多指標正交試驗優(yōu)化損傷中期口服液的提取工藝*

何清華，徐 偉,2，楊云芝,2，范潤勇,2，周 茜

（1.南充市中醫(yī)醫(yī)院，四川 南充 637000；2.筋骨病中醫(yī)藥防治南充市重點實驗室，四川 南充 637000）

損傷中期合劑[1]是南充市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科常用中藥制劑。該方來源于院內臨床老專家的協(xié)定方“損傷合劑系列”之一，由陳皮、麩炒枳殼、骨碎補、黃芪等中藥組成，具有益氣活血、續(xù)筋接骨的功效，用于治療骨傷疾病中期階段。損傷中期合劑20世紀90年代初就已應用于臨床骨傷科，并于2007年經四川省食品藥品監(jiān)督管理局批準注冊為損傷中期合劑。后歷經幾次再注冊，損傷中期合劑于2022年轉為備案品種，備案號為：川藥制備字20220363000。損傷中期合劑臨床使用至今已達三十余年，療效確切。南充市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科為四川省中醫(yī)重點?？疲莻膊』颊呷藬?shù)眾多，年門診人次達15萬余人次。該方臨床骨傷患者使用率占比95%以上。由于該制劑為傳統(tǒng)合劑，藥液有效成分純度不高，且為多劑量玻璃瓶大包裝，易碎?；颊叻脮r需撬開鋁蓋分劑量服用，且服用量大。損傷中期合劑開蓋后還需冷藏保存，導致患者攜帶、服用、保存不方便。由于該制劑臨床應用較早，早期研究僅對提取質量進行了簡單的定性研究，而未進行藥物成分含量的定量研究，導致制備工藝簡單，不易判斷藥物提取質量的優(yōu)劣。因此，本研究以提取溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷4種成分含量[2-5]及收膏率為評價指標進行綜合評分，采用正交試驗設計對損傷中期口服液的提取工藝進行優(yōu)化，同時通過對處方中的多種成分含量的測定分析，篩選最佳提取工藝參數(shù)，以全面客觀地評價提取工藝的優(yōu)劣，以期為該制劑生產的高效提取提供依據。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 LCK2000型煎藥機（天津三延精密機械有限公司）；ES1035B型十萬分之一分析天平（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；G-100S型超聲波清洗器（深圳市哥能清洗設備有限公司）；SYG-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器廠）；WGL-45B型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；TD5A醫(yī)用離心機（常州市金壇高科儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 黃芪飲片（批號：220709-11）、陳皮飲片（批號：220518-21）、麩炒枳殼飲片（批號：221214-31）、骨碎補飲片（批號：220415-11）、當歸飲片（批號：220528-21）、羌活飲片（批號：230108-11）、白芍飲片（批號：220921-11）、酒川芎飲片（批號：220912-11）均購自成都吉安康藥業(yè)有限公司，經南充市中醫(yī)醫(yī)院藥學部主任中藥師楊云芝鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》[6]的要求；對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201907，純度：96.8%）、橙皮苷（批號：110721-202220，純度：97.2%）、新橙皮苷（批號：111857-201804，純度：99.4%）、柚皮苷（批號：110722-202116，純度：93.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜醇，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取方法 根據處方藥物比例稱取原料，加水煎煮提取、過濾，濃縮，離心，加純化水定容至1 000 mL的樣品溶液，備用。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 以Agilent Zorbax SB-18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以乙腈-0.2%磷酸溶液（18：82）為流動相等度洗脫；流速為1.0 mL/min，進樣量為5 μL，柱溫為25 ℃，檢測波長為283 nm。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷對照品適量，分別加甲醇溶解制成質量濃度分別為217.03、765.94、1 006.92、2 750.80 μg/mL的溶液。精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶液1 mL、柚皮苷溶液2 mL、橙皮苷溶液2 mL、新橙皮苷溶液4 mL至10 mL容量瓶中，定容至刻度，配制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷質量濃度分別為21.70、153.19、402.77、550.16μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取“2.1”項下制備的樣品溶液1 mL置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 根據處方藥物比例分別稱取缺黃芪、缺陳皮、缺麩炒枳殼、缺骨碎補的原料，按照“2.1”提取方法制備陰性溶液，再按照“2.2.3”項下方法制備缺黃芪、缺陳皮、缺麩炒枳殼、缺骨碎補的陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取供試品溶液，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷混合對照品溶液，陰性對照溶液各5 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，供試品溶液與混合對照品溶液色譜中相同的保留時間處有對應峰，陰性對照溶液無對應峰，表明該方法專屬性強。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品、供試品、陰性對照高效液相色譜圖

