治療包括藥物治療、微創(chuàng)介入治療等,但由于老年人群是HZ的主要發(fā)病人群,常伴有基礎(chǔ)疾病、免疫功能降低、臨床抗病毒治療多有受限、神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)能力相對較差,故老年病人更易并發(fā)PHN[10]。目前認(rèn)為,PHN的發(fā)生與中樞或外周致敏、神經(jīng)炎癥反應(yīng)及機(jī)體細(xì)胞免疫功能降低等因素有關(guān)[11]。深入研究PHN發(fā)生的機(jī)制,尋找HZ急性期的血清學(xué)標(biāo)志物,有助于PHN的早期診治。

m6A是一種RNA的甲基化修飾方式,參與細(xì)胞生長、神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。研究表明,m6A修飾的異常與神經(jīng)損傷后神經(jīng)性疼痛癥狀的發(fā)生密切相關(guān)[12]。METTL3是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的“書寫者”,定位于核旁斑,參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程[13]。本研究中,老年P(guān)HN病人HZ急性期外周血PBMC中METTL3 mRNA表達(dá)降低是老年HZ病人PHN發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立風(fēng)險因素。分析其原因,可能與METTL3參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),脊髓中METTL3的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致miR-365-3p前體穩(wěn)定性降低,TNF-α、IL-6及IL-1β等促炎性細(xì)胞因子過度表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)損傷處巨噬細(xì)胞聚集,導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘和神經(jīng)性疼痛的發(fā)生[13-14]。Zhang等[15]研究報道,METTL3的表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)miR-150的表達(dá)及成熟,miR-150通過抑制腦源性神經(jīng)生長因子的表達(dá),抑制Ras-絲裂原活化蛋白激酶通路的活化,減弱腦源性神經(jīng)生長因子對神經(jīng)元損傷的修復(fù)能力,導(dǎo)致PHN的發(fā)生。本研究中,METTL3 mRNA表達(dá)與VAS評分呈負(fù)相關(guān),提示METTL3 mRNA表達(dá)降低加重病人疼痛嚴(yán)重程度。有研究顯示,脊髓神經(jīng)元中過表達(dá)METTL3能夠降低甲基胞嘧啶雙加氧酶1 mRNA中m6A修飾水平及蛋白表達(dá),減輕炎癥性疼痛及痛覺過敏等PHN癥狀[4]。提示METTL3 mRNA是評估老年P(guān)HN發(fā)生的潛在生物標(biāo)志物。

Gal-3是半乳糖凝集素家族的成員,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、炎癥免疫細(xì)胞趨化及細(xì)胞凋亡,在自身免疫性疾病、心力衰竭等疾病中發(fā)揮重要作用。本研究中,Gal-3蛋白表達(dá)升高是影響HZ病人PHN發(fā)生的獨(dú)立風(fēng)險因素,提示Gal-3蛋白是新的評估老年P(guān)HN發(fā)生的標(biāo)志物。分析其機(jī)制可能是Gal-3促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),腦組織缺血再灌注損傷能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中Gal-3表達(dá),Gal-3以自分泌或旁分泌方式結(jié)合激活小膠質(zhì)細(xì)胞表面Toll樣受體4,促進(jìn)IL-1β的分泌,導(dǎo)致神經(jīng)炎癥及神經(jīng)性疼痛的發(fā)生[16]。本研究中,血清Gal-3表達(dá)與VAS評分呈正相關(guān),表明Gal-3的表達(dá)升高加重病人疼痛程度。Takasaki等[17]發(fā)現(xiàn),在脊髓背角的F4/80陽性細(xì)胞能夠分泌產(chǎn)生Gal-3,Gal-3通過促進(jìn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的表達(dá)和磷酸化激活,加重HZ的疼痛程度。

本研究中,PHN組METTL3 mRNA與Gal-3蛋白呈負(fù)相關(guān),提示兩者在老年P(guān)HN發(fā)生過程中可能存在相互作用的關(guān)系。筆者分析,METTL3能夠通過m6A調(diào)節(jié)下游微小RNA的成熟,其表達(dá)降低導(dǎo)致微小RNA-124的表達(dá)缺失,Gal-3 mRNA穩(wěn)定性增加,Gal-3蛋白表達(dá)增加[18]。ROC曲線分析顯示,METTL3 mRNA聯(lián)合Gal-3蛋白對老年P(guān)HN的發(fā)生具有較高的預(yù)測效能,敏感度和特異度分別為80.2%和90.4%。臨床醫(yī)師可根據(jù)老年HZ病人METTL3 mRNA、Gal-3蛋白水平,對PHN發(fā)生的風(fēng)險進(jìn)行評估,對于高危病人予以早期診斷和治療,預(yù)防PHN的發(fā)生。

綜上所述,老年HZ病人外周血PBMC中METTL3 mRNA表達(dá)降低,血清Gal-3蛋白表達(dá)升高,兩者與VAS評分高度相關(guān)。METTL3 mRNA是影響老年P(guān)HN發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素,Gal-3蛋白是風(fēng)險因素,兩者聯(lián)合檢測可作為評估老年P(guān)HN發(fā)生的血清生物學(xué)指標(biāo)。本研究也存在一定的不足,如樣本量有限,有待今后設(shè)計多中心臨床試驗擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。