唐芳婷，王 紅，張 靚，唐 萍，李躍軍

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬省直中醫(yī)醫(yī)院，湖南 株洲 412000）

原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌（以下簡稱“肝癌”）是指原發(fā)于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管的惡性腫瘤，是肝癌的主要組織學(xué)類型，占總病例數(shù)的90%左右[1-2]。肝癌是癌癥死亡的第三大主要原因[3]。全球發(fā)病率最高的地區(qū)是亞洲和非洲，其中我國是肝病大國。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，出現(xiàn)癥狀時往往已經(jīng)屬于中晚期。這個時期治療方式主要以化療栓塞、局部消融、放療、全身化療、靶向治療、免疫治療等為主[4]。單一的治療方式療效有限，且存在一定的局限性，如不良反應(yīng)多、易產(chǎn)生耐藥性、患者經(jīng)濟負(fù)擔(dān)重等。須整合多學(xué)科優(yōu)勢，進(jìn)一步提高臨床療效，延長患者的生存時間。中醫(yī)藥在控制瘤體、減少毒副反應(yīng)、延緩復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、改善臨床癥狀、提高生存質(zhì)量、延長生存時間等方面具有一定的優(yōu)勢。

肝癌的病機演變復(fù)雜，而肝失疏泄為病機演變的中心環(huán)節(jié)[4]。肝體陰而用陽，肝主疏泄，肝主藏血。肝疏泄正常，則血行暢達(dá)，而后能滋養(yǎng)臟腑[5]。然邪毒內(nèi)侵，氣機郁滯，氣為血之帥，氣郁則血行瘀滯。《丹溪心法》言“氣血沖和，百病不生”。研究發(fā)現(xiàn)，郁金行氣作用強，姜黃祛瘀力強，故兩者合用可加強行氣祛瘀作用[6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)聯(lián)合中醫(yī)藥治療肝癌具有更高的總生存率和無進(jìn)展生存率，能提高患者的生活質(zhì)量，減少腫瘤復(fù)發(fā)。中醫(yī)藥成方藥物繁雜，目前研究難以清晰地闡述姜黃、郁金藥對治療肝癌的作用機制，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以從多成分、多靶點、多途徑揭示藥物協(xié)同作用的機制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，探討姜黃、郁金治療肝癌的作用靶點及機制，旨在為篩選治療肝癌的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 姜黃和郁金有效成分篩選及靶點的獲取 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺[9]（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別以“姜黃”“郁金”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選[10]、整理，分別得到姜黃、郁金的有效成分和潛在靶點。將獲得的共同潛在靶點名稱在UniProt數(shù)據(jù)庫[11]（https://www.uniprot.org/）中限定條件“ Reviewed”“ Homo sapiens”，從而獲得靶點的官方名稱。

1.2 肝癌相關(guān)靶點的獲取 基于GeneCards[12]（https://www.genecards.org）、OMIM[13]（https://omim.org/）、PharmGKB[14]（https://www.pharmgkb.org/）、TTD[15]（https://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank[16]（https://www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫，以“ Liver cancer”“ Hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，整理獲得肝癌的靶點。

1.3 藥對作用于肝癌的靶點篩選 將“1.2”中獲得的對應(yīng)靶點，去除重復(fù)靶點后，繪制韋恩圖，得到姜黃、郁金藥對干預(yù)肝癌的共同潛在靶點。

1.4 藥對-疾病-有效成分-靶點中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 借助Cytoscape 3.8.0[17]軟件進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建藥對-疾病-有效成分-靶點中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction，PPI）構(gòu)建及核心靶點篩選 借助STRING數(shù)據(jù)庫[18]（http://cn.string-db.org/）查看基因之間是否存在蛋白互作關(guān)系，設(shè)置物種選擇為“ Homo sapiens”，交互分?jǐn)?shù)>0.4，并去除單一蛋白，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。在Cytoscape 3.8.0軟件中使用CytoNCA插件Centralities原則里的6個維度（BC、CC、DC、EC、LAC、NC）進(jìn)行兩次打分過濾，將每個維度中大于中位值的核心靶點篩選出來。

1.6 藥物有效成分與疾病交集基因功能及通路的富集分析 利用R語言（Version 4.0.2）中的“ Bioconduct”包對有效成分和疾病交集基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析[19-21]，通過生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3個模塊對基因功能進(jìn)行分析。過濾條件：P值、Q值均≤0.05，輸出分析結(jié)果。

1.7 免疫細(xì)胞浸潤豐度分析 基于TIMER公開數(shù)據(jù)庫[22]（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）Gene模塊，對姜黃、郁金核心靶點的表達(dá)水平和不同免疫細(xì)胞浸潤豐度之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，并獲取統(tǒng)計學(xué)P值。