2.3.2 線性關系考察 取“2.2.2”項下的混合對照品溶液配置成分別含毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.36、2.71、5.43、10.85、21.70 μg/mL，橙皮苷4.79、9.57、19.15、38.30、76.60、153.19 μg/mL，新橙皮苷12.59、25.17、50.35、100.69、201.39、402.77 μg/mL，以及柚皮苷17.19、34.39、68.77、137.54、275.08、550.16 μg/mL的梯濃度，按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定分析，以質量濃度為橫坐標（X），以峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程分別為Y=0.157 8X-0.000 5（r=1.000 0），Y=0.146 2X-0.012 5（r=1.000 0），Y=0.160 9X-0.007 8（r=1.000 0），Y=0.155 7X+0.011 8（r=1.000 0），線性范圍分別為1.36～21.70 μg/mL，4.79～153.19 μg/mL，12.59～402.77 μg/mL，17.19～550.16 μg/mL，表明各成分質量濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按照“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次進行測定。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷峰面積的RSD值分別為0.21%，0.11%，0.13%，0.11%，表明該儀器的精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷峰面積的RSD值分別為0.95%，0.28%，0.25%，1.79%，表明該供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 精密吸取同一樣品溶液，分別按照“2.2.3”項下制備方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷平均質量濃度分別為3.98，30.45，69.92，94.79 μg/mL，RSD值分別為0.45%，1.12%，0.20%，0.43%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別加入一定量的混合對照品溶液，平行制備供試品溶液6份，按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷平均加樣回收率分別為97.46%，98.56%，96.90%，97.30%，RSD值分別為1.22%，1.13%，0.83%，1.41%。

2.4 評價指標 以有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量及收膏率的綜合評分為評價指標。

2.4.1 多指標綜合評分[7-9]根據中藥君、臣、佐、使的配伍原則，以及各指標在處方中的相對重要性不同，對上述各指標進行權重系數(shù)分配[10-11]，分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量0.40、橙皮苷含量0.15、新橙皮苷含量0.15、柚皮苷含量0.20、收膏率0.10。綜合得分=毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量/毛蕊異黃酮葡萄糖苷最大含量×0.40×100+橙皮苷含量/橙皮苷最大含量×0.15×100+新橙皮苷含量/新橙皮苷最大含量×0.15×100+柚皮苷含量/柚皮苷最大含量×0.20×100+收膏率/最大收膏率×0.10×100。

2.4.2 提取液收膏率的測定與計算 精密量取“2.1”項下制備的樣品溶液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿（ma）中，水浴蒸干后于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，立即稱定質量（mb），收膏率=（m為處方藥材質量，V為樣品溶液體積）[12-13]。

2.5 正交試驗優(yōu)選損傷中期口服液的最佳提取工藝

2.5.1 因素水平選擇 前期研究考察了影響提取效率的多種因素：浸泡時間、加水量、提取時間、提取次數(shù)、濃縮溫度。浸泡時間與濃縮溫度對提取效率的影響不明顯，不作為此次考察的重點。本研究主要考察了加水量、提取時間和提取次數(shù)3個因素。結果表明，隨著加水量的增加，綜合得分升高。當加水量增加到9倍以上時，綜合得分相差不明顯。因此本研究選擇了綜合得分較高的5倍、7倍、9倍加水量，得分分別為55.58分、72.07分、97.05分。提取時間考查了40 min至2.5 h時間段。本研究隨著提取時間的延長，綜合得分升高。當時間超過2 h后，隨著時間延長，綜合得分反而降低，說明在提取2 h后，隨加熱時間的延長，有效成分含量減少。因此本研究確定了1～2 h作為考查時間段，重點考察了綜合得分較高的提取時間1、1.5、2 h，得分分別為95.54分、99.52分、96.06分。本研究考查了1～5次的提取次數(shù)，隨著次數(shù)增加，綜合得分升高。當提取第4次及以上時，綜合得分變化不明顯，說明藥物溶出已趨于穩(wěn)定。4次以后的提取物占比較少，因此本研究選擇了綜合得分較高的提取次數(shù)1次、2次、3次作為重點考查，得分分別為79.86分、94.02分、99.17分。另外同時也考濾生產效率和成本，本研究最終確定了加水量為5倍、7倍、9倍3個水平，提取時間為1、1.5、2 h 3個水平，提取次數(shù)為1次、2次、3次3個水平，為正交試驗因素水平的選擇提供依據。

