傅立強(qiáng) 桑列勇 王琴 余波 張凱君 趙逸祥 吳和晉

(1.紹興市中心血站，浙江 紹興 312000；2.浙江普施康生物科技有限公司)

根據(jù)我國采供血機(jī)構(gòu)相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)要求，血 站必須在獻(xiàn)血者獻(xiàn)血前對其進(jìn)行血紅蛋白(Hb)檢測[1]，同時血站可以根據(jù)實際情況增加丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)等檢測項目[2]，以保障獻(xiàn)血者健康和減少血液報廢率。 目前在采供血機(jī)構(gòu)，獻(xiàn)血前Hb與ALT 檢測方法多樣，Hb 檢測主要是硫酸銅比重法(定性)和Hb 檢測儀法(定量)[3]，ALT 檢測為干化學(xué)法與速率法[3-4]，2 個項目多不是聯(lián)合檢測因此會降低整體篩選的效率。 基于此類現(xiàn)狀，尋找快速、便捷、準(zhǔn)確并能同時進(jìn)行Hb/ALT 等項目聯(lián)合檢測的設(shè)備與方法顯得很有必要。 微流控盤片技術(shù)，始于20 世紀(jì)90 年代，由Manz 等[5]首創(chuàng)，他們成功利用這項技術(shù)進(jìn)行了體外細(xì)胞的電泳分離，1995 年，美國國防部推出了便攜式士兵生化自檢設(shè)備計劃，此舉引起了國際社會對微流控盤片的關(guān)注。 此后，越來越多的專家學(xué)者開始認(rèn)為微流控盤片是分析化學(xué)的理想平臺，并將其稱為“微型全分析系統(tǒng)”(μTAS)[6-7]。 微流控盤片將傳統(tǒng)實驗室中的標(biāo)本制備、反應(yīng)、分離、檢測等所有操作步驟都集中于1 個盤片上[8]，微小化同時帶來減少標(biāo)本或試劑用量的優(yōu)點、具有較低制造成本和較小體積且方便攜帶、在1 個盤片上同時進(jìn)行多個平行檢測，易于集成，目前已經(jīng)成為分析學(xué)科最活躍的發(fā)展前沿，代表著未來分析儀器走向微型化、集成化的發(fā)展方向[9]。 離心微流控技術(shù)為其中的分支之一，除了具有微流控技術(shù)的優(yōu)點之外，不須外加泵只需要單一馬達(dá)即可驅(qū)動流體、在盤片上可自動快速全血分離也是該技術(shù)獨特優(yōu)點。 本站與合作單位基于離心微流控技術(shù)，通過對試劑凍干、光學(xué)比色等技術(shù)進(jìn)行整合，共同開發(fā)了1 套針對Hb 與ALT 項目進(jìn)行同步、快速檢測的系統(tǒng)設(shè)備——MS200 生化分析儀與配套的ALT/Hb 檢測凍干試劑盤(微流控盤片＋凍干微球試劑)，并開始試用于獻(xiàn)血前篩查。為評價其檢測穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、應(yīng)用價值與前景，我們已經(jīng)進(jìn)行了精密度與準(zhǔn)確度的驗證，并與其他設(shè)備進(jìn)行了比較，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

本研究納入的標(biāo)本均在2023 年8—10 月采集。 獻(xiàn)血者標(biāo)本:1 189 份指尖末梢血標(biāo)本(150 μL/份)；1 040 份初篩合格并成功獻(xiàn)血留取的EDTA 抗凝全血常規(guī)標(biāo)本(血袋旁路留樣，5 mL/份)；對5 名ALT＞50 U/L 的獻(xiàn)血者與5 名Hb＜115 g/L的獻(xiàn)血者，征得本人同意后，每人各采EDTA 抗凝全血試驗標(biāo)本1 份(5 mL/份)，共10 份；102 份單采血小板獻(xiàn)血者EDTA 抗凝全血常規(guī)標(biāo)本(5 mL/份)。患者標(biāo)本:20 份ALT 異常[(51 ～470) U/L] EDTA抗凝全血標(biāo)本，20 份Hb 異常[(52 ～115、161 ～185) g/L]EDTA 抗凝全血標(biāo)本，所有患者標(biāo)本由紹興市上虞中醫(yī)院提供；自制質(zhì)控品[從1 040 份獻(xiàn)全血常規(guī)標(biāo)本與102 份獻(xiàn)單采血小板常規(guī)標(biāo)本中挑取ALT(40 ～50)U/L、Hb(120 ～130)g/L 的標(biāo)本作為自制質(zhì)控品，有效期1 周]。