1.8 核心靶點在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)差異以及總生存期相關(guān)分析 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫[23]Expression DIY模塊中的Boxplot及Survival模塊中的Survival Plots，通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的肝癌樣本的表達(dá)譜，分析姜黃、郁金核心靶點在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)差異及生存曲線相關(guān)分析（P≤0.05）。

1.9 分子對接

1.9.1 配體的篩選 將獲得的藥物活性成分網(wǎng)絡(luò)按照靶點數(shù)目活性成分最多的作為配體，從PubChem數(shù)據(jù)庫[24]（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取配體對應(yīng)的2D結(jié)構(gòu)，使用ChemBio3D UItra 14.0軟件轉(zhuǎn)換為最小自由能的3D空間構(gòu)象并進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

1.9.2 靶點蛋白受體準(zhǔn)備 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點作為受體，先從Uniprot數(shù)據(jù)庫中搜索靶點對應(yīng)的蛋白名稱，然后從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）（http://www.rcsb.org/）中獲取該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PyMOL 2.5.2軟件中去除水分子和小分子配體，使用AutoDockTools 1.5.7軟件對受體進(jìn)行加氫并確定活性口袋，最后將準(zhǔn)備好的配體與受體導(dǎo)入PyMOL 2.5.2軟件進(jìn)行分子對接，獲得相互作用圖[25]。

2 結(jié)果

2.1 姜黃和郁金有效成分篩選結(jié)果 將姜黃和郁金這兩味中藥通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共初篩出18個有效成分，其中姜黃有效成分3個，郁金有效成分15個；再將有效成分潛在的作用靶點通過篩選和收集，其中姜黃潛在靶點356個，郁金潛在靶點1 370個，繼續(xù)篩選得到姜黃有效成分對應(yīng)的有效靶點41個，郁金有效成分對應(yīng)的有效靶點78個。通過在Uniprot數(shù)據(jù)庫中限定條件“ Reviewed”“ Homo sapiens”以獲取最新的注釋文件，然后將基因全稱通過Strawberry Perl轉(zhuǎn)換為基因簡稱，最終通過篩選去重后得到姜黃有效靶點35個，郁金有效靶點66個。根據(jù)OB值列舉出姜黃和郁金的有效成分。（見表1）

表1 姜黃、郁金有效成分信息表

2.2 肝癌靶點的獲取 根據(jù)“1.2”的研究方法去除重復(fù)靶點后共獲得肝癌靶點14 187個，繪制韋恩圖，不同的顏色代表不同的數(shù)據(jù)庫，數(shù)字代表靶點數(shù)，重疊部分的數(shù)字代表各數(shù)據(jù)庫間重復(fù)靶點。（見圖1）

圖1 各個數(shù)據(jù)庫肝癌疾病靶點的交集韋恩圖

2.3 藥對-疾病作用靶點的交集 將藥對-疾病的作用靶點用R 4.0.2軟件選取交集并且繪制韋恩圖，獲得交集靶點70個，綠色圈代表姜黃、郁金的靶點，粉色圈代表肝癌的靶點，數(shù)字代表其對應(yīng)部分的靶點數(shù)。（見圖2）

圖2 藥對靶點與疾病靶點的交集靶點韋恩圖

2.4 藥對-疾病-有效成分-靶點中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果共有70個節(jié)點，98條邊，6個藥物有效成分，70個相關(guān)靶點。說明姜黃、郁金藥對治療肝癌是通過這6個有效成分和70個靶點發(fā)揮作用的。節(jié)點用3種不同顏色分別表示兩種藥物的有效成分和潛在靶點，藍(lán)色節(jié)點代表靶點，粉色節(jié)點為姜黃，紫色節(jié)點為郁金。節(jié)點的大小代表與基因相連的成分的數(shù)目，節(jié)點越大表示與該基因相關(guān)的成分越多，按照度值排序，排前3的有效成分是柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇。（見圖3）

圖3 姜黃、郁金有效成分與肝癌靶基因的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及核心靶點篩選結(jié)果 圖中顯示的是蛋白互作關(guān)系，節(jié)點表示蛋白質(zhì)，節(jié)點中間是已知的該蛋白的3D結(jié)構(gòu)，連線表示功能關(guān)系，連線的粗細(xì)程度反映置信度高低。（見圖4）

圖4 姜黃、郁金與肝癌交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)核心圖

將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，按CytoNCA插件中的6個維度進(jìn)行評分，經(jīng)過中位值過濾后最終獲得7個核心靶點，即ESR1、CASP3、PTGS2、JUN、AKT1、MAPK3、CAT。（見圖5）