2.5.2 正交試驗[14-16]按處方藥物比例分別稱取藥物9份，在前期單因素試驗的基礎上，以加水量、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷含量及收膏率的綜合評分為評價指標進行L9（34）正交試驗設計，優(yōu)選損傷中期口服液的最佳提取工藝。因素水平見表1，試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設計與結果

A因素影響綜合得分，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），影響程度依次為A＞C＞B，優(yōu)選出最佳的工藝為A3B1C3，即加水量9倍，提取1 h，提取3次。

2.6 提取工藝驗證試驗 為驗證優(yōu)選提取工藝的穩(wěn)定性與合理性，需進行驗證。根據處方藥物比例稱取藥物3份，按照正交試驗優(yōu)選出的提取工藝制備供試品溶液3份，分別測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量及收膏率。（見表4）

表4 提取工藝驗證試驗結果

3批驗證試驗結果數(shù)據間無明顯差異，表明優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定可靠，重復性良好。

3 討論

根據骨折不同階段的癥狀特點，臨床常采用三期療法進行治療[17-18]。中期階段瘀血未盡，治療以益氣活血、祛瘀生新、接骨續(xù)筋為主，常使用黃芪、陳皮、骨碎補、續(xù)斷等中藥。損傷中期口服液處方由黃芪、當歸、陳皮、茯苓、麩炒枳殼、骨碎補、續(xù)斷等藥物制成，具有益氣活血、續(xù)筋接骨的功效。本試驗選取處方中具有重要治療作用的君藥與臣藥的活性成分為研究對象，代表處方藥物的綜合提取成分，對提取工藝進行考察。方中黃芪具有補氣健脾、益衛(wèi)固表之功，為君藥；陳皮可理氣健脾，燥濕化痰；麩炒枳殼具有理氣寬中、行滯消脹的功效；骨碎補具有補腎強骨、活血止痛的功效，與陳皮、麩炒枳殼共為臣藥。黃芪的活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、陳皮的活性成分橙皮苷、麩炒枳殼的活性成分新橙皮苷、麩炒枳殼與骨碎補的共同活性成分柚皮苷4種成分均為苷類化合物，都易溶于水，因此本研究采用加水煎煮提取[19-22]。中藥復方成分復雜，治療疾病時往往不是單一成分起治療作用，而是多成分多靶點協(xié)同作用。藥物的綜合提取成分為其治療作用的物質基礎。目前，多指標綜合評分法已廣泛應用于復方藥物制劑工藝的篩選。該方法通過對多個指標分配權重系數(shù)，計算綜合評分。因此，為了能更好地評價中藥處方藥物提取的綜合療效，本次試驗對多種活性成分的含量進行測定，以總提取物收膏率的綜合評分為評價指標，采用正交試驗設計，來優(yōu)選損傷中期合劑的最佳提取工藝，并進行了驗證。與早期一般的定性研究比較，該方法能更全面、更準確地評價提取工藝的優(yōu)劣。根據中藥君、臣、佐、使的配伍原則，以及各指標在處方中的相對重要性不同，本研究針對毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷4種成分和收膏率指標，劃分了權重系數(shù)，分別定為0.40、0.15、0.15、0.20、0.10。根據正交試驗及方差分析結果，優(yōu)選出的最佳提取工藝為：加水量9倍，提取1 h，提取3次。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量及收膏率數(shù)據無明顯差異，說明篩選出的提取工藝重復性好，質量穩(wěn)定，提取率高，為損傷中期口服液生產的高效提取提供了理論依據。但本次試驗只對提取工藝進行了考察，未考察不同濃縮方法、濃縮時間對成分含量的影響，后續(xù)試驗應將上述因素納入考察。