1.2 試劑與儀器

ALT/Hb 檢測凍干試劑盤(常德普施康公司，批號:202305099—202306002)；ALT 檢測試劑盒(貝克曼庫爾特公司，批號:AUZ0960)；Hb 檢測試劑片(HemoCue AB 公司，批號:2203194)；血細(xì)胞分析用溶血劑FFD-201A(Sysmex 公司，批號:A3009)與SLS-211A(Sysmex 公司，批號:A3022)，血細(xì)胞分析用稀釋液PK-30L(Sysmex 公司，批號:G3024)；生化多項定值質(zhì)控品(中生北控公司，批號210161)；MS200 生化分析儀(浙江普施康公司)；AU480 全自動生化分析儀(貝克曼庫爾特公司)；Hb201 分析儀(HemoCue 公司)；XS-900i 血細(xì)胞分析儀(Sysmex 公司)。

1.3 方法

1.3.1微流控盤片檢測系統(tǒng)原理

MS200 生化分析儀包含3 個主要部分:控制單元、檢測單元和管理單元。 控制單元的功能是控制直流無刷電機(jī)，實現(xiàn)加速、減速及轉(zhuǎn)向，為微流控盤片提供離心驅(qū)動力用以離心標(biāo)本，同時精確控制標(biāo)本在管路系統(tǒng)中的流動。 檢測單元中的光源發(fā)出340 nm、546 nm 等波長的光線，光線穿過微流控盤片的反應(yīng)孔，并經(jīng)過分光和濾光處理后被光檢測器捕獲。 這些光信號經(jīng)過處理后，管理單元根據(jù)朗伯-比爾定律，分析標(biāo)本在紫外光和可見光區(qū)域的吸收光譜，通過光譜數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對，得出標(biāo)本中的ALT 和Hb 濃度，檢測只需向標(biāo)本加樣孔加入45 μL 全血標(biāo)本即可啟動，但需5 min 后才能出結(jié)果。 整個系統(tǒng)的核心是ALT/Hb 檢測凍干試劑盤:它是1 種微型化的離心反應(yīng)器，形狀半圓，厚0.5 cm，半徑4 cm，由2 層結(jié)構(gòu)構(gòu)成:上層是刻有微流道的聚甲基丙烯酸甲酯盤片，下層是壓力敏感膠來貼合并封閉微流道。 試劑通過凍干微球技術(shù)制作成球狀顆粒并預(yù)置在盤片內(nèi)，標(biāo)本與這些凍干球接觸時，能迅速復(fù)溶并反應(yīng)，見圖1。

圖1 微流控盤片F(xiàn)igure 1 Microfluidic disc

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.3.2.1測試方法

用MS200 生化分析儀進(jìn)行全流程模式測試，測試標(biāo)本為純化水和企業(yè)參考品，參考品各個濃度值重復(fù)測試3 次取均值。

1.3.2.2KB 值標(biāo)定方法

1.3.2.2.1ALT

斜率計算公式:吸光度＝log10(參比/檢測)，斜率(K)＝(A2-A1)/(t2-t1)。 其中:A1 為第1 個時間點t1 讀取的吸光度，A2 為第2 個時間點t2 讀取的吸光度，2 個時間點選擇跟項目相關(guān)。 ALT 項目中t1 為第5 個采樣點，即第20 s，t2 為第15 個采樣點，即第60 s。 將相關(guān)數(shù)值代入公式計算，得到斜率K1、K2。 以斜率為X 軸，濃度[企業(yè)參考品溯源至GBW(E)090164 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)]為Y 軸進(jìn)行線性擬合，得到1 條y ＝kx＋b 的定標(biāo)曲線。

