林凡力，彭建斐，鄧澤征，郭璐璐，姚廷山，馬皓月，馬冠華

（1西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400716；2湖南省煙草公司懷化市公司，湖南懷化 418000）

0 引言

煙草野火病(Tobacco Wildfire)是細(xì)菌性葉部病害，由丁香假單胞桿菌煙草致病變種Pseudomonas syringaepv.tabaci引起，多集中于煙草幼苗階段與大田階段發(fā)病。該病害初發(fā)生時(shí)為水浸小斑點(diǎn)，外緣有黃色暈圈，溫濕度適宜時(shí)形成無(wú)規(guī)則的褐色輪紋斑，后期病斑相連成片，形成近圓形或無(wú)規(guī)則大病斑；該病害可導(dǎo)致煙草煙葉大面積死亡或腐爛，仿佛火灼燒狀。WOLF 等[1]1917 年首次報(bào)道該病害在美國(guó)煙區(qū)發(fā)生，之后各國(guó)陸續(xù)有報(bào)道。20 世紀(jì)中期該病害在中國(guó)就有零星發(fā)生，到80年代中后期已在多個(gè)省(區(qū))大流行，并從次要病害上升為主要病害，尤其在四川、云南等產(chǎn)煙區(qū)，該病害連年發(fā)生且為害嚴(yán)重[2-6]。中國(guó)對(duì)煙草野火病研究多集中于病害流行學(xué)[7]、病菌致病性[8-9]、毒素及抗藥性[10-12]等方面。該病原菌存在生理分化現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為對(duì)長(zhǎng)花煙與黃花煙的致病性差異。云南[13]、黑龍江和吉林三省[14-15]報(bào)道過(guò)煙草野火病菌遺傳多樣性研究，分子標(biāo)記是研究真菌遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的重要手段，可有效研究病菌與地理環(huán)境或寄主之間的關(guān)聯(lián)。多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù)是近年流行的基于核酸序列測(cè)定細(xì)菌分型的方法，具有重復(fù)性強(qiáng)，分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種更準(zhǔn)確的分型系統(tǒng)方法，多應(yīng)用于人體病原細(xì)菌研究，可比對(duì)分析各菌株間顯著保守性表現(xiàn)的管家基因堿基分布改變。明晰病菌的遺傳多樣性可揭示同種病菌不同區(qū)系之間的遺傳和進(jìn)化，了解和掌握病菌遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性水平可為有效防治措施制定和品種選育提供強(qiáng)力支撐，為病菌的生物學(xué)特性研究提供新視角[13]。因此，筆者收集了湖南、重慶等5 個(gè)?。ㄊ校煵菀盎鸩【捎枚辔稽c(diǎn)序列分型技術(shù)研究煙草野火病菌菌株之間的遺傳多樣性，以期為該病害的有效防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從湖南、重慶、四川、黑龍江、吉林等5個(gè)煙草種植?。ㄊ校┎杉療煵菀盎鸩?，分離野火病菌。供試煙草品種為‘云煙87’，玉溪中煙種子有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及致病性測(cè)定病樣采用組織分離法分離病原菌[16]，純化保存?zhèn)溆?。‘云?7’煙草種子播種于滅菌土壤中，培育至3片真葉苗，移栽至無(wú)菌蛭石營(yíng)養(yǎng)缽，放置于25℃溫室光照培養(yǎng)，在煙苗5～7 片真葉期，使用注射器在葉片背面接種3.0×108cfu/mL 待測(cè)病菌菌懸液，完成柯赫氏法則證病。

1.2.2 病原菌分子鑒定按細(xì)菌DNA 快速抽提試劑盒說(shuō)明[17]，提取煙草野火病菌DNA，PCR 用細(xì)菌16srDNA常 規(guī) 引 物27F/1492R(27F： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3'，1492R： 5'-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3'[14])?？偡磻?yīng)體積為50 μL：ddH2O 37 μL，10×PCR buff 5 μL，2.5 mol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L Primer (+) 1 μL，10 μmol/L Primer(-)(10μmol/L)1μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶1μL，30 ng/μL DNA模板1μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃，預(yù)變性5 min；每一個(gè)循環(huán)為94℃變性0.5 min，60℃，退火1 min，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，PCR放置產(chǎn)物4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司測(cè)序，應(yīng)用DNA Star軟件得到16s-rDNA序列，提交至NCBI比對(duì)，進(jìn)行病原菌分子鑒定。

1.2.3 病菌遺傳多樣性 從NCBI 網(wǎng)站下載JWJF01000000 野火病菌菌株的基因組序列，找到11個(gè)管家基因的序列[18]，提交上海生工生物工程有限公司使用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR篩選較優(yōu)管家基因及退火溫度，最終優(yōu)選3 個(gè)管家基因（表1），進(jìn)行MLST分析。