圖5 PPI 核心靶點篩選流程

2.6 藥物成分-疾病交集基因功能及通路的富集分析

2.6.1 GO富集分析結(jié)果 將姜黃、郁金治療肝癌的作用靶點進(jìn)行GO注釋及KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示：GO注釋中，與生物過程（biological process，BP）相關(guān)的條目共有1485個，與細(xì)胞組分（cellular component，CC）相關(guān)的條目共有87個，與分子功能（molecular function，MF）相關(guān)的條目共有133個。分別選取前10個富集最相關(guān)的條目生成條形圖。結(jié)果表明姜黃、郁金藥對治療肝癌作用涉及多個生物途徑和通路。其中BP主要涉及細(xì)胞對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、細(xì)胞對藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對有機羥基化合物運輸、細(xì)胞對類固醇激素的反應(yīng)、細(xì)胞對膜電位調(diào)節(jié)、細(xì)胞對金屬離子的響應(yīng)等方面；CC主要涉及膜筏、膜微域、膜區(qū)等方面；MF主要涉及與酰胺結(jié)合、與藥物結(jié)合、與磷酸酶結(jié)合、G蛋白-偶聯(lián)胺受體活性等方面。圖中橫坐標(biāo)表示富集數(shù)目，縱坐標(biāo)表示富集的條目。（見圖6）

圖6 姜黃、郁金治療肝癌靶基因的GO 富集分析條形圖

2.6.2 KEGG富集分析結(jié)果 如圖所示，對70個核心靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析后（P≤0.05）的通路共有163個，排序篩選出前20條通路。橫坐標(biāo)代表富集到此通路的基因數(shù)目，顏色代表q值，從藍(lán)色到紅色，表示q從小到大，富集越來越顯著。結(jié)果顯示姜黃、郁金藥對治療肝癌的機制涉及雌激素信號通路、甲狀腺激素信號通路、cAMP信號通路、VEGF信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、人類免疫缺陷病毒1型感染、乙型肝炎、丙型肝炎等。圖中橫坐標(biāo)表示富集的數(shù)目，縱坐標(biāo)表示富集的通路類別。（見圖7）圖中紅色表示姜黃、郁金對肝癌作用的靶基因。（見圖8）

圖7 姜黃、郁金治療肝癌靶基因的KEGG 通路分析條形圖

圖8 肝癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

2.7 有效成分與關(guān)鍵靶點的分子對接 通過以上結(jié)果分析顯示，柚皮素是預(yù)測靶點最多的有效成分，MAPK3、CASP3、JUN、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2是PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點，并且藥對-疾病-有效成分-靶點中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示柚皮素與MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2存在相互作用關(guān)系。因此，為進(jìn)一步研究其分子層面的相互作用位點，選取柚皮素與MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2分別作為分子對接的配體和受體。結(jié)果顯示，配體和受體對接結(jié)合能越低表示分子間結(jié)合越穩(wěn)固，交互作用可能性越高。（見表2）分子對接結(jié)果顯示，柚皮素能分別穩(wěn)定地對接到MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2的活性口袋中。（見圖9）

圖9 柚皮素與關(guān)鍵靶點分子對接作用關(guān)系圖

表2 柚皮素與關(guān)鍵靶點對接結(jié)合能 （kcal/moL）

2.8 關(guān)鍵靶點與免疫細(xì)胞浸潤豐度相關(guān)性分析 本研究基于Timer數(shù)據(jù)庫，通過對肝癌樣本的表達(dá)譜進(jìn)行分析，對關(guān)鍵靶點MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2的表達(dá)水平和不同免疫細(xì)胞浸潤豐度之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1和PTGS2的表達(dá)水平至少與兩種免疫細(xì)胞浸潤豐度相關(guān)（P≤0.05），如MAPK3、CASP3、AKT1的表達(dá)水平與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫浸潤相關(guān)；PTGS2的表達(dá)水平與肝癌腫瘤純度、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等相關(guān)；CAT的表達(dá)水平與肝癌腫瘤純度、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等相關(guān)；ESR1的表達(dá)水平與肝癌腫瘤純度、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等相關(guān)。（見圖10）

圖10 關(guān)鍵靶點表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

2.9 核心靶點在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)差異分析 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫，通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的肝癌樣本的表達(dá)譜，對關(guān)鍵靶點在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)差異分析。結(jié)果表明，MAPK3在腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織，提示該基因為癌基因；ESR1在腫瘤組織中的表達(dá)低于癌旁組織，提示該基因為抑癌基因。（見圖11）