1.3.2.2.2Hb

終點法計算公式:吸光度＝log10(參比/檢測)，終點訊號值(B)＝A15，即第60 s 讀取的吸光度，儀器15 次采樣下的吸光度分別為A1—A15。 分別計算2 個濃度測試結(jié)果得到B1、B2。 以吸光度為X軸，濃度(企業(yè)參考品溯源至HiCN 法定值的新鮮血)為Y 軸進(jìn)行線性擬合，得到1 條y ＝kx＋b 的定標(biāo)曲線。

1.3.3檢測方法

1.3.3.1質(zhì)量控制設(shè)備使用前用自制質(zhì)控品進(jìn)行檢測，并繪制質(zhì)控圖，只有檢測值在控(檢測值在±2SD 內(nèi))才可開展日常檢測。

1.3.3.2檢測值覆蓋范圍

ALT:(5～470)U/L；Hb:(52～185)g/L。

1.3.3.3精密度、準(zhǔn)確度估計及判定標(biāo)準(zhǔn)

從1 040 份獻(xiàn)血者全血常規(guī)標(biāo)本中選取經(jīng)XS-900i 血細(xì)胞分析儀3 次測定，Hb 均值(靶值)分別為118 g/L 和152 g/L 的2 份標(biāo)本做Hb 檢測；從1 040份獻(xiàn)血者全血常規(guī)標(biāo)本中選取經(jīng)AU480 生化分析儀測定3 次，ALT 均值(靶值)為48.0 U/L 的1份標(biāo)本，外加1 份已知ALT 值的高值質(zhì)控品進(jìn)行ALT 檢測。 批內(nèi)精密度試驗:用MS200 生化分析儀1 d 內(nèi)連續(xù)檢測上述標(biāo)本各10 次，計算±s和CV；批間精密度試驗:每天用MS200 生化分析儀檢測上述4 個標(biāo)本2 次，連續(xù)5 d，計算±s和CV。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[10-11]:批內(nèi)CV，Hb≤1.5%、ALT＜5.0%，批間CV，Hb≤2.0%、ALT＜6.7%；準(zhǔn)確度試驗:用MS200 生化分析儀連續(xù)檢測上述4 個標(biāo)本各3 次，計算值并與靶值比較，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[10-11]:相對偏倚Hb≤2.5%、ALT＜10.0%。

1.3.3.4MS200 生化分析儀與其他檢測系統(tǒng)的比較

先用Hb201 分析儀對1 189 份獻(xiàn)血者指尖末梢血標(biāo)本進(jìn)行Hb 檢測(專用試劑片自動吸取標(biāo)本約10 μL)，再用MS200 生化分析儀對1 189 份獻(xiàn)血者指尖末梢血標(biāo)本進(jìn)行Hb/ALT 同步檢測(用移液器吸取標(biāo)本45 μL 注入微流控盤片標(biāo)本加樣孔)，Hb 檢測值以Hb201 分析儀的結(jié)果為準(zhǔn)；用MS200生化分析儀對20 份ALT 異?；颊邩?biāo)本、20 份Hb異?；颊邩?biāo)本進(jìn)行檢測；用AU480 生化分析儀對1 040份獻(xiàn)血者全血常規(guī)標(biāo)本、5 份ALT＞50 U/L 全血試驗標(biāo)本、20 份ALT 異?；颊邩?biāo)本(合計1 065份標(biāo)本)進(jìn)行ALT 檢測，并與MS200 生化分析儀的ALT 檢測結(jié)果進(jìn)行比較；用XS-900i 血細(xì)胞分析儀對1 040 份全血常規(guī)標(biāo)本中的40 份標(biāo)本、5 份Hb＜115 g/L 全血試驗標(biāo)本、20 份Hb 異常患者標(biāo)本(合計65 份標(biāo)本)進(jìn)行Hb 檢測，并與MS200 生化分析儀的Hb 檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.3.52 檢測項目間干擾驗證