表1 JWJF01000000野火病菌菌株基因組中7個(gè)管家基因的功能和引物序列

DNA提交華大基因科技股份有限公司測(cè)序后，運(yùn)用DNA Star雙向拼接并校對(duì)。應(yīng)用DANMAN軟件多序列比對(duì)管家基因PCR 產(chǎn)物的若干堿基序列，確定“菌株的序列型(ST)”；登陸http://www.eBURST.mlst.net/，應(yīng)用eBURST V3 軟件，以Gap、Pgi及Pfk基因標(biāo)準(zhǔn)，繪制供試菌株種群遺傳關(guān)系圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

共采集病樣112 份，分離獲得疑似煙草野火病菌菌株160株，菌株來(lái)源分別為四川40株，湖南20株，重慶40 株，吉林40 株，黑龍江20。按照柯赫氏法則驗(yàn)證，其中144 株為煙草野火病菌Pseudomonassyringaepv.tabaci。

2.2 病原菌分子鑒定

DNA快速抽提試劑盒提取144株菌株DNA，選擇細(xì)菌通用引物27F/1492R，PCR 擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到1 條約為600 bp 清晰條帶。測(cè)序拼接得到該部分的基因序列，序列大小為589 bp（見(jiàn)圖1）。

圖1 部分煙草野火病病原菌基因組DNA的16s-rDNA PCR擴(kuò)增

BLAST分析結(jié)果表明，144株菌株序列P.syringae(CP000075.1)和P.amygdale(CP020351.1)相似性達(dá)到99%以上，結(jié)合致病性檢測(cè)結(jié)果，分離獲得的144株菌株鑒定為煙草野火病菌P.syringaepv.tabaci。

2.3 多位點(diǎn)序列分型

2.3.1Gap基因eBURST V3 分析結(jié)果表明（參照Gap基因標(biāo)準(zhǔn)），待測(cè)煙草野火病菌株均屬于同一亞群以及ST85 這一單獨(dú)群。除了單獨(dú)的29 個(gè)ST，待測(cè)菌株構(gòu)建4 個(gè)CC，即CCl（77 個(gè)ST 組成）、CC2（10 個(gè)ST 組成）、CC3（3 個(gè)ST 組成）和CC4（2 個(gè)ST 組成）（見(jiàn)圖2）。

圖2 共享Gap基因標(biāo)準(zhǔn)下煙草野火病菌種群結(jié)構(gòu)

2.3.2Pgi基因eBURST V3分析結(jié)果表明（參照Pgi基因標(biāo)準(zhǔn)），待測(cè)煙草野火病菌株歸至亞群1～亞群5及4個(gè)單一群。亞群1包含58個(gè)ST，核心型為ST43，菌株11 株，其中吉林5 株，四川4 株，湖南2 株；亞群2 包含18 個(gè)ST，核心型為ST66，菌株5 株，其中重慶3 株，四川2株；亞群3包含4個(gè)ST；亞群4包含4個(gè)ST，均來(lái)自黑龍江；亞群5 包含2 個(gè)ST，均來(lái)自四川。4 個(gè)單一群菌株則分別來(lái)自湖南、吉林、重慶與四川。

亞群1 中的ST 構(gòu)建出CCl、CC2 這2 個(gè)同源復(fù)合體（除去ST9、ST14、ST30、ST39、ST51、ST73、ST82、ST84），其中CC2 含有3 個(gè)ST，分別為ST72、ST74 和ST76。亞群2 中的ST 形成2 個(gè)CCl、CC2（除去ST4、ST6、ST8、ST65、ST69、ST71），CC2 含有2 個(gè)ST，分別為ST17和ST64（見(jiàn)圖3）。

圖3 共享Pgi基因標(biāo)準(zhǔn)下煙草野火病菌種群結(jié)構(gòu)

2.3.3Pfk基因eBURST V3分析表明（參照Pfk基因標(biāo)準(zhǔn)），供試菌株聚集于亞群1、亞群2、亞群3、亞群4 及30 個(gè)單一群。亞群1 為CCl、亞群2 為CC2、亞群3 為CC3，而ST6、ST7、ST8、ST9等均為單一群（圖4）。

圖4 共享Pfk基因標(biāo)準(zhǔn)下煙草野火病菌種群結(jié)構(gòu)

綜合分析結(jié)果，基于Gap基因標(biāo)準(zhǔn)，供試煙草野火病菌菌株僅1 個(gè)亞群與單一群，菌株間的多態(tài)性以及差異性較?。换赑fk基因標(biāo)準(zhǔn)，由于過(guò)多單一群，亞群和單一群間的遺傳差異性也較小；而基于Pgi基因標(biāo)準(zhǔn)的分型較好，ST間的遺傳性差異較大，分為優(yōu)勢(shì)亞群1和亞群2。亞群1中核心ST型ST43為中國(guó)主要種群，來(lái)自四川、湖南、吉林。亞群2中核心ST型ST66來(lái)自四川與重慶。同一核心型菌株間不存在顯著相關(guān)性。