圖11 關(guān)鍵靶點在腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)差異

2.10 核心靶點與肝癌患者總生存期相關(guān)分析 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中的肝癌腫瘤樣本的表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，MAPK3、CAT、ESR1的表達(dá)與肝癌患者的總生存期相關(guān)（P≤0.05）。MAPK3表達(dá)水平高者，預(yù)后相對較差；CAT、ESR1表達(dá)水平高者，預(yù)后相對較好。結(jié)合差異表達(dá)結(jié)果提示MAPK3為癌基因，ESR1為抑癌基因，結(jié)果與上文相符。（見圖12）

圖12 關(guān)鍵靶點表達(dá)水平在肝癌患者總生存期中的預(yù)后價值

3 討論

肝癌在中醫(yī)學(xué)中屬于“肝積”“癥瘕”“積聚”“鼓脹”“黃疸”“痞氣”“癖黃”等范疇，肝失疏泄為病機演變的中心環(huán)節(jié)。肝失疏泄則氣血運行不暢，導(dǎo)致氣滯、血瘀，從而出現(xiàn)脅痛、脅腹積塊等癥狀[4]。姜黃、郁金均可化瘀血、消食積、去腫痛，且有行氣止痛的功效。作為常用的活血化瘀藥，姜黃、郁金多用于氣血瘀滯所致癥瘕痞塊、胸脅刺痛、經(jīng)閉腹痛等癥狀?，F(xiàn)代藥理研究[26-29]表明，姜黃、郁金不僅能抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，緩解藥物性肝損傷，還能通過作用于AKT1等關(guān)鍵靶點阻止肝纖維化，調(diào)控信號通路，逆轉(zhuǎn)化療耐藥性，從而改善肝癌患者肝功能，保護肝臟，降低損害，提高免疫力。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)研究方法，分析姜黃、郁金藥對治療肝癌作用靶點。結(jié)果顯示柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等是姜黃、郁金治療肝癌的有效成分。研究[30]表明，柚皮素可上調(diào)肝癌細(xì)胞中的ULBP1、ULBP3等NKG2DL的表達(dá)，促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，增加NK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷活性，從而達(dá)到抗腫瘤作用。β-谷甾醇可以通過PI3K/AKT途徑下調(diào)細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可以減緩酒精性肝損傷[31-32]。豆甾醇可以通過PI3K/AKT/mTOR和TGFβ/S信號通路促使細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[33]。

富集分析結(jié)果提示，姜黃、郁金藥對治療肝癌通過雌激素信號通路、VEGF信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。研究[34-35]表明，雌激素通過新的雌激素受體Erα-36和雌激素相關(guān)受體γ（ERRγ）介導(dǎo)對肝癌的促進(jìn)作用，而姜黃素可以通過下調(diào)雌激素生成代謝酶，從而改善體內(nèi)高雌激素狀態(tài)。研究[36]證實，VEGFR2/AKT/mTOR通路的失活可以抑制腫瘤的進(jìn)展，減少腫瘤免疫逃逸。姜黃素可以抑制血管生成，降低VEGF的表達(dá)[37]。

基于TCGA臨床病例的分析結(jié)果，姜黃、郁金抗腫瘤關(guān)鍵靶點MAPK3在腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織，ESR1在腫瘤組織中的表達(dá)低于癌旁組織。且MAPK3表達(dá)水平高者，生存預(yù)后相對較差；ESR1表達(dá)水平高者，生存預(yù)后相對較好。結(jié)果提示MAPK3為癌基因，ESR1為抑癌基因。且分子對接結(jié)果提示，姜黃、郁金有效成分柚皮素與相應(yīng)靶點MAPK3和ESR1有結(jié)合潛能。研究結(jié)果表明，姜黃、郁金藥對可通過調(diào)控相關(guān)靶點影響腫瘤患者預(yù)后，對相關(guān)臨床研究分析具有潛在價值。

姜黃、郁金藥對可能通過調(diào)控CASP3、AKT1和CAT等靶點發(fā)揮抗腫瘤作用。CASP3可抗細(xì)胞凋亡[38]并調(diào)節(jié)血管生成。AKT激酶可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與存活等過程，參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等重要過程[39-40]。CAT是構(gòu)成氨基酸代謝的核心機制，能滿足癌細(xì)胞的代謝要求，并且有助于癌細(xì)胞適應(yīng)機體的缺氧微環(huán)境[41]。

綜上所述，姜黃、郁金藥對可通過多成分、多途徑、多靶點協(xié)同發(fā)揮治療肝癌的作用，且能通過調(diào)控相關(guān)靶點影響腫瘤患者預(yù)后，為進(jìn)一步的實驗和相關(guān)臨床研究提供了新的思路。