從5 份ALT ＞50 U/L 全血試驗標(biāo)本中選取AU480 生化分析儀ALT 檢測值分別為62.5 U/L、117.0 U/L 的標(biāo)本各1 份，用XS-900i 血細(xì)胞分析儀檢測其Hb 值并與MS200 生化分析儀檢測值比較，相對偏倚≤2.5%為無干擾。 從Hb 異?；颊邩?biāo)本中選取ALT 值為30 ～50 U/L 且XS-900i 血細(xì)胞分析儀Hb 檢測值分別為84 g/L、172 g/L 的標(biāo)本各1 份，用AU480 生化儀檢測其ALT 值并與MS200 生化分析儀檢測值比較，相對偏倚＜10.0%為無干擾。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用Minitab15.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，相關(guān)性采用線性回歸分析，計數(shù)資料用百分比(%)表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hb 檢測結(jié)果

2.1.1精密度與準(zhǔn)確度測定結(jié)果

精密度測定結(jié)果見表1，2 個標(biāo)本均為批內(nèi)CV≤1.5%，批間CV≤2.0%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求；準(zhǔn)確度測定結(jié)果見表2，2 個標(biāo)本與靶值的相對偏倚均≤2.5%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

表1 Hb 檢測精密度測定結(jié)果Table 1 Precision test result of Hb detection

表2 Hb 檢測準(zhǔn)確度測定結(jié)果Table 2 Accuracy test result of Hb detection

2.1.2與其他檢測系統(tǒng)的比較結(jié)果

1 189 份獻(xiàn)血者指尖末梢血標(biāo)本，Hb201 生化分析儀與MS200 生化分析儀Hb 檢測不合格率分別為2.69%(32/1 189)與2.78%(33/1 189)，其中31 份標(biāo)本2 者結(jié)果均為不合格，2 者結(jié)果比較無差異(χ2＝0.016，P＜0.05)；65 份標(biāo)本MS200 生化分析儀與XS-900i 血細(xì)胞分析儀檢測結(jié)果相關(guān)性分析顯示2 者呈正相關(guān)，Y ＝0.983X ＋2.788(R2＝0.986，P＝0.000)，見圖2。

圖2 MS200 與XS-900i Hb 檢測結(jié)果擬合圖Figure 2 Fitting diagram of Hb detection results for MS200 and XS-900i

2.2 ALT 檢測結(jié)果

2.2.1精密度與準(zhǔn)確度測定結(jié)果

精密度測定結(jié)果見表3，2 個標(biāo)本均為批內(nèi)CV＜5.0%，批間CV＜6.7%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求；準(zhǔn)確度測定結(jié)果見表4，2 個標(biāo)本與靶值的相對偏倚均＜10.0%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 ALT 檢測精密度測定結(jié)果Table 3 Precision test result of ALT detection

表4 ALT 檢測準(zhǔn)確度測定結(jié)果Table 4 Accuracy test result of ALT detection

2.2.2與其他檢測系統(tǒng)的比較結(jié)果

1 065 份標(biāo)本MS200 生化分析儀與AU480 生化分析儀ALT 檢測全部結(jié)果相關(guān)性分析顯示2 者呈正 相關(guān)，Y ＝0.975X ＋0.887(R2＝0.965，P＝0.000)，見圖3；其中AU480 生化分析儀ALT 檢測值為30～80 U/L 的210 份標(biāo)本2 設(shè)備檢測結(jié)果相關(guān)性分析顯示其2 者呈正相關(guān)，Y ＝0.904X＋3.232(R2＝0.825，P＝0.000)，見圖4。

圖3 MS200 與AU480 ALT 檢測全部結(jié)果擬合圖Figure 3 Fitting diagram of all ALT detection results for MS200 and AU480

圖4 MS200 與AU480 ALT(30～80 U/L)標(biāo)本檢測結(jié)果擬合圖Figure 4 Fitting diagram of ALT (30—80 U/L) sample detection results for MS200 and AU480