2.4 煙草野火病病菌分型關(guān)聯(lián)分析

對(duì)中國(guó)東北和南部片區(qū)采集病樣分離純化鑒定的煙草野火病菌進(jìn)行亞群劃分分析，結(jié)果表明南北方煙草野火病菌ST 型的差異不明顯，而亞群4 較為特殊，其包含的菌株均來(lái)自東北，推測(cè)這些菌株由同種ST型發(fā)展蔓延而來(lái)。試驗(yàn)采集的病樣來(lái)自西南地區(qū)主栽品種云煙87，東北地區(qū)主栽品種吉煙9 號(hào)和龍江911，分析發(fā)現(xiàn)，亞群1 和亞群2 的核心ST 型包含的煙草品種不同，相同ST型可能來(lái)自不同的煙草品種，而不同ST型也可能來(lái)自同一煙草品種（表2），推測(cè)煙草品種與病菌組群間無(wú)關(guān)聯(lián)性。

表2 煙草野火病菌的MLST分型關(guān)聯(lián)分析

3 結(jié)論與討論

中國(guó)主栽煙草品種多數(shù)不抗煙草野火病，該病防控較困難[18-19]。目前，選育優(yōu)質(zhì)抗野火病品種是防治該病害最有效的方法，而明確其病菌遺傳多樣性是抗病品種選育的前提[20-23]。中國(guó)各地?zé)煵菀盎鸩【鶶T型不同，同一ST 型可能會(huì)誘導(dǎo)病害大面積發(fā)生，目前因環(huán)境、人為因素等的影響，已進(jìn)化發(fā)展為不同的ST型[24]。

本試驗(yàn)中，煙草野火病菌遺傳多樣性分析的144株菌株，來(lái)自四川、重慶、湖南、吉林及黑龍江5省（市）的3 個(gè)煙草品種，地理跨度較大。Pgi基因標(biāo)準(zhǔn)條件下，供試菌株分為5個(gè)亞群和4個(gè)單一群，其中，亞群1內(nèi)的ST 型數(shù)量最多，其核心型菌株來(lái)源3 個(gè)省，菌株分布較廣，不存在區(qū)域優(yōu)勢(shì)；亞群2 內(nèi)的ST 型數(shù)量次之，其核心型菌株來(lái)自兩個(gè)省，各菌株關(guān)系松散，不在同一CC上；亞群5內(nèi)的ST型數(shù)量最少，菌株皆來(lái)自四川；而4 個(gè)單一群菌株分別來(lái)自吉林、湖南、重慶與四川4個(gè)?。ㄊ校?，結(jié)果表明，煙草野火病菌組群劃分同煙草品種不存在關(guān)聯(lián)。

以煙草野火病菌來(lái)源的地域分析，試驗(yàn)所用的供試菌株主要來(lái)自中國(guó)東北與西南，地理跨度較大，結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)亞群1 和亞群2 囊括了來(lái)自吉林、湖南、重慶、四川及黑龍江5 個(gè)區(qū)域的菌株，菌株ST 型無(wú)明顯差異。亞群分析結(jié)果表明，亞群1的核心型ST來(lái)自吉林、四川、湖南，說(shuō)明亞群1所包含的菌株分布較廣，不存在區(qū)域優(yōu)勢(shì)；亞群2 核心型ST 源于四川和重慶，但亞群內(nèi)各菌株關(guān)系松散，不在同一CC 上；亞群4 的所有ST型菌株均來(lái)自東北。

煙草品種來(lái)看，亞群1 和亞群2 的核心ST 型來(lái)源的煙草品種不同，表明相同ST型可來(lái)自不同的煙草品種，不同ST 型也可能存在于相同煙草品種，說(shuō)明煙草野火病菌組群劃分同煙草品種不存在相關(guān)性。陳赟娟等[25]結(jié)果表明，煙草野火病菌群體致病性存在差異，來(lái)源地也不同，兩者之間無(wú)關(guān)聯(lián)性。劉雅婷等[13]發(fā)現(xiàn)，云南煙草野火病菌群體遺傳多樣性突出。夏緯躍等[26]發(fā)現(xiàn)，吉林省轄區(qū)內(nèi)70株煙草野火病菌在區(qū)域上的遺傳多態(tài)性豐富。本試驗(yàn)研究結(jié)果與之類似，供試煙草野火病菌存在豐富的遺傳多樣性。