2.3 2 項目間干擾驗證

2 份ALT 高值標(biāo)本2 種設(shè)備Hb 檢測值分別為135 g/L 與134 g/L、147 g/L 與149 g/L，偏倚均≤2.5%，ALT 高值標(biāo)本對Hb 的檢測無干擾。 2 份Hb值異常標(biāo)本2 種設(shè)備ALT 檢測值分別為35.6 U/L與36.4 U/L、43.5 U/L 與44.7 U/L，偏倚均＜10.0%，Hb 值異常標(biāo)本對ALT 的檢測無干擾。

3 討論

檢測方法的確認(rèn)是證實1 種在實驗室使用的方法(檢驗標(biāo)準(zhǔn))適用性的過程。 對檢測方法的確認(rèn)要盡可能全面，并通過客觀證據(jù)(以性能特征形式)證實滿足檢測預(yù)期用途的特定要求[12]。 方法確認(rèn)是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的前提。 對性能指標(biāo)進(jìn)行驗證，并與其他檢測系統(tǒng)的比較，可以獲得該方法能夠得到準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測結(jié)果的證據(jù)。 精密度是多次獨立重復(fù)檢測結(jié)果之間的一致性，反映測量結(jié)果的可重復(fù)性，包括批內(nèi)精密度和批間精密度。準(zhǔn)確度是多次檢測結(jié)果的平均值和靶值間的接近程度，以偏倚為評價指標(biāo)。 MS200 生化分析儀Hb/ALT 檢測批內(nèi)和批間精密度變異系數(shù)、與靶值的相對偏倚均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，表明其檢測Hb/ALT 精密度高，重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，達(dá)到質(zhì)量要求。

Hb 檢測可以用于更準(zhǔn)確地評估獻(xiàn)血量和降低獻(xiàn)血不良反應(yīng)的發(fā)生機(jī)率，從而更好地保護(hù)獻(xiàn)血者的健康[13-14]，因此開展Hb 定量檢測非常必要。ALT 作為輸血傳播疾病的1 項非特異性檢測指標(biāo)，由于其受非病理性因素、季節(jié)性變化和性別生理等因素影響，ALT 異常在正常獻(xiàn)血人群中比例較高，這也是造成血液報廢的主要原因[15-16]，做好獻(xiàn)血前ALT 篩查非常重要。 MS200 生化分析儀的Hb 檢測結(jié)果與Hb201 分析儀檢測結(jié)果高度一致(Hb201分析儀的檢測準(zhǔn)確性已得到多方驗證[17-18])，與XS-900i 血細(xì)胞分析儀檢測結(jié)果呈正相關(guān)；MS200生化分析儀的ALT 檢測結(jié)果與AU480 生化分析儀檢測結(jié)果呈正相關(guān)；MS200 生化分析儀的Hb/ALT檢測中，ALT 高值標(biāo)本對Hb 的檢測結(jié)果、Hb 值異常標(biāo)本對ALT 檢測結(jié)果均不產(chǎn)生影響，2 項目間檢測無干擾。 本研究結(jié)果顯示基于微流控技術(shù)的檢測系統(tǒng)在性能上已經(jīng)和常規(guī)使用的其他檢測系統(tǒng)不相上下。

總之，MS200 生化分析儀及其配套試劑作為基于微流控技術(shù)，專門用于獻(xiàn)血者獻(xiàn)血前檢測的便攜式初篩設(shè)備，有較多優(yōu)點，比如標(biāo)本無需離心且用量小、操作簡便、自動化程度高、可實現(xiàn)Hb/ALT 聯(lián)合檢測、無廢液產(chǎn)生等；但也存在一些不足，比如檢測時間相對于其他設(shè)備偏長。 我們會進(jìn)一步提升設(shè)備檢測盤位數(shù)，通過通道增加來縮短檢測時間，加強(qiáng)工作人員使用和設(shè)備的磨合，進(jìn)一步提升檢測穩(wěn)定性。